Sinek sirkadiyen etkinliği ölçmek için bir hesaplama yöntemi

Özet

Sinek sirkadiyen Lokomotor ritimleri olarak görülen başlıca zamansal özellikleri ölçmek için bir yöntem sunulur. Miktar çok parametrik modeli dalga sinek aktivitesiyle yaklaştırarak elde edilir. Şekli ve boyutu sabah ve akşam doruklarına günlük aktivite modeli parametreler açıklanmaktadır.

Özet

En hayvanlar ve bitkiler, sirkadiyen saatler davranışsal ve moleküler süreçleri yönetmek ve onları günlük koyu döngüsü eşitlemek. Bu geçici denetim altında yatan temel mekanizmaları yaygın bir model organizma. meyve sineği Drosophila melanogaster kullanarak incelendiği Sinekli, saat genellikle multiday Lokomotor kaydı analiz ederek incelenmiştir. Böyle bir kayıt iki etkinlik doruklarına karmaşık biomodel desen gösterir: şafak olur bir sabah tepe ve dusk olur bir akşam tepe. Sinüsoidal salınımları çok farklı bir dalga formu ek olarak saat mekanizmaları davranış veri gözlenen desenler üreten derin etkileri vardır düşündüren genlerine, gözlemlenen bu iki doruklarına birlikte formu. Burada biz talimatlar, matematiksel olarak zamansal desenleri sinek etkinliğinde açıklar son zamanlarda gelişmiş bir hesaplama yöntemi kullanarak verir. Yöntemin etkinliği verilerini dört üstel dönem ve tam olarak istediğiniz şekli ve boyutu sabah ve akşam peaks etkinliğinin tarif dokuz bağımsız parametreleri oluşan bir modeli dalga formu ile uyuyor. Ayıklanan parametreleri sinek Lokomotor ritimleri yaygın olarak gözlenen biomodel etkinlik desenleri altında yatan yüzeylerde Kinetik mekanizmalarının aydınlatmak yardımcı olabilir.

Giriş

Sirkadiyen saat yaklaşık 24 saatlik bir süre ile endojen bir biyokimyasal osilatör ve hayvanlarda hemen hemen her yerde ve^1,2bitkiler. Saat senkronize bir organizmanın iç işlemler ve davranış dış ışık karanlık döngüsü için yardımcı olur. Sirkadiyen saat genetik yapısını yaygın olarak 1960'lardan beri okudu meyve sineği, D. melanogasterkullanarak. Bu böcek sirkadiyen saat çekirdek dört proteinler oluşur: dönem, TIMELESS, saat ve döngüsü. Bu çekirdek bileşenleri ile birlikte diğer molekülleri saat genler^3,4neredeyse sinüsoidal salınımları üretir bir geri besleme döngüsü oluşturur. Sirkadiyen saat içinde sinekler sinek etkinlik tek bir Kızılötesi ışın bir bireysel tüp⁵orta kapısı nerede algılanır multiday Lokomotor kayıtları kullanarak yaygın olarak incelenmiştir. Tipik bir sinek kaydı iki iyi ayırt zirveleri ile karmaşık bir biomodel deseni vardır: gece sonunda başlayan ve ışıklar; etkinleştirdiğinizde en sahiptir sabah tepe (M) ve günün sonunda başlayan ve⁶ışıkları en vardır akşam tepe (E). İlginçtir, bu tür davranış kayıt şeklini çok basit sinüsoidal salınımlarını ek mekanizmaları gözlenen zamansal desenler için katkıda bulunan eylem düşündüren moleküler seviyede gözlenen farklıdır. Gizli mekanizmaların daha iyi anlamak için zamansal kalıplarının nicel bir açıklama sağlayan bir hesaplama araç geliştirdik.

Çalışmamızda, Lokomotor ritimleri sinek aktivite desen taklit eden bir dalga biçimi açısından tanımlanır. Basit sinüs dalgaları gözlenen ritmik değişiklikleri etkinliğinde modellemek için kullanılamaz, biz kayıtları görülen belirgin özellikleri yakalar basit birini seçmek için çeşitli sinyal şekilleri test. Meyve sineği sirkadiyen davranışı kez üstel etkinleştirme ve devre dışı bırakma⁷alışkanlıkları var saat nöronlar etkinliği tarafından denetlenir. Üstel dinamikleri ve verilerin görsel analiz bize üstel koşullarını kabul dokuz bağımsız parametreleri ile dört temsilcilerinden oluşan ve yakından sinek aktivite desen⁸benzeyen bir model oluşturmak için motive. Lokomotor verileri ek olarak, biz de onun güç spektrum analiz. Tipik sinek etkinlik spektrumu Harmonikler T₀/2, T₀/3, vb, sirkadiyen süresi T₀beklenen temel zirvesinde ek olarak birden çok doruklarına gösterir. Daha karmaşık dalga biçimleri (şekil 1) birincil dönemin Harmonikler çoklu spektral doruklarına gösterirken Fourier teoremi göre sadece bir saf sinüs dalga güç spectra, tek bir tepe üretir. Bu nedenle, verileri bir çok tepe güç spektrumu matematiksel olarak beklenen sinüsoidal zamansal desen sinek etkinlik⁸' de göz önüne alındığında ve mutlaka salınım birden fazla süreler varlığı anlamına gelmez. Önemlisi, önerilen model dalga güç spektrumu da zirveleri benzer böylece hangi ile zaman ve frekans sinek veri bizim modeli açıklar yüksek sadakat vurgulamış sinek Lokomotor kayıtları için birincil döneminin bütün Harmonikler gösterir.

Zaman çözünürlüklerinde birkaç dakika veya daha az, sinek etkinlik veri parametreleri doğrudan ham verileri ayıklamak üzere gürültülü görünür. Daha uzun zaman aralıkları içine binning veri gürültü seviyesini azaltabilir, ancak, veri modeli parametreler tahmini etkileyebilir şekilde değiştirebilirsiniz. Biz bu nedenle modeli işlevi⁸ (bakınız ek dosya 1 başvuru⁸) Fourier dönüşümü hesaplanan beklenen güç spectra için analitik bir ifade kullanarak kayıtları, güç spectra parametreleri elde. Parametreleri güç spectra alma bu yaklaşım doğru parametre değerleri binning veya filtreleme, ham etkinlik veri gibi ek herhangi bir manipülasyon olmadan verir. Matematiksel model ve vahşi-türü ve mutant veri uygulamaları ayrıntılarını başvuru⁸' de açıklanmıştır. Protokol burada hesaplama aracı kullanmak için adım adım yönergeler odaklanır sundu.

Protokol

1. ölçme sinek hareket kullanarak Drosophila etkinlik izleyicisi (DAM)

Not: başvuru ⁵ daha fazla ayrıntı görmek için.

1. Hazırla bireysel tüpler gıda ile bir ucunda sinek ve diğer pamuk. Sonunda gıda ile gıda kurumasını önlemek için kapalı olmalıdır.
   1. 50 mL kabı içinde 5-6 g sinek yiyecek koymak. Böylece bunu eritmek daha kolay yemekler küçük parçalar halinde kesin
   2. Bir lastik bant ile bağlanmak 32 bireysel cam tüplerin.
   3. o bir mikrodalga fırında 10-15 s. Stop mikrodalga her 5 Isıtma tarafından gıda kabı içinde eritmek s ve dikkatli bir şekilde eşit gıdaların erime emin olmak için kabı sallamak.
   Gıda kabı gıda ile hazırlanan bireysel tüpler koymak hala sıvı ise
   4. . Onlar aynı derecede dolu tüpler yukarı ve aşağı olacak şekilde değiştirin.
   5. İzin ver soğumasını ve yaklaşık 1 h. kuvvetlendirmek için gıda
   6. Yemek katı sonra tüpleri ile gıda kabı kaldırın.
   7. Balmumu kullanarak gıda içeren son mühür. İlk olarak, dikkatli bir şekilde temiz bir kağıt havlu kullanarak bir tüp daha sonra basın boru balmumu karşı. Görsel olarak mühür kalitesini kontrol edin ve gerekirse mühürleme tekrar yeniden.
   8. Tüp pamuk ile diğer ucunu kapatın; pamuk bir sinek tutmak tüp kilitliyken yapmak hava izni.
2. Bir tek sinek her bireysel tüpü yerleştirin ve tüpler'deki Barajdan yerleştirin.
3. Yer sabit sıcaklık ve nem korur bir kuluçka makinesine izler. Deney üzerinde bağlı olarak, uygun ışık/karanlık koşulları aşağıdaki gibi ayarlayın.
   1. Işık/karanlık deneyler açık/koyu döngüsü bütün deneyin için sinekler tutmak için. Ölçümler ilk gününde analize kullanmayın.
   2. Sürekli karanlık deneyler için ilk ışık/karanlık koşullarda sürüklenme ve saatlerin eşitlenmesi için iki gündür sinekler tutun ve sonra geçiş için sürekli karanlık. Ölçümleri sürekli karanlık ilk günden analize kullanmayın.
4. En az dört gün analizinde kullanılan veri toplamak.
   Not: Baraj Sistem İzleyicisi'nde tüm sinekler hareket kaydı ile tek bir dosya çıktısı.

2. Veri analizi

1. Split monitör çıkış dosyası birden çok tek sinek aktiviteyi dosyasına; her dosyayı tek bir sütun olmalıdır ' .txt ' dosyası ile bir bireysel sinek gezisidir ölçüm.
2. Çalışma ' ModelFitPS3.m ' işlevi aşağıdaki giriş parametreleri ile Matlab komut penceresinde:
   1. samplingrate için veri örnekleme zaman aralığını saniye olarak ayarlamak. Etkinlik her dakika ölçüldü, örneğin, 60 gibi girin samplingrate.
   2. Bin_interval için hangi verilerin daha iyi görselleştirme için binned; 20-30 dk. önerilen depo gözü aralığıdır dakika içinde zaman aralığını belirleme
   3. Girmek için eğilim, " 1 " veriyi temel eğilimi gösterirse ve " 0 " aksi halde; veri eğilim ile ilk Ikinci dereceden polinom montaj ve sonra verilerden çıkarılarak tarafından detrended.
3. Popup penceresinde bir tek sinek aktiviteyi seçin.
   Not: İlk arsa veri güç spektrumu ve tanıdık etkinlik komplo değil. Çizilen güç spektrumu birincil süresi T ₀ belirlemek: sirkadiyen tepe sol fare düğmesini kullanarak veya ikinci harmonik tepe üzerinde sağ fare düğmesi ile tıklatın (çevresinde T ₀ / 2).
4. Sabah ve akşam tepeler de görselleştirildiği açılan veri arsa üzerinde kontrol edin. Eğer değilse, doğru yerde grafik üzerinde tıklayarak ve iletişim kutusundaki yeni bin_interval değer giren bin_interval değerini değiştirin. Program veri aralığı yeni değerle yeniden çizer. Bin_interval değer kabul etmek için kalan herhangi bir yeri grafik üzerinde tıklatın.
5. Program verileri tekrar yeniden boyutlandırmaya ve ilk beş gün faaliyet gösterir. (Bazen bir veya iki gün atlamak gerekli) analizinde kullanılan ilk M tepe üzerinde bu arsa üzerinde ' ı tıklatın.
   Not: Program grafiğinde çekilen sabah pik başlayan yeniden çizer. Mavi ve kırmızı çizgiler E tepe ve sonraki gün M tepe, yaklaşık konumunu sırasıyla, 2.4. adımda belirlenen şekilde dönem temel alarak gösterecektir.
6. Aynı grafikte verileri veri modeli ile ön sığması için seçin: aşağıdaki noktaları'nı tıklatın (Bu sipariş; tıklama yer altındaki kırmızı yıldızla gösterilir unutmayın): (i) M üst tepe; (ii) M zirve sonunda; (iii) E tepe başlangıcı; (iv) E en yüksek tepesine; (v) E zirve sonunda; (vi) ertesi gün M zirvesine tepesine.
7. Not programı şimdi güç spektrum sunuyor.
   Not: X ekseni şimdi frekans verilir.
   1. Güç spektrumu ile açılan pencerede modeli güç spektrumu için analitik ifade uygun için kullanılacak puan almak. 2.4. adımda tespit dönem kırmızı bir çizgi ile işaretlenir. Uygun puan almak için önce kabaca birincil dönemin 2.4 adıma benzer belirleyin. Kaydırıcıyı ince ayar birincil dönemi kullanarak değer uygun işaret (kırmızı daireler ile gösterilen, kaydırıcıyı taşıdıktan sonra görünecektir) en yüksek değerleri için kapalı.
8. Görsel tepe seçimden sonra tıklatın " kabul " ve program seçili noktaları modeli parametreler hesaplamak için analitik ifade ile sığmaktadır.
9. Parametreleri ve spektral uygun hata dosyasına kaydedilir Not " model_fit_parameters.txtŔ program Ayrıca ile Lokomotor veri ve onun güç spektrumu uyar 2 rakamlar kaydedin.

Sonuçlar

Burada sunulan yöntem sinek gezisidir desende miktar ana özellikleri sağlar. Miktar dört üstel şartları oluşur bir modeli ile etkinlik veri yaklaştırarak elde edilir:

Model aktivite desen tarif dokuz bağımsız parametreleri vardır. Parametreleri b_MD,_bBay,

Tartışmalar

Bu eser sinek gezisidir desen nicel bir açıklamasını sağlar bir hesaplama aracı kullanmayla ilgili yönergeler sunar. Aracın hareket veri birlikte nesnenin şeklini ve boyutunu M ve E doruklarına açıklayan dört üstel şartları oluşan bir matematiksel model ile uyuyor. Son değerler modeli parametreler için ham veri kullanımı binning veya filtre uygulama veri parametre değerleri empoze edebilirsiniz artefactual etkileri nerede önleyebilirsiniz güç spectra, verilerin uygun elde edilir. Modeli parametre...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drosophila Activity Monitor	TriKinetics	DAM2, DAM5	Measures fly locootion using single infrared beam
MatLab	Mathworks		Computing environment and programming language, MatLab should include Optimization and Symbolic Math toolboxes
Drosophila melanogaster		per[S], per[L], iso31(wild type)	Our analysis can be performed with fly mutants of any circadian period