İçinde üç boyutlu Vitro hücre göç karakterize ortamlar yara

Özet

Bu iletişim kuralı yanlısı ve anti migratory faktörlerin etkisi hücre geçiş bir üç boyutlu fibrin matris içinde değerlendirmek için hedeftir.

Özet

Şu anda, en vitro model, iyileşmesi gibi köklü sıfırdan deneyleri, hücre göç ve yara kapatma iki boyutlu yüzeyler eğitim içerir. Ancak, yer alır şifa hangi vivo içinde yara fizyolojik ortamında üç boyutlu tercihan--dan iki boyutlu. Hücre davranışı büyük ölçüde olarak farklı olduğunu giderek daha açık hale geliyor iki boyutlu ve üç boyutlu ortamlarda; Bu nedenle, yara kapatma hücre geçiş davranışları eğitim için daha fizyolojik ilgili vitro modelleri için bir ihtiyaç vardır. Burada açıklanan yöntemi daha iyi daha önce kurulan iki boyutlu sıfırdan deneyleri fizyolojik şartlarda yansıtan bir üç boyutlu model hücre göç çalışmanın olanak sağlar. Hücre akıbet hücre göç pro veya anti migratory faktörlerin varlığında fibrin matris içinde gömülü bir küresel gövdesinden çekin incelenmesi yoluyla değerlendirmek için bu model amacı budur. Bu yöntemi kullanarak, hücre yapılan üç boyutlu bir matris küresel vücuttan gözlenen ve aydınlık alan mikroskobu ve küresel gövde alanı analizi ile zaman içinde kolayca ölçülebilir. Pro-göçmen ve/veya inhibitör faktörleri etkisi hücre göç de bu sistem içinde değerlendirilebilir. Bu yöntem araştırmacılar hücre göç ilişkili üç boyutlu yara matrisler vitroanaliz basit bir yöntem sağlar, böylece artan alaka içinde in vitro hücre önceden in vivo hayvan kullanımı için çalışmalar modelleri.

Giriş

Yara iyileşmesi yaralanma takip doku bütünlüğü restorasyon sonuçları karmaşık bir süreçtir. Bu işlem içine hemostazın, inflamasyon, yayılması ve remodeling, tarafından çevrelenmiş dört örtüşen aşamaları olan her düzenlenmektedir çözünür cues, hücre-matris etkileşimleri ve hücre-hücre iletişim karmaşık bir kombinasyonu tarafından bozuldu. ^{1 , 2} bu cues orkestrasyon hücresel yanıt-e doğru dahil, önemlisi, hücre göç yara iyileşmesinde çok sayıda kontrol eder. ^{3 , 4} hücre geçiş bağımlı hücresel fenotipleri ve hücre dışı matriks ortamın Biyokimya ve biyofizik özelliklerini üzerinde son derece dinamik bir süreç değil. ⁵ hücreler sürekli hücre dışı matriks çevreleri integrin aracılı yollar aracılığıyla araştırma; Bu süreci hücreleri matris özellikleri topografya, sertlik ve hapsi de dahil olmak üzere geniş bir anlamda verir. İki boyutlu (2D) analizi hücre göç göç öncü aktin filaman demetleri nesil aracılığıyla, lamellipodia formasyonu tarafından tahrik edilmektedir gösterir. Öncü kasılma ve retraksiyon firar kenarında tahrik actomyosin ile birlikte, odak yapışıklıklar sonraki oluşumunu hücrenin ileri sürüyor. ⁶ boyutlu üç (3D) hücresel geçiş şu anda iyi anlaşılamamıştır, ancak, son yıllarda yapılan çalışmalarda 3D geçiş daha belirgin farklı olduğunu ispat yukarıda adı geçen mekanizması 2D açıklanan ve büyük olasılıkla değiştirici mekanizma ile tahrik edilmektedir. Örneğin, son yıllarda yapılan çalışmalarda Petrie ve arktarafından. ECM özelliklerine bağlı olarak, 3D Matris hücrelerinde lamellipodium geçiş mekanizmalarının tahrik lobopodium arasında geçiş yapabilirsiniz, gösterdi. ⁷ hücre geçiş yanıt şifa yara, kritik bir bileşeni olduğundan hücre göç 3D modelleri yara iyileşmesi sırasında çeşitli uyaranlara fizyolojik yanıtlarını anlamak için kritik önem taşımaktadır. 2D yüzeylerde hücre göç davranışı büyük ölçüde göç 3D matrisler farklı olduğu gösterilmiştir, ancak en güncel vitro modelleri hücre göç sırasında köklü sıfırdan tahlil dahil olmak üzere işlem, şifa yara 2D kullanmak monolayer kültürler. ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14} deneyleri daha son zamanlarda geliştirilen 3D matris kullanılan, ama hala böylece yeteneği gerçekten hücre çevre three-dimensionality özetlemek için sınırlama monolayer matrix, üstüne hücrelerde kültür içinde vivo. ¹⁵

Burada açıklanan yöntemin amacı ile uygulanan uyaranlara ilişkili geçiş yanıt daha sağlam bir anlayış kazanmak için hücre göç fizyolojik ilgili bir 3D modeli yerine bir 2D yüzey incelemektir. Bu yöntem, hücre geçiş etkinleştirmek veya hücre geçiş ile ilişkili yollar engelleyen faktörleri varlığında bir 3D fibrin pıhtısı matris içinde değerlendirilmesi için sağlar. Fibrin matris nedeniyle kritik rol fibrin yara iyileşmesi erken aşamalarında, bu yöntem için seçildi; Aşağıdaki yaralanma, fibrin pıhtısı yara ortamlar içinde kan kaybı kök oluşturduğu ve ilk hücre infiltrasyonu sırasında doku onarım ve tadilat için bir iskele olarak hizmet vermektedir. ^{2 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20} Ayrıca, fibrin cerrahi bir mastik olarak klinik olarak kullanılır ve Mastikler bileşimi hücre göç ve nihai sonuçları şifa için bağlı olmuştur. Cox ve arktarafından önceki bir çalışma. fibroblast geçiş değişen fibrin ve fibrin dolgu macunu en iyi duruma getirme amacıyla Trombin konsantrasyonları oluşan fibrin pıhtısı ile araştırıldı. Bu çalışmalarda, plastik yemekleri üzerine fibrin pıhtısı hücreleri geçirilmesi sayısal. ²⁰ burada miktar göç 3D fibrin ortamı içindeki hücreleri için izin veren bir yöntem mevcut. Bu protokol için özel olarak açıklanan yöntemi fibrin kullanırken, bu model alternatif matris malzeme kullanmak istediğiniz gibi kollajen veya diğer 3B matrisleri gibi için kolayca değiştirilebilir. Ayrıca, biz fibroblast geçiş yara yatağına büyük önem hücre dışı matriks sentezi ve doku onarım/tadilat olduğundan bu tahlil fibroblast pulcuklarının kullanımı mevcut. Ancak, onarım sırasında süreç nötrofiller makrofajlar tarafından takip yara yatağa geçirmek için ilk hücre tipi vardır. Fibroblastlar sonra yaklaşık 48 saat sonra ilk yaralanma, yara iyileşme süreci proliferatif faz başında yara ortamı sızmaya başlar. ¹⁹ bu tahlil kolayca nötrofil, makrofajlar veya fibrin pıhtısı yapısındaki değişiklikler geçiş bu hücre tiplerinin nasıl etkiler değerlendirmek için diğer hücre tipleri eklemek için değiştirilmiş olabilir. ²¹

Bu tahlil uygulamak için ilk olarak, fibroblast küresel bir değişiklik kök hücre kültürü için daha önce açıklanan teknikleri kullanarak oluşturulur. ²² fibroblast küresel daha sonra 3D fibrin matris aktarılır ve sonucu sonra kolayca izlenebilir ve birkaç gün içinde sayılabilir. Bu iletişim kuralı dikkate fizyolojik sistemleri 3D 3D cep pulcuklarının fibrin matris içinde katıştırma tarafından alır böylece sınırlamaları hakkında getirdiği bir 2D büyüme yüzeyi ile bir hücre monolayer model göç davranışı için kullanarak alaka içinde kaçınarak, süre hala hücre davranışı son derece kontrollü vitro ortamda değerlendirilmesi için izin.

Protokol

1. gün 1: hücre ve reaktif hazırlık

Not: tüm hücre ve reaktif hazırlık biyolojik Emanet örneklerinin kontaminasyonu önlemek için kabine gerçekleştirilmelidir.

1. Sıcak filtre Dulbecco ' s modifiye kartal ' s orta (DMEM), fetal sığır serum (FBS), L-glutamine ve penisilin/streptomisin 37 ° C su banyosunda.
2. Hazırlama yenidoğan insan dermal fibroblast (HDFn) medya ilave tarafından ısıttı DMEM %10 FBS, % 1 penisilin/streptomisin ve % 1'l-glutamin.
3. Donmuş HDFns ve 200 x g de 8 dk santrifüj dondurma orta kaldırmak için bir şişe çözülme. 1 x 10 ⁶ hücre/mL ve tohum yoğunluğu bir T-75 kültür şişesi içine de hazır HDFn medya hücrelerde resuspend.
4. (37 ° C, % 5 CO ₂) hücre çoğalması izin vermek için bir kuluçka yer şişeye.
5. Mağaza HDFn medya 4 ° C.
6. Yanlısı ve anti migratory reaktifler gerektiği gibi hazırlayın.

2. 3. gün: Küresel hazırlık

1. bir kültür hood örneklerinin kontaminasyonu önlemek için aşağıdakileri gerçekleştirmek.
Hücrelerin % 80 confluency, geldiğinizde
2. Aspire medya ve % 0.25 5 mL ekleyin tripsin-EDTA. 37 ° C kuluçka tam hücreleri şişesi yüzeyinden ayırmak 5 min için mağaza flask.
3. 5 mL ılık medya tripsin nötralize etmek için şişe ekleyin.
4. Bir microcentrifuge tüp mix 10 μL Trypan mavi ve hücre süspansiyon 10 μL.
5. Santrifüj orijinal hücre süspansiyon için 200 x g., 8 dk
6. Hücre süspansiyon centrifuged iken, bir hemasitometre için Trypan mavi hücre süspansiyon 10 μL ekleyin ve bir hücre sayısı gerçekleştirmek.
7. Hücre Pelet kekii olmadan Santrifüjü, medya Aspire edin. 1,25 10 ⁵ hücre/mL x konsantrasyon, hücre Pelet resuspend.
8. 5 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS) altına 10 cm küresel büyüme sırasında sulu bir ortam sağlamak için Petri kabına ekleyin.
9. Petri kabına kapağını tersine çevirin. Hücre süspansiyon Petri kabına kapak iç yüzeyinin çeşitli 20 μL damla ekleyin.
10. Hızlı bir şekilde kapağı tekrar ters çevir ve çanak asılı damla çıkarmak değil dikkatli olmak, altta geri yerleştirin. şekil 1 gösterir başarıyla kurulan asılı damla.
11. Dikkatli bir 37 ° C kuluçka makinesine çanak yerleştirin ve pulcuklarının asılı bir büyümeye izin bırakın kültür 72 h. bir süre için

3. 6. gün: Pulcuklarının 3D matris gömme

1. bir kültür hood örneklerinin kontaminasyonu önlemek için aşağıdakileri gerçekleştirmek.
İlk fibrin tabaka oluşumu yaratmak için pıhtı çözüm çok sayıda wells için iyi başına 100 μL eklemek için yeterli hacim bir pıhtı çözüm
2. (iyi başına 1 küresel) gerekli. Pıhtı yüzde 10'u 10 X HEPES tampon hacmi (250 mM HEPES, 1500 mM NaCl, 50 mM CaCl ₂, pH 7,4), 2 mg/mL insan fibrinojen ve 0.1 U/mL insan Alfa Trombin tarafından oluşmaktadır. Pıhtı birimin geri kalanını ultrasaf su oluşmaktadır.
   1. Ekle Trombin son ve hızlı bir şekilde çözüm eklemek istediğiniz wells bir 48-şey plaka için kuyu için eklendi önce polymerizing pıhtıları önlemek için.
3. Yavaşça shake/fibrin pıhtısı karışımı de tüm kaplama emin olmak için iyi plaka dokunun ve sonra alt pıhtı tabaka polimerize izin vermek 1 h için kuluçka iyi plaka yer. İyi plaka kabarcık oluşumu ikna etmek zor sallama; Sadece rock plaka kuyu tamamı kaplanır kadar gerektiği gibi. Daha büyük pıhtı birimleri kullandıysanız, bu adım gerekli olmayabilir.
4. Fibrin katmana aktarmak pulcuklarının.
   1. Kaldır iyi plaka ve Petri kabına pulcuklarının asılı içinde içeren kültür kuluçka makinesi bırakın ve pulcuklarının mikroskop altında incelemek. Kültür kapağın çanak yerleştirin.
   2. Dikkatli bir şekilde erişime izin vermek için Petri kabına kapağını ters çevir'i kültürler için asılı bırakın.
   3. 1 mL şırınga için bağlı 21 G iğne kullanarak dikkatli bir kuyunun kaplama polimerli fibrin tabaka delmek değil dikkat çekici damla ters kapağını her şey, merkezi haline gelen transfer. Etkili bir şekilde açılan aktarmak için yavaş yavaş açılan iğne çek. En kısa zamanda tüm açılan içinde iğne döndü pistonu çekmeyi bırak; damla çok ileri geri çekerek etkili küresel transferi veya sonraki görüntüleme bozabilir hava kabarcıkları tanıtmak.
   4. İyi plaka pulcuklarının düzgün istenen tüm kuyu transfer var emin olmak için mikroskop altında incelemek.
5. İkinci fibrin tabaka oluşumu için yukarıdaki gibi ilk fibrin tabaka (Adım 3.2) oluşturulması için aynı hazırlık kullanarak başka bir pıhtı çözüm oluşturun. Dikkatle her küresel içeren açılan üzerine 100 μL pipet ve tekrar pulcuklarının hala tek parça ve kuyular kenarlarına itti değil emin olmak için mikroskop altında incelemek.
6. Kuluçka makinesi iyi plakasına dönmek ve ikinci katman için 1 h. polimerize izin

4. 6. gün: Pro-göçmen veya inhibitör faktörleri eklenmesi

1. sıcak HDFn medya 37 ° c
2. Bir hood kontaminasyonu önlemek için aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
3. Uygun konsantrasyonlarda değerlendirilmek üzere pro/anti-migratory ajanları dahil olmak üzere her grubu için ortam hazırlamak.
4. Kuluçka Gelişim makinesi ve kültür kukuIeta yerde iyi plaka kaldırmak.
5. Ekle 500 μL standart medya denetim küresel grubunun her şey için 500 μL geçiş inhibe küresel grubunun her şey için inhibitör medya ve geçiş gelişmiş küresel grubunun her şey için pro-göçmen medya 500 μL.
6. İyi plaka da kuluçka için iade.
7. Değişim medya her 48 h.

5. Gün 6-9: hücre göç değerlendirme ve nükleer silahların yayılmasına karşı

1. görüntü pulcuklarının aydınlık alan mikroskobu hemen medya (0 h) ve sonra her 24 h eklenmesinden sonra 72 h. isteğe bağlı kullanarak: her zaman noktası, z-yığın görüntü almak olup olmadığını belirlemek amacıyla geçiş odak birincil alan dışında uçaklarda meydana gelen. Deneyimlerimize göre bu oluşmaz; Ancak, bu her deneme durumda olduğundan emin olmak yararlıdır.
2. Kullanım için her küresel alanda yüzde artış her küresel her her başarılı zaman noktasında için hücre kenarlığı izleme ve kullanarak analiz ederek hücre yapılan her iyi belirlemek için ImageJ " ölçü " alanı elde etmek için işlev.

Sonuçlar

Küresel kültür başarıyla fibroblast geçiş tüp bebek yanlısı ve anti-göçmen aracıları etkisini değerlendirmek için kullanılması gereken
3D fibroblast pulcuklarının açılan kültür 72 h (şekil 1) bir süre içinde asılı yolu ile oluşturulabilir. Kültür dönemi pulcuklarının pıhtı matris içinde gömülü ve aydınlık alan mikroskobu (Şekil 2) kullanarak yansıma. (Resimde beyaz ...

Tartışmalar

Yara iyileşmesinde hücre göç incelenmesi ECMs bir vitro 3D modeli ile ilişkili bu iletişim kuralı sağlar. Çok önemli bir adım olarak uygun yordam yürütülmesini fibroblast pulcuklarının uygun gelişmedir; hücre toplama hazırlık sırasında 2.500 hücreler/damla, ilk bir konsantrasyon vermek için optimize edilmiş pulcuklarının formu için güvenilir bir 72 h kuluçka döneminde izin. Hücreleri yetersiz sayıda kullandıysanız, pulcuklarının etkili toplamak değil ve transfer ve fibrin ka...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials
Dulbecco's Modified Eagle's Medium, 4.5 g/L Glucose, w/ Sodium Pyruvate, w/out L-Glutamine	VWR	VWRL0148-0500	DMEM already containing L-glutamine can also be used
100mm Tissue Culture Dish, Non-Treated, Sterilized, Non-Pyrogenic	VWR	10861-594	Dishes of any size can be used for hanging drop culture
Fetal Bovine Serum from USDA approved countries, heat inactivated, sterile-filtered, cell culture tested	Sigma-Aldrich	12306C-500ML
L-glutamine	Fisher Scientific	ICN1680149	Not needed if using DMEM that already contains L-glutamine
Penicillin-Streptomycin Solution stabilized, sterile-filtered, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Human Dermal Fibroblasts, neonatal	Thermo Fisher	C0045C	Can be replaced with other cell type of interest
21 G x 1 1/2' needle	BD	305167	22 G x 1 1/2 needles will also work
1 mL syringe	VWR	89174-491	Syringes of any volume can be used
Cell Culture Multiwell Plates, Polystyrene, Greiner Bio-One (Individially Wrapped) (48 wells)	VWR	82051-004
Human Fibrinogen - Plasminogen, von Willebrand Factor and Fibronectin Depleted	Enzyme Research Laboratories	FIB 3	Can be replaced with matrix protein of interest
Human Alpha Thrombin	Enzyme Research Laboratories	HT 1002a	May not be necessary depending on matrix protein of interest
Equipment
BSL2 cell culture hood
Cell culture incubator
Inverted microscope with 10X objective
Centrifuge compatibile with 15 mL tubes