Dilim yama klemp tekniği öğrenme kaynaklı plastisite analiz etmek için

Özet

Dilim yama klemp tekniği içsel özelliklerini ve uyarıcı ya da inhibitör sinapslarda plastisite öğrenme kaynaklı değişiklikleri analiz etmek için etkili bir yöntemdir.

Özet

Dilim yama klemp tekniği öğrenme kaynaklı nöral plastisite belirli beyin bölgelerinde soruşturma için güçlü bir araçtır. Motor-öğrenme indüklenen plastisite analiz etmek, fareler bir hızlandırılmış rotor çubuk görev kullanarak eğitimli. Fareler görev için 1 veya 2 gün 10 kat 30-s aralıklarla gerçekleştirilebilir. Performans önemli ölçüde ilk mahkemeye göre eğitim gün düzelmiştir. Sonra birincil motor korteks (M1) dilim akut beyin de, eğitimsiz ve eğitimli fareler hazırladık. Geçerli-kelepçe analiz membran potansiyeli, spike eşik, afterhyperpolarization ve membran direnç Katman II/III piramidal nöronların dinlenme dinamik değişiklikler gösterdi. Geçerli enjeksiyon birçok spikes Sıçanlarda 2 günlük eğitimli eğitimsiz denetimlerde indüklenen.

Bağlamsal öğrenme indüklenen plastisite analiz etmek, fareler bir inhibitör kaçınma (IA) görev kullanarak eğitimli. Ayak-bir kutu karanlık tarafına şokta ettikten sonra fareler, ışıklı yan kalmayı önlemek öğrendim. Eğitimsiz, IA eğitimli, unpaired akut Hipokampal dilimleri ve gözden geçirme fareler hazırladık. Gerilim Tipi Kelepçe analizi sırayla minyatür eksitatör ve inhibitör postsinaptik akımlardan (mEPSCs ve mIPSCs) aynı CA1 nöron kaydetmek için kullanıldı. Biz her neuron onun eksitatör ve inhibitör sinapslarda farklı postsinaptik güçlü olduğunu düşündüren her CA1 nöron farklı ortalama mEPSC ve mIPSC genlikleri bulundu. Ayrıca, eğitimsiz denetimleri ile karşılaştırıldığında, IA eğitimli fareler geniş çeşitlilik ile daha yüksek mEPSC ve mIPSC genlikleri vardı. Bu sonuçlar bağlamsal öğrenme eksitatör ve inhibitör sinapslarda her CA1 neuron adlı postsinaptik çeşitlilik oluşturur önerdi.

Banyo tedavisi ile CNQX beri postsinaptik akımları, arabuluculuk AMPA veya GABA_A reseptörleri görünüyordu veya bicuculline mEPSC veya mIPSC olaylar sırasıyla engellenebilir. Bu teknik öğrenme duyusal korteks ve amigdala gibi diğer bölgelerde, farklı türde eğitim için kullanılabilir.

Giriş

Neher ve Sakmann, tarafından geliştirilen yama klemp tekniği Elektrofizyolojik deneyleri¹için yaygın olarak kullanmıştır. Bütün hücre yama klemp tekniği² hücre içi akım veya gerilim hücre zarının gigaohm mühür kullanarak kaydetmek için kullanılabilir. Geçerli-klemp tekniği potansiyeli, direnç ve kapasite³dinlenme gibi membran özelliklerindeki farklılıklar analiz için bize izin verir. Gerilim-klemp tekniği öğrenme kaynaklı sinaptik plastisite eksitatör ve inhibitör sinapslarda, analiz için bize izin verir.

Primer motor korteks (M1) yetenekli gönüllü hareketleri yapmak için önemlidir merkezi bir bölgedir. Önceki Elektrofizyolojik çalışmalar gösterdi uzun vadeli kullanılmasının muhtemelen (LTP) gelişimi-II/III eksitatör synapses yetenekli motor eğitim⁴' ten sonra katmanda plastisite hangi tarihlerde. Ayrıca, in vivo çalışmalar daha fazla Imaging M1 dendritik omurgalar bir yetenekli ulaşan görev^5,6sonra modelleme gösterdi. Ancak, öğrenme kaynaklı sinaptik ve içsel plastisite M1 nöronlarda gösterilmedi.

Biz son zamanlarda bir rotor çubuk görev glutamatergic dinamik değişiklikleri terfi ve GABAergic synapses ve M1 Katman II/III nöronlar⁷içsel plastisite değişmiş bildirdi. Burada biz öğrenme kaynaklı plastisite araştırmak için dilim yama klemp tekniği kullanılır. Bu teknik deneyim bağımlı plastisite diğer beyin bölgeleri diğer türleri araştırmak için de kullanılabilir. Örneğin, varil korteks duyusal girdi AMPA reseptör aracılı eksitatör giriş Katman II/III nöronlar⁸içine güçlendirebilir ve hangi için gereklidir yanal amigdala nöronlar üzerine eksitatör girdileri cued korku Klima güçlendirir bellek⁹korku. Ayrıca, bağlamsal öğrenme Hipokampal CA1 nöronlar^10,11eksitatör ve inhibitör sinaptik girdi açısından çeşitlilik oluşturur.

Protokol

tüm hayvan konut ve cerrahi işlemler hayvan deney, Yamaguchi Üniversitesi Tıp Fakültesi için kurallar uyarınca vardı ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Yamaguchi Komitesi tarafından kabul edildi Üniversite.

1. hayvanlar

1. 4 - için 5-hafta-yaşlı erkek Sprague-Dawley Rat (yaş doğum sonrası 28-31 gün) kullanın.
2. (23 ° C ± 1 ° C) sabit bir sıcaklıkta muhafaza fareler içinde bireysel plastik kafes (40 cm × 25 cm × 25 cm) bir 12-h ışık/karanlık döngü altında ev. Fareler su ve yiyecek için ad libitum erişim vermek.

2. Rotor çubuk testi

motor beceri öğrenme, her fare konu rotor çubuk testi için araştırmak için
1. (çubuk çapı 7 cm; lane genişliği 8.9 cm; düşme yüksekliği 26.7 cm) 1 veya 2 gün üst üste için ( şekil 1A, Kida vd., 2016 < sup sınıf "xref" = > 7). Bir sessiz, ısı kontrollü Oda (23 ± 1 ° C) görevi. Rahatsız veya işlemek önce test fareler değil
2. Rotor çubuk hangi 4 rotasyonlar/dak 40 rotasyonlar/dk (8 π/dk. 80 π/dk) 5 dak üzerinden doğrusal olarak artar ivme moduna ayarla
3. Dinlenme dönen çubuk üzerinde fare koymak. Bütün uzuvları çubuk üzerinde olduğundan emin olun.
4. Motor performansını değerlendirmek için dönen rod düşmeye gecikme süresi ölçü birimi.
5. 10 girişimleri (deneme) 30-s aralıklarla her fare izin.
6. Fareyi dönen rod düşerse, bir daha sonra bir 10-20 s aralığı çubuk üzerinde ayarla.
7. Fentobarbital (400 mg/kg) aşırı dozda fareyle 30 dk sonra final deneme kurban. Anestezi ev onların kafes içinde aynı doz ile eğitimsiz kontrol fareler enjekte.

3. İnhibitör kaçınma test

bir inhibitör kaçınma (IA) testi ( şekil 1 d, Mitsushima vd., 2011, 2013 ^{10 ,} için konu sıçanlar bağlamsal öğrenme, araştırmak için

1. ¹¹) kaçının denemenin gibi gün herhangi bir epizodik deneyimlerini başkaları ile kafes değişiklikleri veya temizlik başvurun. Bir sessiz, ısı kontrollü Oda (23 ± 1 ° C) görevi.
   Not: IA eğitim cihazları bir iki odalı akrilik kutusudur (uzunluğu 33 cm; genişlik 58 cm; yüksekliği 33 cm). Işıklı bir kenarda ve bir tuzak kapı ( şekil 1 d) tarafından ayrılmış bir karanlık şok tarafı vardır.
2. Fareyi ışıklı kutusu (ışıklı) güvenli tarafına yerleştirin. Fareyi yavaşça stres olmadan ele.
3. Kısa bir süre bekleyin (10 ile 20 s) fareyi çevreye alışmana için.
4. Fareyi diledikleri koyu kutu girmek izin vermek için kayar kapı açın.
Fare kutusunun roman karanlık tarafında girmeden önce
5. (s) gecikme süresi ölçü birimi. İlk deneme gecikme sıçan temsil eder ' s performans başlamadan önce eğitim.
6. Karanlık yüzü girmesinden sonra kapıyı kapat ve bir şifreli elektrik ayak şok uygulayın (2 s, 1.6 mA) yolu ile elektrik çelik çubuklar kutu zemine ayarla. Gözden geçirme fareler eğitim cihazları olmadan 1dk şok için keşfetmek izin. Ev unpaired fareler bir ışıklı şok kafes için birkaç gün ve aniden epizodik deneyimleri olmadan şok ver. Yavaşça herhangi bir grupta stres olmadan ele.
7. Koyu kutu 10 için her fare tutmak için ev kafes dönmeden önce s.
8. , 30 dk ayak şok sonra tekrar kutusunun tarafından ışıklı fare yerleştirin. Karanlık tarafa girmek için gecikme süresi ölçü birimi.
9. Sıçan eve kafes dönmek.
10. , 60 dakika sonra şok, kurban Fentobarbital (400 mg/kg) aşırı dozda fareyle. Fareyi yavaşça işlemek ve anestezi intraperitoneally enjekte. Eğitimsiz kontrol fareler, yukarıda açıklanan deneyimi olmayan onların ev kafeslerde anestezi enjekte.

4. Diseksiyon arabellek

1. erimesi kristalleri 0.195 g NaH ₂ PO ₄-2 H ₂ O, 0,188 g KCl 0,074 g CaCl ₂ 1.423 g MgCl ₂-6 H ₂ O ve 12.579 g Kolin klorür ultrasaf su (950 ml 900 mL) . Bkz. Tablo 1.
2. Erimesi kristalleri 2.340 g askorbik asit, 0.342 g Pirüvik asit sodyum tuzu, 2,100 g NaHCO ₃ ve 4.500 g glikoz.
3. Ekle 1000 mL su. Aralığında ise osmolalite aralığını 290 mOsm/L ve 300 mOsm/l ayarlama osmolalite ultrasaf su ekleyerek olacak.
4. % 5 CO ₂ Çözümle kabarcık / %95 O ₂ gaz karışımı kullanmadan önce 5 min için buz gibi soğuk sıcaklıklarda.

5. Yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF)

1. erime kristalleri 0,186 g KCl, 6.700 g NaCl ve 0,156 g NaH ₂ PO ₄-2 H ₂ O ultrasaf su (950 ml 900 mL). Bkz. Tablo 2.
2. Kabarcık gaz karışımı 5 dakika süreyle ile
3. Erimesi kristalleri 1.800 g glikoz ve 2.184 g NaHCO ₃ ve 4 mL MgCl ₂ ve 4 mL CaCl ₂ den 1 M stok çözümleri ekleyin.
4. Ekle 1000 mL su. Aralığında ise osmolalite aralığını 290 mOsm/L ve 295 mOsm/l ayarlama osmolalite ultrasaf su ekleyerek olacak.
5. Kullanmadan önce gaz karışımı ile kabarcık.

6. Hücre içi çözümler

1. 0.0746 g KCl akım tipi kelepçe kayıtları (Tablo 3), dağıtılması için 6.089 g K-glukonat, 0.476 g HEPES, 0.0456 g EGTA ve 500 µL MgCl ₂ 1 M den 180 mL ultrasaf su çözümde stok (pH 7.2 KOH ile için ayarlayın).
   1. 0.4408 g Na ₂ - ATP, 0.0418 g Na ₃ - GTP ve 0.510 g Na-phosphocreatine ekleyin. 200 mL su ekleyip 7,35 KOH ile pH ayarlama.
   2. İçin yaklaşık 290 mOsm/L osmolalite ultrasaf su ekleyerek ayarlayın.
   3. Deposu olarak 1 mL aliquots dondurucu (-30 ° C).
2. Gerilim tipi kelepçe kayıtları (Tablo 4), dağıtılması için 5.244 g CsMeSO ₃, 0.672 g CsCl, HEPES 0.476 g, 0.0456 g EGTA ve 500 µL MgCl ₂ 1 M den 180 mL ultrasaf su çözümlerinde stok. PH 7.2 ile CsOH için ayarlayın. MEPSP ve mIPSP kayıtları değiştirilmiş yoğunlukta 5.814 g CsMeSO ₃ ve 0,252 g CsCl GABA _A reseptör yanıt ¹¹ ters potansiyelini ayarlamak için kullanın.
   1. 0.4408 g Na ₂ - ATP, 0.0418 g Na ₃ - GTP ve 0.510 g Na-phosphocreatine ekleyin. 200 mL su ekleyip 7,35 CsOH ile pH ayarlama.
   2. İçin yaklaşık 290 mOsm/L osmolalite ultrasaf su ekleyerek ayarlayın.
   3. Deposu olarak 1 mL aliquots dondurucu (-30 ° C).

7. Dilim hazırlık

feda, ezilmiş buz ( şekil 2A) tüm diseksiyon araçları Soğuma

önceden

. Yaklaşık 500 mL soğuk su temas yüzey alanı artırmak için ezilmiş buz kap içine ekleyin. Bu yordamı tanımlanmıştır daha önce ^{10 , 11 , 12}.
Not: Kullanılan araçlardır burada: büyük makas, Iris makas, bir spatula, bir mikro spatula, forseps, cımbız, paslanmaz çelik 200 mL kabı, kırpma, diseksiyon arabellek gaz karışımı ile tedavi ile dolu bir 120 mL kardiyak perfüzyon şırınga beyin için bir bıçak bir Silikon tüp (20 cm) bağlı bir paslanmaz beyin diseksiyon sahne bir düzleştirilmiş 18'lik iğne (kalınlığı 3 mm, ϕ = = 12 cm) ve vibratome için bir montaj sahne (ϕ = 5 cm).
1. Fentobarbital (400 mg/kg vücut ağırlığı) aşırı dozda anesthetizing tarafından davranış paradigma tamamladıktan sonra 30 dk sıçan kurban. Hızla dilimleri olanaklı ^{10 , 11 , 12} olarak sağlıklı olduğundan emin olmak için dilim hazırlık gerçekleştirin. Beyin NGEylem iletişim kuralı için Üniversitemiz tüm hayvan hastalıklarıyla ilgili standartları karşıladığından.
2. Buz gibi diseksiyon arabellek (tablo 1) 120 mL şırınga bubbled ile % 5 CO ₂ dolgu / %95 O ₂ gaz karışımı. Herhangi bir hava kabarcıkları perfüzyon önce kaldırmak.
3. Kalp açığa sonra iğne sol ventrikül arka kısmına takın.
4. Gerçekleştirme transcardial perfüzyon şırınga kullanarak el ile beyin. Büyük sıçanlar perfüzyon için daha fazla diseksiyon arabellek gerektirir. 5 dk. kabarcık arabellek için buz gibi diseksiyon arabellek ile beyin sürekli olarak Dalma sırasında daldırın.
5. Bir açı paralel olarak bir bıçak kullanarak hedef kortikal bölgenin dendritik yönünü, beyin arka tarafında kırpın. Beyin ayakta beri kesme son alt diseksiyon sahnede, başlangıç açı tüm sonraki beyin dilimler açısını belirler. Bu adım kritik düzeyde önemli ( şekil 2B) olduğunu. Yanlış bir açı ile hedef piramidal nöronların kesebilir.
   Not: Kullanılan araçlardır burada: beyin düzeltme için bir bıçak, bir filtre kağıdı (ϕ = 10 cm), bir paslanmaz beyin diseksiyon sahne (kalınlığı 3 mm, ϕ = = 12 cm), bir spatula, bir yapıştırıcı, bir damlalık ve vibratome için bir montaj sahne (ϕ = 5 cm).
6. 350 µm bir vibratome kullanarak kalın koronal beyin dilimler kesin. Buz gibi soğuk arabellek ile diseksiyon odası bubbled ile % 5 CO ₂ dolgu / %95 O ₂ gaz karışımı ( şekil 2C). Sürekli olarak beyin dilim sırasında arabellek kabarcık.
7. Iris makas kullanarak hedef alan çevre trim.
8. Oda sıcaklığında aCSF hafifçe kesilmiş dilimleri bubbled %95 / % 5 CO ₂ yıkama O ₂ (Tablo 2).
9. Koru kesilmiş dilimleri kayıt olana bir arayüz odasında ( şekil 2B ve E) uygulandı. Kuluçka odasında 1 h için hücreleri durumunu artırır, ancak dilimleri için daha--dan 10 saat inkübe fenotipleri değiştirin. Gazlar aldığınızdan odası kapağını kapatın ve küçük sıvı aCSF damla.

8. Bütün hücre yama kelepçe

Not: Bütün hücreli kayıtları bir amplifikatör ve 5 kHz bir kesme frekansına ayarla bir alçak geçiren Filtre gerektirir. Sinyalleri dijital ve bir PC'de depolanan. Saklı veri analiz çevrimdışı ( şekil 3A).

1. Bir yatay çektirmenin kullanarak oluştur cam elektrotlar. Uygun bir çözüm (Tablo 3 ve 4) elektrotlar doldurmak normal polietilen 1 mL şırınga kullanarak bağlı bir ince cam tüp ve 0,22-µm filtrenin.
2. Hücre ile ilgili kişi önce pozitif basınç korumak ve pipet sıfır olarak geçerli ayarlayın.
3. Bir gigaohm mühür şekillendirme sonra hücre zarının ( şekil 3F yapılandırmada bütün hücreli) rüptürü için negatif basınç uygulayın.

9. Geçerli-kelepçe analiz

hücre zarı

1. 1. özelliklerini Pipetler için geçerli-kelepçe kayıtları (Tablo 3) hücre içi çözüm ile kayıt yama doldurun. 4 MΩ ve aCSF 7 MΩ pipet dayanıklılığını arasındadır.
   Membran yırtığı sonra
   2. tutun membran gerilim -60 mV V-kelepçe modunda. Daha sonra geçiş " banyo " moduna " hücre " membran kapasitans, direnç ve zaman sabit gibi iç hücre özelliklerini ölçmek için yazılımı kullanma membran test modunda.
2. Enjeksiyon çalışmada
   1. iç hücre özelliklerini kaydettikten sonra V-kelepçe modundan izlenecek geçer (Ben = 0) geçerli enjeksiyon için /I-CLAMP NORMAL. Sıvı kavşak potansiyel düzeltilmiş ¹⁰ olmaması gerektiğini unutmayın.
   2. Enjekte için 300 Bayan hücreye geçerli değiştirmek--dan kademeli akım yoğunluğu − 100 pA +550 PA ile 50-pA artar. Geçerli enjeksiyonları tarafından elde edildi sivri (Aksiyon potansiyelleri) saymak.
   3. Bir aksiyon potansiyeli (bu eşik gerilimi) ikna etmek için gerekli minimum gerilim ölçmek.
   4. Afterhyperpolarization genlik spike başlatma, gerilim ve afterhyperpolarization ⁷ sırasında elde en düşük fiyat voltajı arasındaki fark olarak hesaplar.

10. Gerilim Tipi Kelepçe analizi

1. AMPA/NMDA oranı
   Not: AMPA/NMDA oranı glutamatergic eksitatör sinapslarda ^{7 , 8} postsinaptik plastisite değerlendirmek için geleneksel bir yoludur ^{, 9 , 10 , 11}. ancak, her iki bileşenin eşlik eden artış oranı ¹³ değil değişebilir.
   1. Perfuse kayıt odası fizyolojik solüsyonu ile gaz karışımı bubbled ve sıcaklığı 22 ° c ile 25 ° C. Ekle 0,1 mM picrotoxin - yanıt aracılı ve 4 µM 2 eklemek - GABA _A engellemek için belgili tanımlık eriyik için korumak uyarılmış nöral yanıt ¹⁴ dengelemeye chloroadenosine.
   2. Doldurmak Pipetler Gerilim Tipi Kelepçe için hücre içi çözüm ile kayıt düzeltme kayıtları (Tablo 4). ACSF kayıt pipet direnç kontrol edin. 4 MΩ ve 7 MΩ arasında dirençtir.
   3. Kayıt için Katman II/III piramidal nöronların M1, manik depresif bir tungsten elektrot 200 µm 300 µm lateral hücrelere forelimb temsil bölgesinde pial yüzeyden kaydedilmesi için uyarıcı yerleştirin (2 mm yükseklik orta hat) ^{15 , 16 , 17}.
   4. CA1 piramit nöron kayıt için 300 µm lateral (Schaffer teminat fiber) için uyarıcı elektrot 200 µm yerleştirin veya medial (temporoammonic yolu)-ecek var olmak hücreleri için kaydedilen ( şekil 3B).
   5. Sinaptik yanıt kadar uyarıcı yoğunluk artmak > 10 baba.
   6. Hesaplamak AMPA/NMDA oranı maksimum akım oranı, ölçülen − 60 mV geçerli ölçülen + 40 mV 150 MSN uyarıcı başlangıçlı sonra. 50-100 izlemeler oranını hesaplamak için ortalama unutmayın.
2. Minyatür postsinaptik geçerli kayıtları
   Not: minyatür eksitatör postsinaptik akımları (mEPSCs) Glutamat tek bir vezikül presynaptic yayın tarafından elde edildi yanıt karşılık düşünülmektedir ¹⁸ . Buna ek olarak, minyatür inhibitör postsinaptik akımları (mIPSCs) tek bir vezikül GABA ¹⁸ presynaptic yayın tarafından elde edildi yanıt karşılık düşünülmektedir. MEPSCs ve mIPSCs genlikleri artışlar yansıtır frekans yansıtmak halinde fonksiyonel sinapslarda veya presynaptic yayın olasılık sayısını artışlar postsinaptik iletim, güçlendirilmesi artar ¹¹ .
   1. Yama kayıt pipet ile değiştirilmiş hücre içi çözüm (Tablo 4) GABA _A reseptör aracılı CARI ters potansiyelini ayarlamak için -60 doldurmak mV.
   2. Ekle 0,5 µM Tetradotoksin spontan aksiyon potansiyelleri engellemek için Bath'a.
   3. Tutun -60, gerilim mV rSlayt 5 dakika süreyle mEPSC olaylar
   5 min için kayıt mIPSC olaylara
   4. değişim 0 olarak potansiyel holding mV. Çünkü M1 nöronlar biraz daha yüksek ters AMPA reseptör aracılı akımlar için potansiyel göstermek, mIPSCs M1 nöronların + 15 kaydedilir 0,1 mM APV ile mV.
   5. Akım stabilize etmek için birkaç dakika bekleyin.
   6. 5 dakika süreyle mIPSC olayları kaydetmek
   7. Yazılım kullanarak minyatür olayları algılamak ve olaylar 10 pA üzerinde çözümleme için kullanın. MEPSCs veya mIPSCs olay sıklığını belirlemek 5 min için sayma. Ortalama ortalama genlik elde etmek için olaylar genlikleri.
   8. Banyo tedavisi ile 10 µM CNQX veya 10 µM bicuculline methiodide ile mEPSCs ve mIPSCs olaylar sırasıyla engeller olup olmadığını onaylamak.
3. Çiftli-pulse analizi
   Not: Presynaptic plastisite analiz eşleştirilmiş-pulse analizi kullanarak. GABA sürümünden olasılık ^{7 , 10 , 11} veya eşleştirilmiş-darbe oranı artış presynaptic Glutamat bir düşüş göstermektedir.
   1. Eksitatör sinapslarda analiz, 0,1 mM picrotoxin eklemek ve -60, yanıtı kaydettikten mV. Banyoya 4 µM 2-chloroadenosine eklediğimiz rağmen biz ilaç presynaptic yayın olasılık ¹⁴ etkiler göz önünde bulundurun gerekir.
   İnhibitör sinapslarda, analiz etmek için
   2. 0,1 mM APV ve 4 µM 2-chloroadenosine banyoya ekleyin ve 0, yanıtı kaydettikten mV. M1 nöronlarda + 15, yanıtı kaydettikten mV.
   3. 100 ms veya 200 Bayan arası uyarıcı aralığı ile eşleştirilmiş darbeleri uygulamak
   4. 50-100 sıralı izleri her potansiyel tutarak, kaydetmek ve değerlerin ortalamasını.
   5. İlk tepeye kadar postsinaptik geçerli ikinci en yüksek oranı olarak eşleştirilmiş nabız oranını hesaplamak.

Sonuçlar

Biz son zamanlarda⁷açıklandığı gibi rotor çubuk eğitim (şekil 1A) dinamik değişiklikleri M1 Katman II/III piramidal nöronların içsel plastisite indüklenen. Fareler--dan dönen rod düşmek kadar gecikme süresi ölçme sıçan yetenekli öğrenme performansını tahmin etmek için bize izin verir. Uzun gecikme süresi daha iyi motor performansı gösterir. Duruşma sona erdi kadar eğitim günü 1, fareler rotor çubuk performanslarını geliştirmek. Ortalama oturum elde gün 2, fareler neredeyse asimptotik düzeyde (şekil 1B) puanları. İlk duruşmada, gecikme süresi ile karşılaştırıldığında post-hoc analizi önemli gelişmeler son denemeler eğitim günleri (şekil 1 c) gösterdi.

Şekil 4A nöronal özellikleri motor beceri öğrendikten sonra değişti akım tipi kelepçe analiz bir örneği gösterilir. Enjeksiyonları 400 pA ve 500 pA akımlar aksiyon potansiyelleri eğitimsiz grubunda ve 1 günlük eğitimli Sıçanlarda sırasıyla ikna etmek için ihtiyaç vardı. Buna ek olarak, enjeksiyon sadece 150 PA geçerli aksiyon potansiyelleri 2 günlük eğitimli Sıçanlarda temin yeterliydi. Geçerli yoğunluğu ve aksiyon potansiyelleri sayısı arasındaki ilişki şekil 4B' gösterilir. Kadar az 50 pA geçerli sivri 2 günlük eğitimli Sıçanlarda temin yeterli; Buna ek olarak, 1 günlük eğitimli fareler daha eğitimsiz fareler daha az aksiyon potansiyelleri ile 350 pA ve daha yüksek akımlar için cevap verdi. Ayrıca, daha düşük dinlenme 1 günlük eğitimli fareler potansiyel gösterdi şekil 4 c gösterir, 2 günlük eğitimli fareler daha yüksek istirahat potansiyeli (şekil 4 c) ve membran direnç (gösterdi, ancak daha yüksek eşik ve daha derin afterhyperpolarization, spike Şekil 4 d).

Biz daha önce¹¹açıklandığı gibi IA eğitim (şekil 1 d) postsinaptik plastisite eksitatör ve inhibitör sinapslarda Hipokampal CA1 nöronların, indüklenen. Işık kutusunu gecikme ölçerek, fareyi bağlamsal öğrenme performansını tahmin. Şekil 1E IA görev sonuçlarını gösterir. Sonra eşleştirilmiş elektrik çarpması, fareler kutusunun karanlık tarafında önlemek ve genellikle onlar değil tercih ederdim ışıklı Side'de kalmak öğrenmek. Karanlık tarafa kaçınmak eğilimi bu nedenle bağlamsal anılar Alım gösterir.

Şekil 5 hangi minyatür postsinaptik akımları önemli ölçüde bağlamsal öğrendikten sonra değiştirilmiş olan gerilim tipi kelepçe analiz bir örneği gösterilir. Öğrenme kaynaklı plastisite, spontan AMPA aracılı mEPSCs ve GABA_Aaraştırmak için-aracılı mIPSCs ardışık olarak 0.5 µM Tetradotoksin (şekil 5A ve B) huzurunda kaydedildi. İki boyutlu araziler (şekil 5C) üzerinde gösterildiği gibi her CA1 nöron mEPSCs ve mIPSCs için farklı ortalama genlikleri vardı. Her ne kadar genlikleri düşüktü ve içindeki dar dağıtım aralığına gösterdi eğitimsiz, unpaired, ve gözden geçirme fareler, IA eğitimli Rat (tablo 5) çeşitli bunlardı. ANOVA Post-hoc analizi tarafından takip içinde IA eğitimli rats (şekil 5E), öğrenme kaynaklı postsinaptik plastisite CA1 nöronlar içinde düşündüren mEPSC ortalama genlikleri önemli bir artış ve mIPSC gösterdi.

Ayrıca, her CA1 nöron farklı mEPSC ve mIPSC Frekanslar (şekil 5 d) sergilenmektedir. Her ne kadar frekansları düşüktü ve içindeki dar dağıtım aralığına gösterdi eğitimsiz, unpaired, ve gözden geçirme fareler, IA eğitimli Rat (tablo 6) çeşitli bunlardı. ANOVA Post-hoc analizi tarafından takip içinde IA eğitimli rats (şekil 5F) mEPSC ve mIPSC olayları frekanslarda önemli bir artış gösterdi. Bu sonuçlar iki muhtemel yorumları vardır. Bağlamsal öğrenme fonksiyonel sinapslarda nöronların sayısı arttı ilkidir. Diğer bağlamsal öğrenme presynaptic yayın olasılığını Glutamat ve GABA artış olduğunu.

Biz de eşleştirilmiş-nabız daha da presynaptic plastisite incelemek için yürütülen elektrodlar, daha önce^10,11bildirildiği gibi.

Resim 1 : Eğitim sonrası performans öğrenme.
A: rotor çubuk eğitim ve koronal beyin dilim deneysel tasarım gösterir. B: hızlanan rotor çubuk namlu düşmeye ortalama gecikmesi. C: ilk ve son denemeler gün 1 ve 2⁷eğitim kapalı çubuk düşmeye ortalama gecikmesi. P< 0,01 vs ilk deneme. D: şema inhibitör kaçınma (IA) görev ve koronal beyin dilimin. E: koyu kutu önce ve IA eğitim¹¹' den sonra girmek için ortalama gecikme süresi. P< 0,01 vs IA eğitim önce. Koronal bölümleri sayıları anterior bregma mm mesafe gösterir. Hayvan sayısı çubukları alt kısmında gösterilir. Hata Çubuklarõn SEM Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Resim 2 : Dilim yordamlar.
A: fotoğrafları göster: Akut beyin dilimleri hazırlanması. Diseksiyon araçları kullanmadan içinde ezilmiş buz önce soğutmalı. B: beyin diseksiyon ve düzeltme. Not Düzeltme açısını arka tarafında dendritik yönlü paralel odaklı gerekir. C: beyin vibratome odasında dilimleme. Beyin diseksiyon arabellekte banyo ve sürekli bir % 5 CO₂/95% O₂ gaz karışımı ile bubbled. D: iki plastik saklama kapları ve silikon tüp bir arayüz odası yapılmış. Oda yapay CSF ile dolu ve sürekli gaz karışımı ile bubbled. E: beyin dilimleri odasında ıslak filtre kağıdı üzerine yerleştirildi.Çubuk 5 mm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3 : Yama kelepçe yordamlar.
A: elektrik sinyalleri bir nöron kaydetmek için kullanılan yama-kelepçe sistemi. Uyarıcı ve Katman II/III nöronlarda elektrotlar kayıt konumunu sıçan motor korteks içinde gösterilir. B: CA1 piramit nöron Schaffer sinapslarda analiz etmek için bir uyarıcı elektrot stratum radiatum yerleştirildi. Temporoammonic sinapslar analiz etmek için bir uyarıcı elektrot stratum moleculare yerleştirildi. Temsilcisi uyarılmış AMPA izler ve NMDA reseptör aracılı eksitatör postsinaptik akımlar aynı CA1 nöron gösterilir. C: bir dilim çapa kayıt odası dilimi dengelemek için kullanılmıştır. D: bir temsil harita üzerinde yayımlanmış belgeleri^15,16,17dayalı motor korteks. ML orta çizgi =. E: IR-DIC Filmler M1, Katman II/III nöronlar daha önce (üst) ve (alt) kayıt sırasında. Çubuk 10 µm. F=: değişiklikleri geçerli touch (üst) önce ve membran Rüptürü (alt), pipet. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4 : Geçerli-kelepçe analiz⁷ ' nin temsilcisi sonuçları .
A: Aksiyon potansiyelleri temsilcisi izleri kaydedilen indüksiyon geçerli enjeksiyonları ile sonra. B: ortalama geçerli giriş (pA) aksiyon potansiyeli çıktıda beyin dilimleri (sivri sayısı) vs eğitimsiz (açık bar), 1 günlük eğitimli (gri çubuklar) ve 2 günlük eğitimli rats (doldurulmuş çubuğu) arasındaki ilişkiler. C: potansiyeli, eşik ve afterhyperpolarization Katman II/III nöronların dinleniyor. D: membran direnci ve seri direnç nöronların. Her grupta 9-10 fareler kullanılır. Hücre sayısı her çubuk içinde gösterilir. Hata Çubuklarõn SEM *P< 0,05, **P< eğitimsiz 0,01 vs . Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5 : Gerilim Tipi Kelepçe analiz¹¹ temsilcisi sonuçları .
Minyatür eksitatör ve inhibitör postsinaptik akımlar (mEPSCs ve mIPSCs) eğitimsiz (A) ve inhibitör kaçınma (IA) temsilcisi izleri-eğitimli fareler (B). mEPSCs-60 mV ve mV ölçülen sırayla aynı CA1 piramit nöron Tetradotoksin (0.5 µM) huzurunda 0, mIPSCs. Dikey çubuk 20 pA, yatay bar = 200 = MSN. C: iki boyutlu ortalamasını bana (ı) PSC Arsalar genlikleri içinde eğitimsiz, IA eğitimli unpaired ve gözden geçirme fareler. D: (I) PSC bana ve iki boyutlu araziler 4 grup frekansları. Not her CA1 nöron farklı sergilenen demek bana (ı) PSC genlikleri ve frekansları. IA eğitim sadece ortalama genlikleri güçlendirilmiş (E) ama aynı zamanda bana (ı) frekansları PSC olayları arttı (F). Her grupta 4-6 fareler kullanılır. Hücre sayısı çubukları alt kısmında gösterilir. Kırmızı artı işaretlerini (C, D) ve (E, F) dikey çizgiler ile barlar belirtmek ortalama ± SEM **P< 0,01 vs eğitimsiz fareler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Diseksiyon arabellek (Toplam 1L)
NaH2PO4 • 2 H2O	0.195 g	1,25 mmol/L
KCl	0,188 g	2.5 mmol/L
CaCl2	0,074 g	0.5 mmol/L
MgCl2 • 6 H2O	1.423 g	7.0 mmol/L
Kolin klorür	12.579 g	90 mmol/L
Askorbik asit	2.340 g	11,6 mmol/L
Pirüvik asit	0.342 g	3.1 mmol/L
NaHCO3	2,100 g	25 mmol/L
Glikoz	4.500 g	25 mmol/L

Tablo 1: Diseksiyon arabelleği için bir reçete

Yapay CSF (Toplam 1L)
KCl	0,186 g	2.5 mmol/L
NaCl	6.700 g	114,6 mmol/L
NaH2PO4 •2H2O	0,156 g	1 mmol/L
Glikoz	1.800 g	10 mmol/L
NaHCO3	2.184 g	26 mmol/L
1M MgCl2	4 mL	4 mmol/L
1M CaCl2	4 mL	4 mmol/L

Tablo 2: Yapay beyin-omurilik sıvısı (bos) için bir reçete

Hücre içi çözüm için geçerli kelepçe (Toplam 200 mL)
KCl	0.0746 g	5 mmol/L
K-glukonat	6.089 g	130 mmol/L
HEPES	0.476 g	10 mmol/L
EGTA	0.0456 g	0.6 mmol/L
1M MgCl2	500 ΜL	2.5 mmol/L
Na2 ATP	0.4408 g	4 mmol/L
Na3 GTP	0.0418 g	0,4 mmol/L
Na phosphocreatine	0.510 g	10 mmol/L

Tablo 3: Geçerli kelepçe için hücre içi bir çözüm için bir reçete kayıt

Hücre içi çözüm için gerilim kelepçe (Toplam 200 mL)
CsMeSO3	5

.244 g (5.814) ^* 115 mmol/L (127.5) ^* CsCl 0.672 g (0,252) ^* 20 mmol/L (7,5) ^* HEPES 0.476 g 10 mmol/L EGTA 0.0456 g 0.6 mmol/L 1M MgCl₂ 500 ΜL 2.5 mmol/L Na₂ ATP 0.4408 g 4 mmol/L Na₃ GTP 0.0418 g 0,4 mmol/L Na phosphocreatine 0.510 g 10 mmol/L * düşük Cl^- konsantrasyonu minyatür kayıtları için

Tablo 4: Gerilim kelepçe için hücre içi bir çözüm için bir reçete kayıt

Parametreleri		eğitimsiz	Eğitimli IA	unpaired	yürümek-den geçerek
mEPSC genlik	Varyans	5.8	32,1	4.7	5,9
	Standart sapma	2.4	5,7	2.2	2.4
	Varyasyon katsayısı	0.189	0.326	0.177	0.190
mIPSC genlik	Varyans	17,1	56.7	31,8	20,7
	Standart sapma	4.1	7.5	5.6	4.5
	Varyasyon katsayısı	0.279	0.387	0.367	0.286

Tablo 5: Minyatür eksitatör ve inhibitör postsinaptik geçerli (mEPSC ve mIPSC) genlikleri inhibitör kaçınma (IA) içinde çeşitlilik-eğitimli fareler

Parametreleri		eğitimsiz	Eğitimli IA	unpaired	yürümek-den geçerek
mEPSC frekans	Varyans	278	2195	188	195
	Standart sapma	17	47	14	14
	Varyasyon katsayısı	0.902	1.198	0.893	0.874
mIPSC frekans	Varyans	3282	27212	1385	5135
	Standart sapma	57	165	37	72
	Varyasyon katsayısı	1.195	1.006	0.955	0.836

Tablo 6: Minyatür eksitatör ve inhibitör postsinaptik geçerli (mEPSC ve mIPSC) frekansları inhibitör kaçınma (IA) çeşitliliği-eğitimli fareler

Tartışmalar

Büyük dilim yama klemp tekniği kayıt içinde vivoolacakları yansıtmıyor olabilir dilim hazırlık kısıtlamasıdır. Vivo akım tipi kelepçe analiz daha güvenilir olsa da, bilinçli hayvanlardan yeterli veri elde etmek için teknik olarak zordur. Piramit her neuron hücresel özellikleri farklı olduğundan, hücreleri yeterli sayıda düzgün nöronlar farklılıkları eğitimden sonra analiz etmek için gereklidir. Ayrıca, Gerilim Tipi Kelepçe analiz sürekli ilaç tedavisi CNQX, APV veya bicuculline postsinaptik yanıt doğasını belirlemek için gerektirir. Glutamat veya GABA tek bir vezikül tarafından indüklenen minyatür yanıt-e doğru çözümlemek için sürekli tedavi Tetradotoksin ile spontan aksiyon potansiyelleri engellemek için gereklidir. Son zamanlarda gelişmiş çoklu foton görüntüleme tekniği eksitatör sinapslarda¹⁹morfolojik değişiklikleri analiz etmek için güçlü olsa da, bir kombine yama klemp tekniği sinapslarda vivo içindeişlev analiz etmek için gereklidir. Şu anda en inhibitör sinapslarda dikenleri oluşturmaz bu yana inhibitör sinapslarda, morfolojik değişiklikleri analiz etmek zordur. Şu anda, dilim yama kelepçe hücre özellikleri veya eğitimli hayvanlar eksitatör/inhibitör sinapslarda fonksiyonları çözümlemek için en uygun teknik olacaktır.

Geçerli-kelepçe analizi (şekil 4) kullanarak, biz son zamanlarda öğrenme kaynaklı motor iç plastisite Katman II/III nöronlar içinde bildirdi. Özellikle, 1 günlük eğitimli fareler membran potansiyeli ve artış spike eşik dinlenme içinde önemli bir düşüş gösterdi. 2 günlük eğitimli fareler için artan uyarılabilirlik liderliğindeki membran potansiyeli dinlenme önemli bir artış gösterdi. Bu sonuçlar orada dinamik değişiklikleri M1 Katman II/III nöronlar eğitimli Sıçanlarda içsel plastisite vardı önerdi. Ek gerilim-kelepçe analiz presynaptic GABA yayın olasılık⁷geçici bir düşüş olduğunu mu ima 1 günlük eğitimli Sıçanlarda eşleştirilmiş-nabız oranı artış saptandı. Bu nedenle mümkündür GABA gelen o Disinhibisyonu II/III synapses katmanında M1 içinde elde edilen öğrenme kaynaklı plastisite tetikleyebilir. Bu destek, dilim hazırlık M1 LTP²⁰ikna etmek için bir GABA_A reseptör engelleyici ile banyo tedavi gerektirir.

Minyatür postsinaptik potansiyeller analizini sinaptik plastisite IA eğitimli hayvanlarda tespit etmek için güçlü bir yoldur. Sıralı mEPSCs ve mIPSCs tek bir kayıt CA1 nöron bireysel her neuron sinaptik uyarıcı/inhibitör gücünü analiz sağlar. Beri tek bir bana (ı) PSC yanıt için tek bir vezikül Glutamat veya GABA, artış atfedilen bana (ı) PSC genlik postsinaptik güçlendirilmesi öneriyor. Bana (ı) PSC analizi kullanarak, her CA1 nöron (şekil 5C) içine eksitatör/inhibitör girişi gücünü bireysel farklılıklar bulduk. IA eğitim açıkça çeşitlilik sinaptik gücü terfi ama bu diğer gruplar (tablo 5) gözlenmiştir değil.

Öğrenme kaynaklı sinaptik çeşitlilik matematiksel olarak analiz edilebilir. Her noktası görünüm olasılığını hesaplayarak, her neuron verilerden (Claude E. Shannon²¹bilgi teorisi kullanarak bit) öz-entropi için dönüştürülebilir. Bir nokta çok nadir olasılık (sapma noktası) ile yüksek öz-entropi gösterirken bir noktaya yüksek görünüm olasılık (çevresinde ortalama düzeyi) ile düşük öz-entropi, gösterir. Eğitimsiz farelerle karşılaştırıldığında, öz-entropi nöron başına açıkça IA eğitimli Rat arttı ama değil unpaired veya gözden geçirme fareler²². Bu analiz içi CA1 bilgi bağlamsal öğrendikten sonra bir artış olduğunu gösteriyor.

Dilim yama klemp tekniği de cued korku yanal amigdala⁹ çalışmalarda klima ve varil korteks⁸çalışmalarda duyusal deneyimi için kullanılabilir. Ayrıca, bu teknik ile çeşitli teknikler daha ileri araştırmalar için kullanılabilir. Örneğin, virüs-aracılı yeşil flüoresan protein (GFP)-tagged gen teslim tekniği işlev belirli moleküllerin analiz etmek için yama klemp tekniği ile kombine edilebilir. Buna ek olarak, bir retrograd izleyici odak mikroenjeksiyon proje belirli bir alandaki belirli nöronlar görselleştirmek için kullanılabilir. O zaman, geçerli-klemp tekniği kullanarak, hücre özgü özellikler görüntülenmeyecektir nöronlar²³' analiz edilebilir. Ayrıca, İki fotonlu lazer Glutamat uncaging ile Birleşen iki fotonlu mikroskobu lazer tarama Katman II/III piramidal nöronların¹⁹omurga özgü büyüme ve fare kortikal EPSC yanıtta göstermek için kullanılmıştır. Böylece, dilim yama klemp tekniği roman kimyasallar, gen teslim ve fotoğraf Manipülasyon teknikleri ile birleştirerek geliştirildi.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rota-Rod Treadmills	Med Associates Inc.	ENV577
inhibitory avoidance box	Shinano Seisakusho
Pentobarbital	Kyoritsu Seiyaku
Blade	Nisshin EM Co., Ltd	LC05Z
Cardiac perfusion syringe	JMS Co., Ltd	JS-S00S
Vibratome	Leica Microsystems	VT-1200
Horizontal puller	Sutter Instrument	Model P97
Microfilm 34 gauge	World Precision Instruments, Inc	MF34G-5
0.22 µm filter	Millipore	SLGVR04NL
Axopatch–1D amplifier	Axon Instruments
Digidata 1440 AD board	Axon Instruments
pCLAMP 10 software	Axon Instruments
Upright Microscope	Olympus	BX51WI
CCD camera	Olympus	U-CMAD3
Camera controller	Hamamatsu Photonics K.K.	C2741
Stimulator	Nihon Kohden	SEN-3301
Isolator	Nihon Kohden	SS-104J
Motorized manipulator	Sutter Instrument	MP-285
Micromanipulator	Narishige	NMN-21
Peristaltic Pump	Gilson, Inc	MINIPULS® 3
Glass capillary	Narishige	GD-1.5
Ag/AgCl electrode	World Precision Instruments, Inc	EP4
Slice Anchor	Warner instruments	64-0252
Stimulus electrode	Unique Medical Co., Ltd	KU201-025B
Materials	Company	Catalog Number	Comments
Dissection buffer/ artificial CSF
NaH2PO4 • 2H2O	Sigma-Aldrich Co.	C1426
KCl	Wako Pure Chemical Industries	163-03545
CaCl2	Wako Pure Chemical Industries	039-00475
MgCl2 • 6H2O	Wako Pure Chemical Industries	135-00165
Choline chloride	Sigma-Aldrich Co.	C7527
Ascorbic acid	Wako Pure Chemical Industries	190-01255
Pyruvic acid Na	Wako Pure Chemical Industries	199-03062
NaHCO3	Sigma-Aldrich Co.	28-1850-5
Glucose	Sigma-Aldrich Co.	07-0680-5
Materials	Company	Catalog Number	Comments
Intracellular solution
K-Gluconate	Sigma-Aldrich Co.	G4500
HEPES	Wako Pure Chemical Industries	346-01373
EGTA	Wako Pure Chemical Industries	348-01311
Na2 ATP	Nacalai Tesque	01072-24
Na3 GTP	Sigma-Aldrich Co.	G-8877
Na phosphocreatine	Sigma-Aldrich Co.	P-7936
CsMeSO3	Sigma-Aldrich Co.	C1426
CsCl	Wako Pure Chemical Industries	033-01953
Materials	Company	Catalog Number	Comments
Drugs in aCSF
2-Chloroadenosine	Sigma-Aldrich Co.	C5134
Picrotoxin	Sigma-Aldrich Co.	P-1675
Tetrodotoxin	Wako Pure Chemical Industries	207-15901
CNQX	Sigma-Aldrich Co.	C239
APV	Sigma-Aldrich Co.	A5282