Embriyonik Motor Nöronlarının Aksonal Projeksiyon Paterninin Görselleştirilmesi<em&gt; Drosophila</em

Özet

Bu çalışma, geç evre-16 Drosophila melanogaster embriyolarının motor nöron projeksiyonlarını görselleştirmek için standart bir immünohistokimya yöntemini ayrıntılarıyla anlatıyor . FasII antikoru ile lekelenmiş sabit embriyoların filleted hazırlığı, motor akson yol bulma ve sinirsel gelişim sırasında hedef tanıma için gerekli genlerin karakterize edilmesi için güçlü bir araç sağlar.

Özet

Fonksiyonel nöromüsküler devrelerin oluşturulması motor aksonlar ve hedef kaslar arasındaki hassas bağlantılara dayanır. Motor nöronları, çevredeki hücre dışı ortamdan çıkan çok sayıda akson rehberliğine yanıt olarak spesifik yol boyunca gezinmek için büyüme konilerini uzatır. Büyüme konisi hedef tanıma da nöromüsküler özgüllükte kritik bir rol oynamaktadır. Bu çalışma, geç evre-16 Drosophila melanogaster embriyolarının motor nöron projeksiyonlarını görselleştirmek için standart bir immünohistokimya protokolü sunmaktadır . Bu protokol, istenen mutant embriyoları sıralamak için bir genotiplendirme prosedürü de dahil olmak üzere birkaç temel adım içerir; Fasciclin II (FasII) antikoru ile embriyoların etiketlenmesi için bir imüno boyama prosedürü; Ve sabit embriyolardan dolgulu preparatların üretilmesi için bir diseksiyon prosedürü. Çevredeki motor akson projeksiyonları ve kas desenleri, fileto embriyoların yassı preparatlarında daha iyi görselleştirilirOle-mount embriyolar. Bu nedenle, FasII antikoru ile boyanmış sabit embriyoların filleted hazırlığı, motor akson yol bulma ve hedef tanıma için gerekli genleri karakterize etmek için güçlü bir araç sağlar ve hem fonksiyon kaybı hem de işlev kazanım genetik ekranlarına da uygulanabilir .

Giriş

Embriyonik gelişme esnasında motor aksonlar ve hedef kaslar arasındaki hassas ve seçici bağlantılar, Drosophila larvalarında normal hareket için gereklidir . Karın hemisiyasyon A2-A7'nin her birinde 30 kas lifinin embriyonik desenlenmesi, evre 16 ¹ ile oluşturulmuştur. Ventral sinir kablosunda üretilen 36 motor nöron, spesifik hedef kasları innerve etmek için aksonları periferiye uzatır. Motor akson yol bulma ve hedef tanıma, bir antikor (fare monoklonal antikor 1D4) ^{3 , 4} ile immünohistokimya ile görselleştirilebilir. Vahşi embriyolardaki motor akson projeksiyon modellerinin çoklu görüntüleri web 5'de mevcuttur. 1D4 antikoru, tüm motor aksonları ve üç uzunlamasına akson fasikülünü embriyonik merkezi sinir sisteminin (CNS) orta çizgisinin her iki yanına etiketliyor ^{, 6} ( Şekil 1C ve Şekil 2A ). Bu nedenle, FasII antikoru ile immünohistokimya, motor akson rehberlik ve hedef tanıma altında yatan moleküler mekanizmaları göstermek için nöromüsküler bağlantı için gerekli genlerin belirlenmesi için güçlü bir araç sağlar.

Motor aksonlar, A2-A7 abdominal hemizasyondan her birinde, iki ana sinir dalına, segmental sinir (SN) ve intersegmental sinir (ISN) ^{2 , 4'e} ve küçük sinir dalına, transvers siniri (TN ) ⁷ . SN, seçici olarak, SNa ve SNc olarak adlandırılan iki sinir dalına neden olurken, ISN, ISN, ISNb ve ISNd ^{2 , 4 olarak} adlandırılan üç sinir dalına bölünür. Bunların arasında ISN, ISNb ve SNa motor aksonGeç evre-16 embriyoları FasII antikoru ile boyandığında ve fileto edildiğinde ( Şekil 1C ve Şekil 2A ), projeksiyon desenleri en net şekilde görselleştirilir. ISN motor nöronları aksonlarını 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 ve 20 ^{2 , 4} ( Şekil 2A ) dorsal kaslarını innerve etmek için uzatır. ISNb motor nöronları ventrolateral kasları 6, 7, 12, 13, 14, 28 ve 30 ^{2 , 4'te} sinirlendirir ( Şekil 2A ve 2B). SNa sinir dalı yanal kasları 5, 8, 21, 22, 23 ve 24 ^{2 , 4'ü} sinirlendirmek için projelendirir ( Şekil 2A ). İki motor aksondan oluşan TN, kas 25'i sinirlendirmek için segmental sınır boyunca ipsilateral olarak projeler ve sinir sisteminde lateral bipolar dendritik nöron (LBD) ile sinapslar oluşturur.Çevre ⁷ ( Şekil 2A ). Bu hedef kas innervasyonları, spesifik seçim noktalarında motor aksonların seçici defasikasyonunu değil, aynı zamanda kasların tanınmasını da gerektirir. Buna ek olarak, ara hedef olarak işlev gören bazı varsayılan mezodermal kılavuz hücreler ISN ve SNa yolaklarında bulunmuştur, ancak ISNb yolu ⁴ boyunca bulunmamıştır. Bu, ISNb motor akson yol bulma yönteminin, ISN ve SNa motor akson rehberliğine kıyasla ayrı bir şekilde düzenlenebileceğini ve aynı zamanda periferik motor akson kılavuzluğunun, tek bir rehberlik işaretinin farklı veya korunmuş rollerini incelemek için çekici bir deneysel model sunduğunu gösterir Molekül ⁸ .

Bu çalışma, Drosophila'daki embriyonik motor nöronların aksonal projeksiyon modellerini görselleştirmek için standart bir yöntem sunmaktadır . Açıklanan protokoller, 1D4 ile lekelenmiş sabit embriyolarınNtibody ile doldurulmuş ve filleted preparatlar için 3,3'-diaminobenzidine (DAB) işlenmiştir. Sabit embriyoların düz preparatlarının kritik bir avantajı, çevresindeki aksonal projeksiyonların ve kas modellerinin daha iyi görselleştirilmesidir. Ayrıca, bu çalışma aynı zamanda istenen mutant embriyoları LacZ boyama yöntemini kullanarak sıralamak için sabit embriyoların genotiplendirilmesini de gösterir.

Protokol

1. Hazırlık

1. 0.5 g sığır serum albümini (BSA) ve 0.5 mL t-Oktilfenoksipolietoksietanol (Malzeme Tablosuna bakınız) 500 mL 1X PBS ilave ederek t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (PBT) çözeltisi ile 500 mL fosfat tamponlu salin (PBS) Ve en az 30 dakika boyunca karıştırma. 4 ° C'de saklayın. Nispeten taze olduğunda kullanın ve çözeltiyi temiz bir şişeye koyun.
2. 2.5 mL% 16 stok paraformaldehid solüsyonu ve 1 mL 10x PBS'den 6.5 mL deiyonize suya 10 mL% 4 paraformaldehit yapın. 4 ° C'de saklayın ve bir hafta içinde kullanın.
   DİKKAT: Son derece toksik olduğu için paraformaldehit çözeltisiyle cilt temasından kaçının.
3. 1 mL DMSO'ya 0.1 g X-Gal substrat eriterek X-gal substratını (dimetil sülfoksit (DMSO) içindeki% 10 a / a vivo X-Gal) olun. -20 ° C'de 100 uL'lik alikotlar halinde saklayın.
4. X-Gal boyama çözeltisi, 10 mM fosfat tamponu (pH 7.2), 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 3 mMK4 [FeII (CN) ₆ ], 3 mM K3 [FeIII (CN) ₆ ] ve% 0.3 t-Oktilfenoksipolietoksietanol. Karanlıkta 4 ° C'de saklayın.
5. % 30 stok hidrojen peroksit 1: 10'u deiyonize su ile seyrelterek% 3 hidrojen peroksit çözeltisi yapın.
6. 1 tablet (10 mg) DAB'yi 35 mL taze PBT solüsyonunda tamamen eriterek 3,3'-diaminobenzidin (DAB) solüsyonu yapın. 0.2 μm şırınga filtresi ile filtre edin ve 910 μL alikotlar halinde -20 ° C'de saklayın.
   DİKKAT: DAB'yi yok etmek için tüm DAB atıklarını çamaşır suyuna atın.
7. Elma suyuyla yumurta plakaları yapın. 2 L'lik bir şişeye 35 g agar ve 1 L deiyonize su ilave edin. 1 L'lik bir şişeye 33 gr sükroz, 2 gr tegosept ve 375 mL elma suyu ekleyin. Otoklav ile 30 dakika boyunca eritin. Her iki çözeltinin de 60 ° C'ye kadar soğumasına izin verin. Birleştirin ve karıştırarak bu çözeltileri iyice karıştırın. 60 mm'lik kültür çanağı başına 11 mL'lik birleşik çözelti dökün.
8. Ekmek mayasının harmanlanarak maya yapıştırın.Iyonu giderilmiş suya (1: 0.8 oranına) sokun ve 4 ° C'de saklayın.

2. Embriyo Koleksiyonu (1. Gün)

1. Genç kadın ve erkek sinekleri (5 günden daha genç) toplayın ve 1-2 gün boyunca, merkezde az miktarda maya macunu içeren bir yumurta plakalı (60 mm x 15 mm) plastik bir beher kafes içinde muhafaza edin.
2. Geç evre-16 embriyolarının optimum koleksiyonu için, yaklaşık 5 PM'de sinekler (> 50) olan bir şişe kafesi kurun ve 3 saat boyunca 25 ° C'de yumurta bırakmalarına izin verin.
3. Sinekleri taze bir yiyecek şişesine aktarın.
4. Kapaklı yumurta plakasını kapatın ve gece boyunca 25 ° C'de nemli bir inkübatör (~% 70 nem) içinde inkübe edin.

3. Bağışıklama için Embriyoların Hazırlanması (2. Gün)

1. 10:20 civarında yumurta plakasına 1.8 mL PBT solüsyonu ilave edin ve eğinirken embriyoları plakadan gevşetmek için pamuk çubuklarını kullanın.
   Not: Bir kottan geçirerek maya hamurunu hafifçe ezerekÜzerinde çok miktarda embriyo bulunması durumunda çözülür. Embriyoların toplanmasına 40 dakika önce başlayın (11: 00 civarında).
2. 1 mL pipet ucu kullanarak yumurta plakasından embriyoları 1.5 mL'lik bir mikrotube'ye aktarın.
3. Embriyoların yerleşmesine ve PBT özümünü olabildiğince aspire etmesine izin verin. Embriyoları iki kez 1 mL PBT çözeltisi ile durulayın. PBT çözümünü olabildiğince aspire.
4. Tüp 1 mL% 50 ağartma maddesi ( yani, deiyonize suda seyreltilmiş) ile doldurun ve oda sıcaklığında (RT) 3 dakika süreyle bir nutatorda inkübe ederek embriyoları dechorionate edin.
   Not: Bu adım, delinmiş embriyoları öldürmez.
5. Dechorionated embriyoların çökmesine izin verin, mümkün olduğu kadar% 50 çamaşır suyu aspire edin ve embriyoları 3 mL PBT solüsyonuyla 3 kez yıkayın.
6. 0,5 mL heptan ilave edin ve sonra saat 11:00 civarında RT'de 0.5 mL% 4 paraformaldehid solüsyonu tüpün üzerine ilave edin.
7. Kuluçkaya yatırRT'de 15 dakika süreyle bir besleyici üzerinde embriyolar.
8. % 4 paraformaldehit solüsyonunu (alt tabaka) çıkarın.
9. 0.5 mL% 100 metanol ekleyin ve embriyoları, tüpü 30 saniye şiddetle sallayarak devitellellize edin.
10. Heptanı çıkarın ( örn . Üst katman).
11. 0.5 mL% 100 metanol ilave edin ve tüpü 10 saniye şiddetle çalkalayın.
12. Tüpe dokunarak embriyoların yerleşmesini bekleyin ve metanolü olabildiğince aspire edin. Embriyoları 10 mL'den daha az süreyle sallayarak 1 mL% 100 metanolle durulayın.
    Not: Metanole artan maruz kalma, β-Gal aktivitesini yok eder.
13. Metanolü çıkarın ve 1 mL'lik PBT çözeltisi ile 3 kez devitellize edilmiş embriyoları durulayın.

4. LacZ Boyama Kullanarak Embriyoların Genotiplendirilmesi (2. Gün)

1. Tüp 1 mL PBT çözeltisi ekleyin ve 15 dakika boyunca 37 ° C ısı bloğu veya su banyosu tüp inkübe edin.
2. Kuluçka sırasında, X-Gal boyama solüsyonu (1 mL / dakika)Olmak) 65 ° C'de bir su banyosunda bulanık olana kadar. 37 ° C su banyosunda inkübe edin.
3. PBT solüsyonunu aspire edin ve 1 mL X-Gal boyama solüsyonu ve 20 uL X-Gal substratını tüp üzerine ilave edin.
4. Mavi bir çökelti belirinceye kadar, tüp 37 ° C'de nutrasyonla inkübe edin.
   Not: Genel olarak ^2. ve ^3. mavi dengeleyiciler için kuluçka süresi 2-4 saat arasındadır.
5. X-Gal boyama çözeltisini çıkarın ve 1 mL RT PBT solüsyonuyla embriyoları 3 kez durulayın.
6. Bir iğne probu veya forseps kullanarak, istenilen genotip embriyolarını ( örneğin, lekelenmemiş beyaz embriyolar) hafif bir kesit mikroskopu (1.6X-2.5X hedefler) ile elle sıralayın.
   Not: CyO, aktin-LacZ ve TM3, aktin-LacZ gibi bazı mavi dengeleyiciler, aktin promotörünün kontrolü altında bakteriyel β-Gal (LacZ) eksprese eden transgenik bir yapı taşıdıklarından, embriyolar maviye boyalı olarakBir veya iki kopya mavi dengeleyici kromozom. Bu nedenle, lekelenmemiş beyaz embriyolar arzu edilen öldürücü alel için homozigot olurlar.

5. Embriyoların Anti-Fasciclin II Antikorları ile İmmunotainedasyonu (2. Gün - Gün)

1. 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak, istenen genotip embriyolarını ( yani, lekelenmemiş beyaz embriyolar) 0.5 mL'lik bir mikro tüpe toplayın ve aktarın.
   Not: Bu adımda, embriyolar, kabuk makinesinin bölümleme şekilleri ve kafa ve kuyruk ^9'un yapıları da dahil olmak üzere morfolojik kriterlere göre kabaca aşamalandırılabilir. Kafa involüsyonu sırasında, yumurtalar atıldıktan 10 ila 16 saat sonra embriyo, en ön segment ^9'da belirgin bir azalmaya uğrar.
2. Embriyoları bir kez 0.4 mL PBT solüsyonu ile yıkayın ve 0.3 mL engelleyici solüsyon (PBT solüsyonunda% 5 normal keçi serumu ve% 5 DMSO) ilave edin.
3. RT'de 15 dakika boyunca nutasyon ile embriyoları bloke edin.
4. 75 uL anti-Fasciclin II antikoru ekleyin ve gece boyunca oda sıcaklığında tübü nutasyonla inkübe edin.
5. Embriyoları yıkama başına en az 20 dakika süreyle 0.4 mL PBT solüsyonuyla 4 kez yıkayın.
6. Keçi anti-fare-HRP antikoru (2 ug / mL) içeren engelleyici solüsyonun (PBT solüsyonunda% 5 normal keçi serumu) 0.3 mL ekleyin ve oda sıcaklığında gece boyunca kuluçka ile tübü inkübe edin.
7. Embriyoları, yıkama başına en az 20 dakika süreyle 0.4 mL PBT solüsyonuyla 6 kez yıkayın.
8. Tüp 0.3 mL DAB çözeltisi ekleyin.
   DİKKAT: Eldiven takın ve tüm DAB atıkları / tüpleri / uçları çamaşır suyuna koyun.
9. 2 μL% 3 hidrojen peroksit ekleyin ve istenen miktarda çökelti oluşana kadar RT'de nutasyonla tüpü karanlıkta inkübe edin.
   Not: Genellikle 1D4 immünhistokimyasının kuluçka süresi 0.5-1 saat arasında değişir.
10. Embriyoları 0.4 mL PBT solüsyonuyla 4 kez yıkayın.
    DİKKAT: DAB özümünü ve ilk iki yıkamayı bir pipet ve di ile çıkarınOnları çamaşır suyu ile çöpe atın.
11. Tüpe 0.2 mL% 70 gliserol / PBS solüsyonu ilave edin ve oda sıcaklığında veya 4 ° C'de saklayın.
    Not: Tüpü ışıktan uzak tutun. Embriyoları% 90 gliserol / PBS solüsyonu 10 koyarak daha net preparatlar elde edilebilir. Bununla birlikte,% 70 gliserol / PBS solüsyonu 10'da temizlenenlerden% 90 gliserol / PBS solüsyonu ile temizlenen embriyoları incelemek daha zordur.

6. Embriyoların Evrelendirilmesi, Kesilmesi, Monte Edilmesi ve Görüntülenmesi (4. Gün)

1. Evreleme için,% 70 gliserol / PBS ile dengelenmiş embriyoları bir cam slayta aktarın.
2. Abdominal segment 7 (A7), A8 ve A9 ISN sinirleri birbirine değmek veya / ve orta virüslerden üç banda bölünmüş yakın evre-16 embriyolarını toplayın.
   Not: 1D4 antikoru ile lekelenmiş embriyolar, ISN ve ISNb motor aksonlarının izdüşüm modellerine dayanarak düzenlenebilir. CNS'den çıktıktan sonra A7, A8 ve A9 ISN neGeç evre-16 embriyolarının rfleri birbirine değmek için birleşir ve daha sonra dorsal kaslara kadar genişlemek için ayrılırlar ( Şekil İA'daki ok ucu). Bununla birlikte, orta-evre-16 embriyolarında, A7 ISN sinirleri A8 / A9 sinirleri ile paralel uzanır ( Şekil 1B'deki köşeli parantez). Buna ek olarak, her iki hemizyondaki A6 ISNb sinirlerinin (ventrolateral kaslara dik olan) projeksiyon eksenleri, MSS longitudinal akson fasiküllerinin posterior ucu ile hizalıdır (oklar ve Şekil 1C'deki bir çizgi). Bu morfolojik kriterler, farklı genotipler arasında biraz değişir. Alternatif olarak, embriyolar bağırsak morfolojisi ^{9 , 11} temel alınarak yapılabilir. 17 no'lu evreye kadar orta bağırsağın kalp benzeri bir şekli var, oysa orta bağırsak 17 no'lu evreye göre üç gruba ayrılmıştır.
3. Embriyoları parçalayın.
   1. 1 m kullanmaL şırınga ile, her embriyo gliserol damlasının dışına alın ve embriyonun ventral yüzü yukarı gelecek şekilde yerleştirin. Vücut uzunluğunun 1/4 ve motor aksonlardan arındırılmış en arka bölgede ön kısmı kesin.
   2. Bir iğne probu kullanarak, uç kesilmiş embriyonu gliserol damlasından dışarıya doğru çekin, sırt üste gelecek şekilde yönlendirin ve tarlaya yatay olarak yerleştirin.
      Not: Embriyo gliserol damlasının dışına taşındığında, embriyo ile ilişkili bir miktar gliserol yapışkan yapar.
   3. Tek bir çok ince tungsten iğne ¹³ kullanarak dorsal orta hat boyunca embriyo kesin. Embriyonun arka ucunda küçük bir kesim yapın ve sonra anteriora doğru dorsal orta çizgiyi kesmeye devam edin; Ters yönde kesmek de iyidir.
   4. Bir iğne probu kullanarak, orta hat kesilmiş embriyonu gliserol damlasına getirin, sırt üste gelecek şekilde yerleştirin ve vücut duvarlarını ventrolateral (çapraz) yönde açarak gutu vücut duvarından ayırın (2.5X nesnel).
      Not: Dorsal orta çizginin tamamen kesildiğinden emin olun, böylece sağ ve sol vücut duvarları arasında tamamen ayrılır.
   5. Orta hat kesilmiş embriyonu gliserol damlasından dikkatlice ayırın ve daha sonra ince bir iğne probu (2.5X objektif) kullanarak vücut duvarının iki kapağını cam slayt üzerine yatırın.
   6. Çok ince bir tungsten iğne kullanarak, iç organları parçalanmış embriyodan yana doğru iterek çıkarın (5X objektif).
      Not: Başka bir benzer diseksiyon prosedürünün daha ayrıntılı bir açıklaması web sitesinde bulunabilir ⁵ .
4. Montaj için, temizlemek için iki kez% 70 gliserol / PBS solüsyonu ilave edin ve ince bir iğne probu kullanarak,% 70 gliserol / PBS solüsyonunun 8 uL'sinin üzerine serpilen yeni bir cam slayt haline getirin. Merkez (2.5X objektif).
5. Bir lamel koyun (18 mm x 18 mm). Lamel kenarlarını düzenli tırnak cilasıyla sızdırmaz hale getirin (ya daAçık veya renkli iyi).
6. Üreticinin talimatlarına göre, diferansiyel interferans kontrastlı (DIC) ışık mikroskopu altında yüksek çözünürlükte (20X, 40X ve 63X yağ ile daldırma hedefleri) görüntü yakalama.
   Not: Özellikle ISNb motor aksonları için daha iyi görselleştirme ve fenotipik karakterizasyon, 63X yağ daldırmalı bir objektif kullanılarak üretilebilir.

Sonuçlar

Sinir gelişiminde motor aksonlar ve hedef kaslar arasındaki kesin bağlantılar, seçici akson akson iticiliğine ve belirli seçim noktalarında hedef tanımaya bağlıdır. Drosophila'da , motor aksonlar arasındaki seçici itme , Sema-1a, Sema-2a ve Sema-2b ^{8 , 14 , 15 , 16 , 17 ,}

Tartışmalar

Motor akson rehberliğinde kusurların ayrıntıları, DAB lekeli embriyoların örtülü hazırlanmasıyla, flüoresan etiketli olanların konfokal mikroskobunda lazer taramasından daha hızlı ve daha doğru bir şekilde skorlanır. Dolayısıyla, sabit ve 1D4 ile boyanmış embriyoların dolgulu hazırlanması en iyi kılavuzluk ipucu moleküllerinin fonksiyonel karakterizasyonu için uygundur. Netrinler, Yarıklar, semaforinler (Semas) ve efrinler ile bunların ortak kökenli reseptörleri de dahil olmak üzere dö...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
16% Paraformaldehyde Solution	Ted Pella	18505
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5405
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	30435
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	71500
X-Gal Substrate	US Biological	X1000	X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)
Dimethyl Sulfxide	Sigma-Aldrich	D4540
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	Sigma-Aldrich	P9387
Potassium hexacyanoferrate(III)	Sigma-Aldrich	244023
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich	216763
3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride	Sigma-Aldrich	D5905
Agar	US Biological	A0930
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3
Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)	Sigma-Aldrich	H5501
Culture Dish (60 mm)	Corning	430166
Tricon Beaker	Simport	B700-100	This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.
Yeast	Societe Industrielle Lesaffre	Saf Instant Yeast Red
Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)	VWR	14220-263
Eppendorf Tube (1.5 ml)	Sarstedt	#72.690
Bleach	The Clorox Company	Clorox
Heptane	Sigma-Aldrich	246654
Methanol	J.T. Baker	UN1230
Normal Goat Serum	Life Technologies	16210-064
Anti-FasciculinII Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	1D4 anti-Fasciclin II
Goat Anti-mouse-HRP Antibody	Jackson Immunoresearch	115-006-068	AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Slide Glass	Duran Group	235501403
Coverslip	Duran Group	235503104	18 x 18 mm
1 ml Syringe	Becton Dickinson Medical(s)	301321
Tungsten Needle	Ted Pella	#27-11	Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.)
Nutator (Mini twister)	Korean Science	KO.VS-96TWS	Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)