Öğrenme ve Bellek Tedrisi Olan Drosophila Kurbanlığı İklimlendirme

Özet

Bu protokol, kur şartlama denilen bir Drosophila öğrenme ve bellek deneyi tanımlar. Bu klasik tahlil, resepsiyona açık olmayan prematüre bir kadının cinsel reddetmesinden sonra erkek kovuşturma davranışının azaltılmasına dayanmaktadır. Davranışsal esnekliğin bu doğal biçimi, öğrenmeyi, kısa vadeli belleği ve uzun süreli belleği test etmek için kullanılabilir.

Özet

Öğrenme ve hafızanın altında yatan moleküler mekanizmalara dair pek çok anlayış, meyve sineği, Drosophila melanogaster gibi model organizmalarda basit davranışsal tahliller kullanılarak aydınlatılmıştır . Drosophila , zihinsel engellilik (ID) ve otizm gibi insan bilişsel bozukluklarıyla ilişkili genlerdeki mutasyonlardan kaynaklanan kognitif defisitlerin altında yatan temel nevrobiyolojiyi anlamada kullanışlıdır. Bu eser, kur yapma koşulları olarak bilinen Drosophila'da klasik bir paradigmayı kullanarak öğrenme ve hafızayı test etmeye yönelik bir metodoloji anlatıyor. Erkek, kolayca fark edilebilen farklı davranış modelleri kullanarak kadınları mahkemeye gönderir. Prematüre dişiler çiftleşmeye karşı değildir ve erkeklerin kopyalanma girişimlerini reddedecektir. Bu reddetme karşısında, erkek sinekleri kur davranışlarını azaltmaktadır. Kur-ötesi davranışında azalmanın öğrendiği öğrenme ve hafızanın bir göstergesi olarak görev yapan, zaman içerisinde ölçülür. Temel numeBu tahlilin rical çıktısı, bir erkeğin 10 dakikalık bir süre boyunca dövüşerek geçirdiği süre yüzdesi olarak tanımlanan kurluk endeksidir (CI). Öğrenme indeksi (LI), öncül bir kadına maruz kalan sineklerdeki CI'nin, naif sineklere kıyasla önceki sosyal karşılaşmalar olmaksızın göreli azalmasıdır. Genotipler arasındaki LI'lerin istatistiksel karşılaştırması için, önyüklemeli bir randomizasyon testi kullanılır. Testin, öğrenme ve hafızayla ilgili bir genin rolünü belirlemek için nasıl kullanılabileceğini göstermek için burada Dihidroksiaseton fosfat açiltransferazın ( Dhap-at ) pan-nöronal knockdown'u karakterize edildi . Dhap-at , glisero-nosfosfat O-açiltransferaz ( GNPT ) insan ortologu, ciddi ID ile karakterize edilen otozomal resesif geçiş sendromu olan rhizomelik kondrodisplazi punktata tip 2'de yer alır. Kurum koşullama analizini kullanarak, uzun süreli bellek için Dhap-at'ın gerekli olduğu, ancakkısa süreli hafıza. Bu sonuç, altta yatan moleküler mekanizmaların daha fazla araştırılması için bir temel oluşturmaktadır.

Giriş

Öğrenme ve hafızanın altında yatan moleküler mekanizmalar birçok türde korunmaktadır. Koku alma ve hafızadaki kusurlar için Drosophila melanogaster mutant hatlarını öncü çalışma taraması, öğrenme ve hafızanın altında yatan süreçlere temel moleküler anlayışlar sağlamıştır ¹ . Bu çalışmalar rutabaga ² , amnesiak ³ ve dunce ⁴ gibi öğrenme ve hafıza ile ilgili ilk genlerden bazılarını saptadılar ve siklik adenosin monofosfat (cAMP) sinyal verme kritik rolünü ortaya koydu5.

Hafıza mutantları için erken genetik ekranlar öncelikle koku alma sistemi kullanılarak gerçekleştirildi. Bununla birlikte, öğrenme ve hafızanın diğer biçimlerini ölçmek için çeşitli yöntemler zamanla ortaya çıkmıştır. En yaygın kullanılan öğrenme ve bellek paradigmalarından biri ve burada açıklanan tahlil, c olarak bilinirIlk olarak Siegel ve Salon ⁶ tarafından tanımlanan ve daha sonra birkaç diğer araştırma grubu ^{7 , 8 , 9} tarafından rafine edildi. Courtship condition, kadın karnında erkek tarafından copülasyon sırasında bırakılan spesifik bir feromon, cis- vaccenyl acetate (cVA) varlığına bağlıdır. Kadın karnındaki cVA'yı algılama, kurban davranışını doğal olarak düşürür ve kadın tarafından reddetme eylemiyle birleşince cVA'nın erkek kurban azaltma üzerindeki etkisi çarpıcı bir şekilde artırılır. Bu tahlilde erkek sineklerin cevabı, kadına yönelip onları takip ederek, kanadı vurarak, uzatarak ve titreşerek, yalamayla ve kopülasyon denemesiyle karakterize edilen farklı kur davranışlarını gözlemleyerek kolaylıkla nicelleştirilebilir ¹⁰ ( Şekil 1A ). Erkek sinekler distinguis öğrenirler. H, cinsel reddedildikten sonra 9 gün ^8'e kadar resepsiyona açık olmayan dişilere yönelik kur davranışlarını azaltır. Bu doğal davranış, öğrenmenin altında yatan mekanizmaları, kısa süreli hafızayı (STM) ve uzun süreli hafızayı (LTM) aydınlatmak için kullanılabilir 8,9,12. Öğrenme, eğitim süresince ortaya çıkan kur davranışında derhal azalma olarak tanımlanır ve çiftleşmiş bir kadına ^{6 , 8} maruz kaldıktan sonra 0 - 30 dakika ölçülen anında hatırlama belleği olarak adlandırılır. STM, antreman sonrası 30 dakika ile 1 saat arasında ölçülürken, LTM en sık antreman 24 saat sonra ölçülür ( Şekil 1B ). STM, 1 saatlik bir eğitim periyodu kullanılarak indüklenebilir, ancak 2-3 saat sürerS = "xref"> 6 ^{, 8} . Çoğu öğrenme paradigmasında, LTM yalnızca aralıklı tekrarlanan eğitimlerle tetiklenebilir. Mcbride ve ark . (1999) ⁸ , aralıksız, 1 saatlik egzersiz seanslarının, 1 saatlik bir eğitim seansının neden olduğu 2-3 saatin aksine, 9 güne kadar sürecek kur ilkesi uygulamak için yeterli olduğunu gösterdi. McBride ve ark . ⁸ , tek bir 5 saatlik eğitim oturumunun 9 güne kadar benzer bir LTM yanıtı verdiğini de gösterdi. Sinekler, bu 5 saatlik sürede sürekli mahkemeye çıkmazlar, aslında tek bir eğitim oturumunda LTM'yi teşvik etmek için kendi aralıklı eğitimlerini üretirler. Bu, LTM'yi araştırmak için bu tahlildeki kolaylığı artırarak, pratik bir perspektiften çok önemlidir. Mevcut protokoller ağırlıklı olarak LTM ^{11 , 12} için 7 saatlik tek bir eğitim oturumu kullanır. Çeşitli çalışmalar çeşitli araştırmalar yapmıştır.Kurban öğrenmesinin farklı yönlerinde belirli kusurlara sahip mutant koşullar. Örneğin, mantar vücut ablasyonu STM'yi ve LTM'yi etkiler, ancak öğrenmeyebilir8. Olfaktif kondisyonlama 3'ü kullanarak belleğin spesifik bir regülatörü olarak tanımlanan amnesiak genindeki mutasyonlar STM'yi etkiler ancak öğrenmeyi etkilemez ⁶ . Çeviri regülatörü orb2'nin (oo18 RNA-bağlama (orb) CPEB2 alt ailesi) bozunması ve ekdison sinyali sadece LTM ^{9 , 13'ü} etkiler. Böylece, kur şartlama, öğrenmenin ve hafızanın farklı aşamalarının altında yatan mekanizmaları incelemek için yararlı bir paradigmadır.

Bu çalışma, kur şartlama koşullarının nispeten yüksek verim testine olanak tanıyan optimize edilmiş bir deney düzeneğini göstermektedir. Ayrıca, istatistiksel analiz betiğini açıklar ve tahlilin kritik faktörlerini tartışır. ÖyleBurada kendi, Drosophila geni Dihidroksiaseton fosfat açiltransferaz ( Dhap-at ) LTM için nöronlarda gereklidir, ancak STM için gerekli değildir. Bu genin insan ortologu gliseronfosfat O-açiltransferaz ( GNPAT ), şiddetli zihinsel engellilik, nöbetler ve birkaç diğer klinik özellik ile karakterize otozomal resesif geçişli bir bozukluk olan rhizomelik kondrodisplazi punktata tip 14'te mutasyona uğramıştır. Bu bağlamda, kantite şartlandırma, mekanik çalışmalar için bir temel oluşturan öğrenme ve bellekte insan hastalık genlerinin rolünü fonksiyonel olarak doğrulamak için kullanılabilir.

Protokol

NOT: Aşağıda özetlenen protokolde, bir toplama, eğitim ve test yinelemesi anlatılmıştır. Sonuçların tekrarlanabilirliğini test etmek için bu adımlar, paralel olarak, çoklu günlerde ve ayrı sinekler grubu ile tekrar edilmelidir ( Tablo 1) . Protokol, 25 ° C,% 70 nem ve 12 saat aydınlık / karanlık döngü sabit koşullarda sinekler yetiştirirken normal olan, yumurtadan yetişkine kadar 10 günlük yaşam döngüsüne dayanır. Bu protokolün tüm yönleri, koşulların tüm analiz boyunca sabit tutulduğunu varsayar. Saatler, inkübatörde ışıkların açılmadan önce (BLO) veya ışıkların açılmasından (ALO) önce saat olarak gösterilir; çünkü bu, araştırıcının tercih ettiği günün saatine göre ayarlanabilir. CO ₂ gazı, yalnızca ilk saf olmayan erkek sineklerin toplanması ve prematüre dişilerin toplanması için kullanın. Kur şartlama için bu protokol aşağıdaki adımlardan oluşur:

1. EÖnceden belirlenmiş kadın koleksiyon kültürlerinin hazırlanması
2. Erkek deneklerin toplanması için kültürlerin kurulması
3. Konut bloklarının hazırlanması
4. Standardize edilmiş prematüre dişilerin üretimi için çiftleşmeli tüplerin kurulması
5. Erkek test deneklerinin toplanması
6. Eğitim
7. Test yapmak
8. Video veri analizi ve istatistikleri

1. Prematüre Kadın Koleksiyon Kültürleri Oluşturmak

1. Güçfoodunu hazırlayın ¹⁶ . % 0.8 (w / v) ağar,% 8 (ağırlık / hacim) maya,% 2 (ağ / hac) maya ekstraktı,% 2 (ağ / hac) pepton,% 3 (ağ / hac) sakroz,% 6 W / v) glikoz,% 0.05 (a / h) MgS04 ve% 0.05 (a / h) CaCl2 ile 15 dakika süreyle su içinde yıkanmıştır. % 0.05 (a / h) metilparaben (DİKKAT: zehirli) ve% 0.5 (v / v) propionik asit (DİKKAT: zehirli) ilave etmeden önce çözeltinin 70 ° C'ye soğumasını bekleyin. Homojen bir solüsyon elde etmek için 50 ° C'ye soğutulurken karıştırarak iyice karıştırın.
2. Bu yüzden yemekten önceOda sıcaklığında kapanır, her 175 mL'lik plastik flakona ~ 50 mL'lik güç katılır. Yiyeceklerin daha da soğumasına izin verin. Şişeyi fişle kapatın.
   NOT: Powerfood, muhtemelen yumurta döşeme indükleyerek, çok sayıda sinek üretimi için formüle edilmiş özel bir gıda karışımıdır. Powerfood, davranış analizi için kullanılacak olan erkek sinekleri üretmek için kullanılmaz (2. adım), çünkü atipik diyet ve olası kalabalık gelişmeyi etkileyebilir.
3. -11 günde ( Tablo 1 ), powerfood flakonlarında yaklaşık 60-100 sinek (erkeklerin ve dişilerin karışımı) olan 5-20 yabanıl tip kültürlere başlayın; Standartlaştırılmış prematüre dişiler üretmek için bunlar adım 4'te kullanılacaktır. Larvaların pupatabildiği alanı arttırmak için her şişeye bir filtre kağıdı ekleyin; Bu, eksilen olan sineklerin sayısını artıracaktır.
4. Deney boyunca 1.1-1.3 arasındaki adımları periyodik olarak tekrarlayarak,"Standardize edilmiş prematüre dişilerin üretimi için çiftleşme flakonlarının kurulması" (adım 4).

2. Erkek Test Olgularının Toplanması İçin Kültürlerin Kurulması

1. % 0.5 (ağ / hac) ağar,% 2.75 (ağ / hac) maya,% 5.2 (müsaade) mısır unu,% 11 (ağ / hac) şeker,% 0.05 (ağ / hac) mısır unu ile yapılan normal gıdalar ¹⁶ hazırlayın. ) Metilparaben ve suda% 0.5 (h / h) propiyonik asit ilave edildi. 175 mL plastik şişeleri bir flakon tıpa ile kapatın.
2. -10 günde ( Tablo 1 ) normal gıda maddesi içeren her 175 mL'lik flakonda yaklaşık 30-75 dişiliğe ( madde / ekipman tablosu ) sahip yaklaşık 10-20 erkek yerleştirin. Penetrasyon için yüzey alanını arttırmak ve üretkenliği en üst düzeye çıkarmak için bir filtre kağıdı ekleyin.
3. Gerekli sayıda test denekli erkeği elde etmek için genotip başına üç ila altı adet 175 mL viyal oluşturun.
   NOT: Arzulanan genin üretkenliğine bağlı olarak daha fazla şişe gerekebilirotype.

3. Muhafaza Bloklarının Hazırlanması ( Şekil 2A )

1. Bir mikrodalga fırında konut bloğu başına yaklaşık 50 mL'lik bir güç fiyata eritin veya taze hazırlayın.
2. Çok paylaştırılmış bir pipet kullanarak 96 yuvalı, düz tabanlı bir bloğun her oyuğuna 500 μL güç maddesi ekleyin.
3. Yiyeceklerin oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin.
4. Blokları PCR yapışkan filmle kaplayın ve sinekler için temiz hava sağlamak için oyuk başına en az 4 delik açmak için bir iğne kullanın.
5. Her kuyu açabilmek için, yapışkan filmi her sıra arasında uzunlamasına kesmek için tıraş bıçağı kullanın. Filmi bloğun bir ucunda sağlam bırakın.
6. Bloklar 4 ° C'de 2 güne kadar saklanabilir.
   NOT: Blokların kullanımdan önce oda sıcaklığına yeniden dengelenmesine izin verin.

Standartlaştırılmış Prematüre Dişlerin Üretimi İçin Çiftleştirme Flakelerinin Kurulması

1. -1 gününde kaldırın ve2-5 saat BLO'da prematüre kadın koleksiyon kültürlerinden yetişkinlerin tümü yabani sinek uçlarını atın.
2. Bu flakondan aspiratör ( Şekil 2B ) kullanarak 2-3 saat aralıklarla ( örneğin, 30 dakika, 2.5 saat ve 5 saatlik ALO) sinek toplayın ve az miktarda maya ile desteklenmiş yeni bir güç kutusu şişesine yerleştirin Macun ve filtre kağıdı.
3. Kalabalığın önüne geçmek ve optimal bir çiftleşme atmosferi yaratmak için, yeni şişelere 150-200'den fazla sinek aktarmayın. Tüm dişilerin eşleşmesini en az% 25 erkekler sağlayarak sağlayın. Deney boyutunu karşılamak için çift cam şişe içinde yeterli sayıda diş bulunduğundan emin olun.
   NOT: Bu protokolde çok önemli bir adım olduğundan, yalnızca yeni kaplanmış sineklerin ve yaşlı sineklerin, larvaların veya pupaların yeni çiftleşme flakonuna aktarıldığından emin olun.
4. Tüm dişiler için çiftleşmek için yeterli zaman bırakmak için bu "çiftleşme çiftli şişelerini" dört gün inkübe edin.

ColErkek Test Konusunun Olması

1. 2-3 saat BLO'da 1. günde ( Tablo 1 ), erkek toplama şişelerindeki tüm yetişkin sinekleri çıkarmak için CO ₂ kullanın (2. adım) Ancak önümüzdeki birkaç saat içinde daha fazla sinek kuşatın.
2. Önümüzdeki 5-6 saat boyunca, yeni kaplanmış sinekleri her 20-30 dakikada CO ₂ kullanarak çıkarın ve her bir erkek aspiratörü kullanarak konut bloğunun (adım 3) bireysel bir kuyruğuna yerleştirin ( Şekil 2B ).
3. Yapışkan PCR filmi ile kuyu tekrar mühürleyin.
   NOT: Bu, protokolde çok önemli bir adımdır. Erkekler sık ​​sık toplanmalıdır. Toplanan pigmentli erkeklerin yarı saydam karında mekonyum bulunduğunda, tohumlaşma zamanının yakınında konut bloğunda izole edilmelidir.
   NOT: Aspiratörün nazikçe kullanılması sineklerin taşınmasına izin verir; Bununla birlikte, uygunsuz kullanım sinekleri baskılayarak, analizde varyansa neden olacaktır (Tartışma'ya bakın).
4. AmaçlamakGenotip başına 48 erkeği tutabilirsin. Bu, hem naif hem de eğitimli koşulların analizi için gerekli maksimum erkek sayısına az miktarda fazlalık sağlar ve sonraki transfer adımlarında bir miktar kayıpla izin verir.

6. Eğitim

1. Çiftleşmiş flakondaki sinekleri çıkarın (adım 4.2), CO ₂ kullanarak ve ön dişleri erkeklerden ayırın.
2. Aspiratörü kullanarak, yeni bir gövde bloğunun bir sırasındaki her oyuğa bir adet anestezi edilmiş prematüre dişi ekleyin.
3. Aspiratör kullanarak ve anestezi olmadan, adım 5.2'de ayarlanan gövde bloğundan bir saf naif erkeği, öncül bir dişi içeren kuyuya aktarın. Erkek kuyunun içine yerleştirildikten sonra, yapışkan film ile hemen mühürleyin; Erkeğin kaçmasına izin verme.
   NOT: Erkek sinekleri aspiratörden gövde bloğuna doğal "negatif geotaksis" davranışlarından yararlanarak aktarın (Tartışma'ya bakın).
4. Adımları tekrarla6.2-6.3 yeterince erkek-dişi çifti kurulana kadar. İdeal olarak, genotip başına 24 çift, bir tam gövde bloğu dizisi oluşturun. Adım 5.2'de ayarlanan orijinal muhafaza bloğundaki kalan saf erkeği bırakın.
5. Eğitim süresi boyunca erkek-dişi çiftlerini rahatsız bırakmayın ( Tablo 2 , Şekil 1B ).
   NOT: Bu süre zarfında erkek, bekâr kadın tarafından mahkemeye gider ve reddedilir. Öğrenme ve STM için eğitim süresi 1 saattir ve LTM için eğitim süresi 7-9 saattir.
6. Antrenmanı bitirin ( Tablo 2 , Şekil 1B ) bir aspiratör kullanarak erkeği ön dişiden hafifçe ayırın; Anestezi kullanma. Ayrılmış erkeği yeni bir gövde bloğuna yerleştirin.
7. Saf olmayan tüm erkekleri adım 5.2'de ayarlanan gövde bloğundan yeni bir gövde bloğuna hafifçe ve anestezi olmadan aktarmak için aspiratör kullanın.
   NOT: Bu adım, STM ve lea için isteğe bağlıdırAncak LTM için çok önemlidir çünkü sinekler LTM'yi test etmek için 24 saat daha barındırılıyor.
8. STM ve LTM için, testten önce (adım 7) erkeklerin sırasıyla 1 saat ve ~ 24 saat dinlenmesine izin verin ( Tablo 2 , Şekil 1B ).
9. Öğrenmek için, eğitimli ve naif erkekleri derhal test edin (adım 7).

7. Test etme

1. Çiftleşmiş flakonlardan fleleri toplayın (adım 4.2), CO ₂ kullanarak ve ön dişleri erkeklerden ayırın.
2. Normal besin içeren bir flakondaki dişiler en az 1 saat boyunca anesteziden kurtulsınlar.
3. Test başlamadan önce tüm ekipmanların hazır olması için video kayıt cihazlarını önceden monte edin ( Şekil 2C ).
4. Öğrenme, STM ve LTM için farklı zaman çizelgelerine göre test etmeye başlayın ( Tablo 2 , Şekil 1B ). Eğitimden hemen sonra test yapınÖğrenme için, STM için eğitimden 1 saat sonra ve LTM için eğitimden 24 saat sonra.
5. Aspiratörü kullanarak öğrenme test edildiyse (adım 6.7, eğitimden geçirilmiş 6.8 adımdan sonra) bölme kapısı kapalı konumda kurstan önce yarım kalan bir kişiyi yavaşça dinlenme yuvasından veya eğitim kılıfı bloğundan geçirin ( Şekil 2D ; Bir bina planı için Dosya S1'e bakınız).
   NOT: Doğal "negatif jeotaksi" davranışının kullanılması, erkek sinekleri aspiratörden kur gayret alanına aktarmak için yeterli olmalıdır (Tartışma).
6. Giriş deliğini bir an için bir sonraki arenaya hızla ve hafifçe hareket ettirin ve 18 arenada bir erkek bulunana dek adım 7'yi tekrarlayın.
7. Aspiratör kullanarak ve CO ₂ olmadan, 18 evrenin diğer yarısına ön hazır bir dişi ekleyin (adım 7.2'de toplanır).
8. Kovanların açılması aşağı bakacak şekilde dikkatle kutu odasını kamera altına yerleştirin ( Şekil 2C ).
9. Erkeklerle prematüre dişiler arasında doğrudan etkileşime girmek için arenanın bölücüsünü çıkarın.
10. Davranışın en az 10 dakika boyunca derhal kopyalanmasına başlayın.
    NOT: İki kamera kurulumu kullanırken, verimliliği en üst düzeye çıkarmak için iki eşlik tabağının paralel kayıtları çakışan zaman aralıklarında yapılabilir.
11. Kurum alanlarını elle tutulan bir elektrikli süpürge ile boşaltın ve kur odahanesinin yeniden kullanılması öncesinde havalandırılmasına izin verin.
12. Tüm genotiplerin ve koşulların test edilmesi (saf ve eğitimli) tamamlanıncaya kadar adım 7.4-7.11'i tekrarlayın.

8. Video Veri Analizi ve İstatistik

1. Sınavın ilk 10 dakikasında erkek mahkemelerin her bir erkek sinek için zaman yüzdesi olarak tanımlanan kurluk indeksini (CI) hesaplayın.
   NOT: Bu, stereotipik kur beraberlik davranışını ( Şekil 1A ) gözlemleyerek veya manuel olarak yapabilirsinizKurban davranışlarının otomatik olarak ölçülmesi için bilgisayar yazılımını söylemek (Tartışma).
   NOT: Yeterli istatistiksel güç elde etmek ve CI verilerinin tutarlılığını değerlendirmek için, durum başına 40-60 erkeği üç gün boyunca analiz etmesi önerilir.
2. Eğitilmiş erkeklerin ortalama CI'sinde naif erkeklerle karşılaştırıldığında yüzde azalma olarak tanımlanan öğrenme indeksini (LI) hesaplayın (LI = (CI _naif -CI eğitilmiş) / CI _naif ). Her bir test günü için LI değerini değerlendirin ve birleştirilen tüm test günlerinden hesaplanan kümülatif LI ile karşılaştırın.
3. Üstbilgi olarak "Genotip" ve "CI" ile ayrı iki sütunlu bir sekme veri dosyası oluşturun.
   NOT: Bu başlıklar büyük / küçük harf duyarlıdır. Her bir CI için genotip adı, bir alt çizgi ve eğitim koşulunun takip ettiği genotipin bir açıklamasından oluşmalıdır ( örn., Genotip_N ve genotype_LTM, vb., Burada N = naif ve LTM = uzun vadelibellek; Örnek için Ek Dosya S2'ye bakınız). Analearn işlevi, "Genotip" sütunundaki ilk alt çizgiden sonra mevcut olan karakterlere dayalı olarak eğitilmiş ve saf olmayan sinekleri belirleyeceğinden, bu ek açıklama önemlidir.
4. Farklı genotiplerden LI değerleri arasındaki farkların istatistiksel önemini değerlendirmek için bir randomizasyon testi gerçekleştirmek için analearn R komut dosyasını (Ek Dosya S3) kullanın.
   1. Komut dosyasını (Tamamlayıcı Dosya S3) R ^18'e yazın ve "analearn" adlı bir işlevi tanımlayın.
      NOT: İşlev tanımı: analearn <- işlev (nboot = 10,000, naivelevel = 'N', refmutation = NA, datname = NA, üstbilgi = TRUE, çekirdek = NA, writeoutput = TRUE).
   2. Fonksiyonu R komut satırına "analearn ()" yazarak ve açılır pencereden analiz edilecek veri dosyasını (adım 8.3'te üretilen) seçerek başlatın.
   3. Referans mutasyonunu seçin;Kontrol genotipidir, ilgili numarayı girip enter tuşuna basarak.
      NOT: Referans genotipini seçtikten sonra, komut dosyası 10.000 önyükleme çoğaltması gerçekleştirmek için birkaç saniye sürer.
   4. Genotip, öğrenme koşulu ( ör. Öğrenme, STM veya LTM), ortalama CI naif, ortalama CI eğitimi, LI, kontrolün LI'si ile deneysel koşula kıyasla fark olan çıktı tablosunu (Tablo 3) gözleyin (LI dif), LI dif'nin% 95 güven aralığının alt sınırı (LL) ve üst sınırı (UL) ve p değeri anlamlı farklılık ihtimalini göstermiyor.
      NOT: analearn, çıktı dosyasını veri dosyasının bulunduğu dizinde saklar. Bununla birlikte, çıkış tablosu R-Studio konsolunda da görünür. Varsayılan adı, sağlanan veri dosyasının adını temel alarak oluşturulmuştur.
   5. Analearn işlevinde değiĢiklikleri değiĢtirmek için kullanılabilen birkaç argüman vardır.Önyükleme sıkıştırma parametrelerini ayarlamak için işlevin hata ayarlarını yapın.
      NOT: "nboot" önyükleme çoğaltmalarının sayısını tanımlar ve varsayılan olarak 10.000'e ayarlanır. Bu değer, sıfırdan büyük herhangi bir tam sayıya dönüştürülebilir. Tablo 5, işlevin varsayılan ayarlarını değiştirmek için kullanılabilecek çeşitli bağımsız değişkenleri listeler. Bununla birlikte, daha az önyükleme çoğaltmasıyla üretilen verileri kullanmak önerilmez.

Sonuçlar

Kort iklimlendirme tahlili, Drosophila'daki öğrenmeyi ve hafızayı ölçmek için kullanılabilir . Bunu göstermek için, burada sunulan sonuçlar, kontrol hücrelerinde STM ve LTM'yi, Dhap-at'ın nörona spesifik knockdown'u olan sineklere kıyasla analiz etmektedir. Kontrollü erkekler, Caenorhabditis elegans'a spesifik bir geni hedef alan bir RNA interferans saç tokası dizisini ifade etmektedir, tahmin edilen çinko parmak proteini C02F5.12 ¹⁹ . Bu kontrol türü, aynı genetik zeminde knockdown ve kontrol arasında eşit sayıda upstream aktivasyon dizisi (UAS) unsuru sağlar ve kontrol RNAi saç tokası, RNAi sisteminin spesifik olmayan etkilerini açıklar. Her iki STM ( Şekil 3A , p = 1.2 x 10 ^- 20 mg / kg) için kontrol grubu erkekleri (genotip: UAS-dcr2 / +; P {KK108109} VIE-260B / +; elav-Gal4 / ⁴ , Mann-WhitneY U testi) ve LTM ( Şekil 3B , p = 1.2 x ^10-4 , Mann-Whitney U-testi). Bu sonuç, bu sineklerde normal öğrenme ve hafıza kapasitesini yansıtıyor. Dhap-at knockdown sinekleri (STM için naif sineklere karşı eğitilmişlerdeki CI'nin önemli bir azalmasını da göstermektedir ( Şekil 3A , p = 1.2 x 10 ^-4 , Mann-Whitney U-testi). Bununla birlikte, LTM eğitimi sonrasında CI'de anlamlı bir azalma göstermemektedir ( Şekil 3B , p = 0.33, Mann-Whitney U-testi). Bazı koşullar için CI verilerinin parametrik olmayan dağılımına bağlı olarak naif ve eğitilmiş sineklerin ortalama CI'sini karşılaştırmak için Mann-Whitney U-testi kullanılmıştır ( Şekil 3A ve 3B ). CI'lerin analizi yoluyla gözlemlenen farklılıklar, her bir genotipe ilişkin LI ile yansıtılır ve yüzdelik azalmayı ölçerEğitimli sineklere karşı CI'de ( Şekil 3C ). LTM için LI, Dhap-at knockdown sineklerde anlamlı derecede düşükken ( p = 0.115, 10.000 çizme çizgisel çoğaltmalar, Şekil 3C , Tablo 3 ), kontroller arasında ve Dhap-at knockdown sinekleri arasında LI'da anlamlı bir fark bulunmamaktadır ( p = 0.0034, 10.000 önyükleme kopyaları, Şekil 3C , Tablo 3 ). Genotipler arasındaki LI'nin karşılaştırılması için, önce Kamyshev ve ark. Tarafından önerilen bir yöntemden uyarlanmış bir randomizasyon testi ^{20 7} kullanıldı. LI, popülasyon verilerinden türetilen tek bir değer olduğu için ( yani, ortalama CI-naif ve ortalama CI-eğitilmiş), deneysel olarak türetilmiş dağılımlara dayanan standart istatistiksel yöntemler geçerli değildir. Rasgeleme testi dağıtımdan bağımsızdır ve önyüklemeyi kullanır ( örn., Rasgele örneklemeGerçek verilerden türetilen varsayımsal veri kümeleri oluşturmak için değiştirme ile birlikte). Analearn betiği (Dosya S3), her genotip için bir dizi varsayımsal LI oluşturur ve kontrol ve test genotipi (LIdiff) arasındaki farkı hesaplar. Bu işlem 10.000 kez tekrarlanır ve ortaya çıkan değerler LIdiff'in% 95 güven aralığını belirlemek için kullanılır ( Tablo 3 ). Bu veri, iki genotipin LI'sının farklı olabileceğini gösteren bir p- değeri üretmek için kullanılır. Burada gösterilen sonuçlar, LTM için nöronlarda Dhap-at'ın gerekli olduğunu, ancak STM için gerekli olmadığını göstermektedir.

Günlük değişkenliği kontrol etmek için CI'ler ve LI'ler, tekrarlanan günler arasında karşılaştırılır ( Tablo 4 ). Her ne kadar LI'da bir miktar dalgalanma gözlemlense de, sonuçlar genellikle tekrar edilebilir. CI verilerinin, kontrol str'e bağlı olarak büyük ölçüde değişebileceğini unutmamak önemlidirVe kullanılan çevre koşulları. Burada gösterilen CI verileri, bu kontrol genotipi için tipiktir, ancak diğer genotipler, daha yüksek veya daha düşük ortalama CI ve dağılım gösterebilir.

Şekil 1: Kurum İndeksi ve Deneysel Görünümün Belirlenmesi. ( A ) Bir sinek sineğine karşı stereotipik erkek kovuşturma davranışını gösteren imgeler. Kuraklık davranışının farklı aşamalarında gösterilmiştir: oryantasyon (I), takip eden (II), kanat titreşimi (uzatma) ve dokunma (III), yalama (IV) ve kopuplenmeye teşebbüs (V). ( B ) Kuluçka makinesi ışık devrine göre eğitim ve test sürelerinin şematik görünümü, saat işareti. Eğitim süreleri çubuklarla, STM ve LTM'nin dinlenme periyotları kesik çizgi ile gösterilir ve test başlangıç ​​noktası bir okla gösterilir. Not:LTM için test süresi eğitimden sonraki gün. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 2: Drosophila Courtship Conditioning Assay için kullanılan ekipman. ( A ) Gövde bloğu, kuyunun her bir tarafında 500 μL güç kütlesi bulunan düz, alt bloktur. 0,8 mm çapında bir şırınga iğnesi kullanılarak yaratılan, oyuk başına en az 4 delikli bir qPCR yapışkan film ile kapatılmıştır. Bireysel satırlar açma ve kapamaya izin vermek için uzunca bir şerit şeklinde bir tıraş bıçağı kullanılarak kesilir. ( B ) Aspiratör, erkek ve dişi sineklerin anestezi kullanılmadan nazik biçimde aktarılması için gereklidir. Giriş, aspiratörün ucunu gösterir, pamuklu bir parça ile kapatılır.Uç uçtaki sinekler. ( C ) İki cezaevinin aynı anda kayıt edilmesi için iki kamera sisteminin kurulması. ( D ) 18 arenada bir kurşun odası. Sürgülü giriş delikleri, arenalara sinek yerleştirmek için kullanılır. Beyaz bölücüler eş zamanlı olarak erkeklerle dişiler arasındaki etkileşimi başlatmak için açılabilir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 3: Kontrol ve Dhap-At Knockdown Flies'de STM ve LTM Analizi. ( AB ) STM (A) ve LTM (B) için test edilen kontrol (gri) ve Dhap-at knockdown (beyaz) genotiplerinin naif (N) ve eğitilmiş (T) sinekleri için CI değerlerinin dağılımını gösteren kutu çizgileri. ( C ) CorrespoSTM ve LTM için test edilen kontrol ve Dhap-at knockdown sinekler için LI değerleri . Kontrol ve knockdown genotipleri arasındaki LI'daki farklılıklar, bir randomizasyon testi (10.000 önyükleme çoğaltmaları) kullanılarak karşılaştırıldı. Hata çubukları, farklı test günlerinde hesaplanan LI değerlerinden elde edilen ortalama değerin standart hatasını belirtir. Genotipler şunlardır: w +, UAS-dcr2 / + ; P {KK108109} VIE-260B / + ; Ve elav-Gal4 / + (Kontrol) Ve w +, UAS-dcr2 / + ; P {KK101437} VIE-260B / +; Ve elav-Gal4 / + ( Dhap-at- RNAi). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

	Genel	Toplamak	Tren	Ölçek
Gün-11	Prematüre dişi toplama kültürlerine başlayın (adım 1.3)
Gün -10	Erkek deneklerin toplanması için kültür başlatın (adım 2.2)
1.gün		rep. 1
2. gün		rep. 2
Gün 3		rep. 3
Gün 4		rep. 4	rep. 1
Gün 5			rep. 2	rep. 1
Gün 6			rep. 3	rep. 2
Gün 7			rep. 4	rep. 3
Gün 8				rep. 4
Gün 9	Video veri analizi ve istatistikleri (adım 8)
Rep = tekrar

Tablo 1 : Bireysel Günler Üzerinde Üç Çoğaltan Üzerinde LTM Testi için Örnek Zaman Çizelgesi.

	Öğrenme	STM	LTM
Eğitim zamanı	1 saat.	1 saat.	8 saat.
Dinlenme zamanı	0 saat.	1 saat.	~ 24 saat.
Eğitime başlamak	0h. ALO	0 saat. ALO	4 saat. BLO
Antremanı durdur	1 saat. ALO	1 saat. ALO	4 saat. ALO
Testi başlat	1 saat. ALO	2 saat. ALO	0 saat. ALO (ertesi gün)
ALO = ışıklar açıldıktan sonra, BLO = ışıklar açılmadan önce, STM = kısa süreli bellek, LTM = uzun süreli bellek

Tablo 2 : Eğitim Süresi, Eğitim Süreleri ve Öğrenme, STM ve LTM için Test Süreleri.

Genotip	Öğrenme şart	CI saf	CI eğitilmiş	LI	LI fark	Alt sınır (% 95 uyuşmazlık aralığı)	Üst sınır (% 95 uyuşmazlık aralığı)	p-değeri
Kontrol	STM	0.467	0.116	0.752	NA	NA	NA	NA
DHAP-at-RNAi'de	STM	0.699	0.257	0.633	0.119	-0,030	0.265	0.116
Kontrol	LTM	0.590	0,384	0.348	NA	NA	NA	NA
DHAP-at-RNAi'de	LTM	0.697	0.650	0.068	0.280	0.103	0.446	0.003

Tablo 3: Analearn Senaryosundan Üretilen İstatistiksel Veriler.
Analiz komutundan üretilen istatistiksel veriler. Genotipi, öğrenme koşulunu ( yani öğrenme, STM veya LTM) içeren çizme R-komut dosyasının çıktı dosyası, CI naif, ortalama CI eğitilmiş, LI, deney koşuluna kıyasla kontrolün LI'si arasındaki fark (LI dif) , LI dif'nin% 95 güven aralığının alt limiti (LL) ve üst limiti (UL) ve p değeri anlamlı farklılık ihtimalini göstermemektedir.

		Kontrol			DHAP-at-RNAi'de
		Ortalama CI naif	Ortalama CI eğitimi aldı	LI	Ortalama CI naif	Ortalama CI eğitimi aldı	LI
STM	1.gün	0.300	0.125	0.584	0.679	0,239	0.648
	2. gün	0.634	0.107	0.831	0.720	0.276	0.617
	Tüm günler	0.467	0.116	0.752	0.699	0.257	0.633
LTM	1.gün	0.590	0.441	0.252	0,630	0.646	-0,027
	2. gün	0,640	0.363	0,432	0.709	0.710	-0,002
	3. Gün	0.547	0.349	0.363	0.738	0.598	0.190
	Tüm günler	0.590	0,384	0.348	0.697	0.650	0.068

Tablo 4 : Ayrı Sınama Günlerinde Elde Edilen CI ve LI Değerleri.

"Naivelevel", her bir genotip için naif değerleri belirleyecek metni belirler. Varsayılan "N", ancak bu, diğer alfasayısal metinlere dönüştürülebilir.

"Refmutation", varsayılan olarak "NA" (geçerli değil) olarak ayarlanır, ancak istatistiksel karşılaştırmalar yapmak için kontrol veya genotip adı olarak değiştirilebilir. Bu, sCript otomatik olarak kontrol genotipini seçer.

"Datname", veri dosyasının adını belirtir ve varsayılan dosya seçimi yerine bu bağımsız değişkende belirtilebilir.

"Başlık", veri dosyasının sütun başlıklarını içerip içermediğini belirtmek için kullanılabilir. Varsayılan değer "TRUE", ancak bu bağımsız değişken "YANLıŞ" olarak değiştirildiğinde üstbilgisi olmayan bir dosya kullanılabilir.

"Seed", rasgele sayı üretecini başlatır.Bu varsayılan olarak "NA" olarak ayarlanır ve komut dosyası her kullanıldığında rastgele bir sayı sağlar. Tasarım gereği, bir önyükleme analizi, her çalıştırıldığında, aynı veri dosyasını kullanırken bile, biraz farklı sonuçlar verir. Tohum sıfırdan büyük herhangi bir tam sayı ile belirtildiğinde, aynı rasgele önyükleme örneği seti elde edilir.

"yaz Put ", bir çıktı dosyasının oluşturulup oluşturulmayacağını belirlemek için" TRUE "veya" FALSE "olarak ayarlanabilir. Varsayılan değer "TRUE" dir.

Tablo 5: Önyüklemenin Parametrelerini Ayarlamak İçin İşlevin Varsayılan Ayarlarını Değiştiren Analearn İşlevinde Kullanılan Argümanlar

Ek Dosya S1: Bir mahkeme odasının planını oluşturma. Dosya, .stp uzantılarına (CAD dosyaları) izin veren herhangi bir uygulama ile açılabilir . Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya S2 : Analearn Komut Dosyası İçin Giriş Dosyası Örneği .S2.zip "target =" _ blank "> Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya S3 : Analearn.R Acript. Dosya R-studio ¹⁸ ile açılabilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışmalar

Kort şartlandırma tahlili, Drosophila'daki öğrenme ve hafızayı analiz etmek için klasik bir paradigmadır . Burada sunulan protokol, daha önce ^{6 , 7 , 8 , 9'da} açıklanan genel metodolojiyi izlemektedir ^, ancak pratik kılavuzlar, özel ekipman ve randomizasyon testleri için bir veri analiz scripti ^{9 , 12} gibi benzersiz yönleri içermektedir. Bu protokolü kullanarak, erkek toplamak ve eğitmek için çok sayıda sinek paralel olarak 96 yuvalı düz alt bloklar ( Şekil 2A ) kullanılarak analiz etmek mümkündür. Bloklar, PCR yapışkanlı film ile sızdırmaz hale getirildi, bu da sineklerin kolayca erişilebilir olmasını sağlıyor. Buna ek olarak, burada açıklanan eşsiz kur odalarında 18 erkek-dişi çifti eşzamanlı olarak iki boyutlu bir alanda eşleştirmek mümkündür.Video analizi için idealdir. Özel tasarım courtship odaları kullanımı kolaydır ve bir bina planı vardır ( Dosya S1 , Şekil 2D ). Test konularını toplamak için kullanılan kültürlerin kurulmasından bu video verilerinin edinilmesine kadar olan bu protokol, yaklaşık 20 gün sürer ( Tablo 1 ). Video verilerinin analizi için ek süre gereklidir. Deneyimlerimize göre, STM tahlili son derece sağlamdır. LTM tahlili de oldukça sağlam ancak karışık çevre değişkenlerine karşı daha duyarlıdır ve bu nedenle ustalığı zorlaşabilir.

Hayvan davranışı oldukça değişken olabilir. Bu nedenle, bu varyansı azaltmak için protokoldeki kritik adımlar özenle yapılmalıdır. Öncelikle, aspiratörün nazikçe kullanılması ( Şekil 2B ) kaba kullanım veya çok fazla üfleme ile uygulanan stresini azaltacaktır. Bireysel transferi için önerilen bir yöntemAspiratörden çıkan sinekler negatif jeotaksi kullanmaktır. Sinekler yukarıya doğru eğilim gösterdikçe, aspiratörün ucunu yukarıya doğru itebilir; Sinek uca ulaşmadan hemen önce sineklerin dışarı atılmasına nazik bir darbe yeterlidir. Ayrıca, testten önce erkekleri mahkeme odalarına sokmak için genellikle bir darbe gerekli değildir.

Bir diğer önemli adım ise, erkek deneklerin toplanması ve üretilmesidir. Bütün erkekler çok genç olduklarında ve toplumsal olarak naif olduklarında toplanmalıdır. Bu, eklosiyonun zirve dönemlerinde sık sık toplanarak elde edilebilir (aşama 5.2). Erkekler bu sıkı zaman diliminde toplanmazlarsa, erkenden sosyal etkileşime geçebilirler; bu da, öğrenmenin zayıf olduğu veya CI'de değişkenlik gösterebilir. Erkek deneklerin değerlendirilmesi gereken bir diğer faktör de genetik geçmiştir. Farklı genetik geçmişler farklı düzeylerde saf naiplik sergileyecek ve genel aktivite veya lokomotor yeteneği açısından farklılık gösterebilir. Ne zaman compaÇok sayıda genotipi çalarlarsa, LI puanlarını etkileyebilecek bu karıştırıcı faktörlerden kaçınmak için genetik geçmişle ilgili özen gösterilmelidir. Ek olarak, CI verilerinin dağılımı dikkatle değerlendirilmelidir. CI verileri, genotipe veya diğer çevresel faktörlere bağlı olarak hem parametrik hem de parametrik olmayabilir. Bazı durumlarda, CI dağılımı normal dağılımdan çarpıcı bir şekilde çarpıtılmışsa, LI hesaplamaları için ortalama yerine medyan CI kullanmak daha iyi olabilir. Bununla birlikte, tecrübelerimize göre, medyan veya ortalama CI kullanımı, verilerin istatistiksel yorumlanmasında bir fark oluşturmaz ve ortalama CI kullanımı, literatürdeki yaygın uygulamadır.

Başarılı kur kurumu için, eğitim öncesi kadınlar tarafından yapılan erkek kur yapma girişimlerinin aktif olarak reddedilmesi çok önemlidir. Bu tahlilde kullanılan prematüre dişilerin etkili bir şekilde çiftleştiğinden emin olmak önemlidir veBöylece kopyalanmaya izin verilmez. Bu ön hazırlık, 4. aşamada hazırlanan çiftleşme flakonlarında, erkek ve dişi sürgünlerin 4 gün boyunca bir araya getirildiği yerlerde kurulmuştur ( Tablo 1 ). Ardından, çiftleşme, test videolarının düzenli incelenmesi ve eğitim sırasında erkek-dişi çiftlerin gözlenmesi ile izlenebilir. Eğer çiftleşme meydana gelirse, prematüre dişilerin hazırlanması sırasında alınabilecek birkaç önlem var. Öncelikle, prematüre dişiler en uygun üreme koşullarında yetiştirilmelidir. Şişeler maya macunu ve potansiyel çiftleşme yüzeylerini arttırmak için katlanmış bir filtre kağıdı ile desteklenebilir. Sineklerin burada açıklanan koşullar altında inkubasyonu, geçmişte sağlam öngörülemeyen dişiler üretti, ancak bu farklı laboratuarda ve farklı genetik soyların kullanımı ile farklılık gösterebilir. Bu nedenle, inkübe etme zaman ve koşullarını değiştirerek prematüre dişilerin üretimini optimize etmek gerekebilir.

Kurban davranışının nicelenmesiBu protokolde başka bir kritik adım. Bu, elle veya otomatik olarak özel yazılım programları kullanılarak yapılabilir ⁹ . Otomatik niceleme hızlıdır ve prensipte tarafsızdır. Birçok program yayınlandı ^{21 , 22 , 23} ; Bununla birlikte, kullanımı kolay değildir, çoğu zaman özel video formatları ve ileri hesaplama becerileri gerektirir. Manuel sayısallaştırma kolay ve doğrudur, ancak çok emek yoğun ve bireysel değişkenlik ve önyargıya tabidir. Bu protokolün, CI'lerin otomatik olarak ölçülmesi için potansiyel olarak gerekli olan video biçimlendirme gereksinimlerini karşılamadığını vurgulamak önemlidir. Manuel sayım yapmak için, kur yapma davranışını doğru bir şekilde izlemek için yeterli kalitede bir video üretme potansiyeli olan herhangi bir basit video kayıt cihazı kullanın. Otomatik kantifikasyon için muhtemelen farklı olacaktırGereksinimlerini yazılıma bağlı olarak değiştirebilir ve otomatik kantifikasyon isteniyorsa kullanıcıların bunu kapsamlı bir şekilde araştırmaları gerekir.

Sineklerin genetik manipülasyonu için kullanılabilen kapsamlı araçlar ile birlikte, kur şartlama tahlili, öğrenme ve bellek ile ilgili moleküler mekanizmaları ve nöronal ağları incelemek için kullanılabilecek sağlam bir okuma sağlar.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
P{KK101437}VIE-260B	VDRC	101437	Dhat-at-RNAi in 60100 background
P{KK108109}VIE-260B	-	-	Control-RNAi in 60100 background (gift from K. Keleman)
w+, UAS-dcr2/yhh;;elav-Gal4 (III)	-	-	panneuronal driver line
Containers for plant tissue culture	VWR	960177	175 mL plastic vials
Folded filters	Whatman	10311643	Filter paper to enlarge area flies can pupate on
Flat-bottom blocks (96-wells)	Qiagen	19579	Used for housing blocks
MicroAmp Clear Adhesive Film	Applied Biosystems	4306311	PCR adhesive film as lid on flat-bottom blocks
Razor blade	-	-	Any sharp will do
Needle	-	-	0.8 mm diameter
Aspirator	-	-	Cut a 1mL pipet tip with scissors in order to have two pieces. The narrow tip of the pipettip is placed as fly entrance in a ~80 cm flexible hose. To prevent a fly from getting in the hose, a normal piece of cotton or small mesh gaze is placed in between the tip and the hose. The other half of the pipettip can be used as mouth piece at the end of the hose.
Courtship chambers	-	-	file S1 can be opened with indicated CAD software
Camcorder	Sony	-	camera specification: >4M pixels, full HD. For manual quantification, any simple video recording device has the potential to produce a video of sufficient quality to observe courtship behavior accurately. For automated quantification, there will likely be different requirements depending on the software to be used, and users should investigate this thoroughly if automated quantification is desired.
Name	Company	Catalog Number	Comments
power food
Agar	Sigma	A7002
Yeast	Bruggeman	-
Yeast extract	MP biomedicals	0210330391
Peptone	Sigma	P6838
Sucrose	Sigma	S9378
Glucose	Sigma	G7021
MgSO4	Sigma	M2643
CaCl2	Merck	1023780500
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-
Yeast paste	-		yeast grains and water mixture in a 1:1 ratio
Name	Company	Catalog Number	Comments
normal food
Agar	MP biomedicals	215017890
Yeast	bruggeman	-
Corn flour	de Molen	-
Sugar	de Molen	-
Methylparabene (CAUTION)	Sigma	H5501
Propionic acid (CAUTION)	Sigma	P1386
Demineralized water	-