Floresan Biyoalgılayıcı kullanarak böcek besleme sırasında gerçek zamanlı Vivo kayıt Arabidopsis kalsiyum sinyallerin

Özet

Bu iletişim kuralı hemipteran böcekler, yaprak bitleri gibi besleme tarafından üretilen bitkilerde kalsiyum sinyalleri analiz etmek için basit bir yöntem özetliyor. GFP kalsiyum Biyoalgılayıcı GCaMP3 ile dönüştürülmüş Arabidopsis thaliana kalsiyum dinamiği yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüğü ile gerçek zamanlı vivo içinde görüntüleme için izin verir.

Özet

Kalsiyum iyonları bitki savunma yanıt mikrobiyal elicitors ve böcekler, sistemik kalsiyum almak yanında çiklet neden yaralama için kurulan bir parçasını oluşturan kalsiyum sinyal ile biyotik etkileşimleri sırasında anahtar sinyal varlıklar olduğu tahmin edilmektedir bitkilerde sinyalleri. Ancak, kalsiyum vivo içinde biyotik stres sırasında rolü hala belli değildir. Bu iletişim kuralı tarafından hemipteran baş belası besleme sırasında bitkilerde kalsiyum sinyalleri tespit etmek için bir genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensör kullanımını açıklar. Hemipterans yaprak bitleri gibi küçük bir sayı içeren hücrelerin uzmanlaşmış, ağız, bir bitki yaralama yanıtından farklı bir biyotik stres ile karşılaşınca kalsiyum dynamics eğitim için ideal bir araçtır geliştirmelerde emme uzamış pierce. Buna ek olarak, floresan biyosensörler sinyal molekülleri in vivo hayvan ve bitkiler ölçüm devrim. Bitki kalsiyum dynamics gerçek zamanlı görüntüleme sırasında yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlük ile besleme böcek için model bitki Arabidopsis thaliana GCaMP3, GFP tabanlı kalsiyum Biyoalgılayıcı ifade sağlar. Bir tekrarlanabilir ve sağlam tahlil öncesinde, sırasında ve sonra böcek besleme sitozolik kalsiyum dynamics sürekli ölçüm için izin müstakil GCaMP3 yaprakların Floresans mikroskobu ile geliştirilmiş. Bu bir hızlı kalsiyum son derece lokalize ayrıcalık birkaç dakika içinde oluşan site besleme yaprak biti çevresinde ortaya koymaktadır. Arabidopsis thaliana mutantlar hızlı oluşturulmasında olgusunun moleküler analiz kolaylaştırmak için kullanılmasına iken Protokolü gibi ek böcek türleri, diğer biyotik streslere için adapte edilebilir.

Giriş

Kalsiyum (Ca^{2 +}) tesislerinde en her yerde sinyal unsurlardan biridir. Sitozolik Ca^{2 +} konsantrasyonu geçici bir artış ([Ca^{2 +}]_cyt) akış yönündeki bileşenlere karmaşık ağ tarafından deşifre ve her iki abiyotik ve biyotik streslere^1,2yanıt olarak ilgilenmektedir. [Ca^{2 +}]_cyt artış ilk yanıt için bitki savunma yanıt^3,4,5ortak bir parçasını oluşturan mikrobiyal elicitors biridir. [Ca^{2 +}]_cyt yükselir ayrıca karşılık yaralama yanında çiklet böcekler, lepidopterans^6,7gibi neden gözlenmiştir. Ancak, potansiyel rolü yalnızca birkaç hücreleri zarar biyotik tehditler yaşamak için^{2 +} sinyalleri yanıt değil keşfedilmeyi Ca bitki. Yeşil şeftali yaprak biti Myzus persicae dünya tarım^8,9, önemli bir tehdit temsil eden bir hemipteran böcek ve sızma^{2 +} hücre dışı uzaydan içinde gözlenen Ca bırakır M. persicae¹⁰ile istila. Yaprakları bir floresan Ca^{2 +} Biyoalgılayıcı, yaprak bitleri ve hangi ile GCaMP3 sunan yeni araçları kullanarak üzerinden M. persicae yemek yerken bitki Ca^{2 +} ölçmek için sağlam ve yinelenebilir bir yöntem sinyalleri bu protokolü özetliyor Ca^{2 +} rolü biyotik etkileşimleri sırasında incelemek.

CA^{2 +}-seçici microelectrodes eski [Ca^{2 +}] bitkiler^11,12' ölçmek için kullanılmıştır. Daha yakın zamanlarda, Kollarındaki ve floresan yaklaşımları standart haline. Bu biyosensörler Ca^{2 +} bağlamak ve ışık yayarlar un paralellik fırsatları Ca^{2 +} dynamics hücreleri ve tüm dokularda çalışma izin. CA^{2 +} biyosensörler boyalar enjekte veya stabil dönüştürme (genetik olarak kodlanmışYani, biyosensörler) yoluyla organizmanın genom dizisi kodlama Biyoalgılayıcı giriş üzerine üretilen. İkinci kolayca canlı doku olarak gösterilen ve hücre altı Yerelleştirme¹³yeteneğine sahip olmanın büyük avantajlar sunuyor. Aequorea victoria (denizanası) izole aequorin protein bitkiler¹⁴' te dağıtılan ilk genetik olarak kodlanmış Ca^{2 +} Biyoalgılayıcı olduğunu. Kollarındaki bir protein aequorin ağartma chromophore ve autofluorescence¹⁵önler dış ışık tarafından uyarma gerektirmez. Aequorin başarıyla Cerayanlar [Ca^{2 +}] sıcaklık¹⁶, patojenler^17,18,19da dahil olmak üzere çeşitli uyaranlara yanıt ölçmek için kullanılan, tuz stres^{20 ,21}ve yaralama⁷. Ancak, tek tek hücreleri ve zavallı sensör ifade zor¹³kurcalayarak [Ca^{2 +}] Cerayanlar tespiti yapmak nispeten düşük sinyal şiddeti tarafından dezavantajlı.

Bu belli Ca^{2 +} biyosensörler gelişimi detaylı hücre altı ve doku düzeyinde analiz Ca^{2 +} dynamics için izin vererek aequorin tamamlanmaktadır. Floresans rezonans enerji transferi (FRET) are bir-in en yaygın floresan biyosensörler-Cameleons dayalı. PERDE Cameleons iki protein, genellikle CFP ve YFP, Ca^{2 +} CFP-YFP bağlayıcı bölge, calmodulin etki alanına bağlama tarafından indüklenen konformasyonal değişim tarafından yakın temas getiren oluşur. Bu kişinin enerji aktarımı CFP YFP için ve bu fluorophores floresan elde edilen değişikliği için [Ca^{2 +}] miktar doğru iki floresan sinyallerini oranının hesaplanması ile sağlar fluorophores²². Onlar daha az protein²³ ifade düzeyi tarafından etkilenen ve sık sık büyük bir floresan verim var gibi hücresel ve hücre altı görüntüleme²³için izin aequorin ve sigara ratiometric floresan boyalar için üstün perde Cameleons. Örneğin, FRET Cameleons son zamanlarda uzun mesafe Ca^{2 +} sinyalleri tesislerinde tanımlamak ve bunlar hücresel düzeyde^24,25,26gidermek için kullanılmıştır.

Son bir atılım floresan GFP tabanlı Ca^{2 +} biyosensörler ile son derece hassas tek-fluorophore (tek-FP) biyosensörler gelişme olmuştur. Tek-FP biyosensörler oluşur tek bir dairesel yayın sıralanmış GFP bağlı bir calmodulin ve M13 peptid, calmodulin için bağlama, yani bir su-aracılı tepki GFP arasındaki calmodulin sonuçlanan Ca^{2 +} ile protonate GFP ve artış Floresan verim^27,28,29. Tek-FP sensörler perde Cameleons, basit deneysel tasarım ve potansiyel olarak daha yüksek bir zamansal çözünürlük³⁰görüntüleme dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sunuyor. Her ne kadar tek-FP sensörler mutlak [Ca^{2 +}] basit ölçmek olamaz zamansal ve mekansal dinamiklerini Ca^{2 +} analizi^5,23sinyalleri için FRET sensörler üstün olduklarını. GCaMPs bir best-established tek-FP sensörler²⁸ ve kendi floresan verim, dinamik alan, Ca^{2 +} benzeşme ve sinyal noise oranları^31,32 artırmak için çeşitli revizyonlar uğramıştır ^{, 33 , 34}. GCaMPs başarıyla kullanıldığını hayvan sistemleri, Zebra balığı motor nöronlar³⁵ ve meyve nöromüsküler kavşak³⁴sinek gibi. GCaMP3 rasgele mutagenesis tek-FP sensörler, vericiyi GCaMP6³⁶ ve GECOs²⁹dahil olmak üzere ek sınıflarda sonuçlandı. GECOs son zamanlarda Arabidopsis thaliana (bundan böyle Arabidopsis da adlandırılır) Ca^{2 +} Cerayanlar ATP, kitin ve bakteriyel elicitor flg22 karşısında ölçmek için kullanılmaya başlanmıştır. Bu çalışmada de R-GECO Biyoalgılayıcı perde Cameleon YC3.6 maksimal sinyal değişikliği ve sinyal-gürültü oranı⁵açısından geride gösterdi.

Kullanım kolaylığı, yüksek floresan verim ve GCaMP biyosensörler ile elde edilebilir yüksek zamansal çözünürlük nedeniyle, GCaMP3 altında karnabahar mozaik virüsü 35S organizatörü Arabidopsis içinde genetik olarak kodlanmıştır. GCaMP3 tarafından ölçülen Ca^{2 +} sinyalleri detaylı moleküler analizi için genetik araçları Arabidopsis araştırma için kullanılabilir sağlar. Buna ek olarak, GCaMP3 Biyoalgılayıcı bir costlier confocal sistemi yerine bir floresan mikroskop altında görüntülenmeyecektir. Bu iletişim kuralı bütün doku Imaging, ne zaman canlı biyotik streslere ile deneyler temel sağlar. Öyle ki su, böcek kaçış önlemek için ve belirli bir dokusu ile besleme kısıtlamak için müstakil 35S::GCaMP3 bitki yapraklarından satışa çıkardı deney tasarlanmıştır. Bu makalede açıklanan yöntemi bu nedenle M. persicae tarafından besleme sırasında yaprak Ca^{2 +} dinamikleri analiz için sağlar, yanıt sinyali bir roman bitki karakterizasyonu kaynaklanan. Bu yöntem aynı zamanda ek böcek türleri ve mikrobiyal patojenler, gibi diğer biyotik streslere ve kökleri gibi diğer bitki doku ile çalışmaya adapte edilebilir.

Protokol

1. bitki hazırlık (gün 1 - 4)

1. 1 günde üç % 75 etanol yıkar, yıkama ve plaka başına 1 dk kullanarak tohum onları 100 mm ² ¼ mukavemetli Murashige ile Plastik tabaklar kare 35S::GCaMP sterilize ve Skoog (MS) orta (tarifi: Murashige ve Skoog orta, 7.5 g Sükroz, 10 g Formedium agar, 1 L de-iyonize su 1.1 g) ³⁷.
2. 8 ° C'de zaman uyumlu çimlenme elde etmek için üç gündür karanlıkta fidan tabakalaşmak.
3. Gün deneme 4, 16 h ışık ve 8 h karanlık photoperiod ile 23 ° C'de kontrollü ortam Oda (CER) GCaMP fidan taşımak.

2. Böcek Rearing (gün 11 - 12)

1. gün deneme 11, 15 yetişkin M. persicae nemli bir sanatçı kullanarak 5-hafta-yaşlı toprak yetiştirilen Arabidopsis bitkiler için eklemek ' (CER 10 h ışık ve 14 h karanlık photoperio ile 22 ° C'de yetiştirilen s boya fırçası (2 veya 4 boyutu) d).
2. çevrede belgili tanımlık bitki ve kap plastik bir kapak ile açık bir plastik boru (10 cm x 15 cm) yerleştirerek yaprak bitleri bitki üzerinde kafes.
3. Yaprak biti musallat bitkiler için 24 saat 16-h ışık ve karanlık 8-h photoperiod ile 22 ° C'de bir CER bırakın.
4. Üzerinde gün 12 deneme, tüm yetişkin M. persicae bir fırça kullanarak kaldırmak.
   Not: Böcekler bitkinin göz tarafından görülebilir. Bu perileri ile benzer bir gelişimsel yaş nüfusu verir. Kabaca 1 perisi yetişkin başına bu dönemde üretilecek.
5. Boyutu çok hızlı artan perileri önlemek için bir 8 h ışık ve 16 h karanlık photoperiod ile bir alt-sıcaklık CER 16 ° C'de musallat bitkiler bırakın.

3. Yaprak dekolmanı (gün 19)

1. gün 19 deneme, 35S::GCaMP3 fidan CER kaldırmak ve keskin makas kullanarak her bitkiden en büyük yaprak ayırın.
2. Bir çift cımbız kullanarak 300 µL distile su, abaxial yüzey yukarı dönük olacak şekilde içeren bir 96-şey kalıbının kuyuya müstakil yaprak yer. Yineleme için ek yaprakları ( şekil 1).

Resim 1: 35S::GCaMP3 yaprak tahlil. Her 16 bayat 35S::GCaMP3 Arabidopsis fide en büyük yaprak ilişkisi kesildi ve 300 µL distile su bir 96-şey plaka üzerinde süzülüyor. Dekolmanı ertesi gün çekilen fotoğraf. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

3. plaka şeffaf plastik wrap ve alüminyum folyo kapak ve oda sıcaklığında çökmek üzere müfrezesi stres izin vermek için gece bırakın.

4. Floresans mikroskobu (gün 20 - 22)

1. 20 gün deneme ve floresan stereomicroscope transfer alüminyum folyo 96-şey plaka çıkarın. Stereo Floresans mikroskobu ile 450-490 nm ışık GFP heyecanlandırmak için ve floresan emisyon 500 ve 550 nm arasında yakalamak için yapılandırın.
2. Yaşında yaprak bitleri bitki topraktan çıkarıp bir kapak ile şeffaf bir kutu yerleştirerek gün 11 kurulan koloni toplamak. Deney sırasında kutusunda yer alan böcekler devam.
3. 96-şey plaka mikroskop altında yerleştirin. GCaMP3 floresan açıkça müstakil yaprakları damarlarında görüntülenmeyecektir kadar ışık pozlama değiştirmek. Pozlama tüm deneyler için sabit tutmak; Geçerli iletişim kuralı için bir 1-s pozlama 3.5 ( Şekil 2) bir kazanç ile kullanıldı.
4. Öyle ki 4 kuyu bir çerçevede görülebilir büyütme ve mikroskop zoom ayarlayın; geçerli iletişim kuralı için bir 7,8 X büyütme ve-127.833 mm odak kullanıldı.
5. Bir yaprak biti nemli boya fırçası kullanma mikroskop altında müstakil bir yaprak aktarın. Bitişik bir yaprak bir denetim olarak tedavi edilmezse terk ama yaprak biti aktarım sırasında oluşan dokunmadan taklit etmek için boya fırçası ile hafifçe dokun. Böcek kaçan gelen önlemek için mikroskobu sırasında geri 96-şey plaka üstüne plastik wrap yerleştirmek unutmayın.
6. Başlamak çiftleri (1 yaprak biti tedavi ve tedavi edilmezse 1) yapraklarında Floresans kaydı tıklatarak " deneme başlatmak " içinde belgili tanımlık yapılı-içinde mikroskop bilgisayar yazılımı ( Şekil 2). Kayıt 50dk ölçülerini
   Not: geçerli iletişim kuralı, bir zaman aralığı 5 için s ölçümler arasında kullanıldı.
7. Sonra 50 dk, yanında tıkırtı üstünde kaydı durdurmak " durdurmak deney " ve yaprak yaprak biti kaldırmak. Floresans ölçümleri görüntü dosyaları (Örneğin, etiketli görüntü dosyası biçimi, TIFF) olarak kaydedin.
8. Yaprak daha fazla çiftleriyle denemeyi tekrarlamak; görüntüleme 2 genotip eşzamanlı görüntüleme için izin veren bir kerede 2 Çift yaprak görüntüye uzatılabilir.

5. Veri toplama

1. görüntü dosyaları Fiji (görüntü J) alabilir ve yanında tıkırtı üstünde 32 bit dönüştürebilir " resim " > " türü " > " 32-bit; " bu heatmap videolar (bkz. adım 7) görüntülerin dönüşüm sağlar.
2. Atmak içinde yaprak biti razı tek bir konumda birden fazla 5 min için mikroskop altında böcek hareketi görüntüleyerek örnekleri.
   Not: Bu kez örnekleri çoğunluğu, ve en çok 100 tedaviler başarılı yerleşme sergilenmesi 30 örnekleri bulmak için gereken.
3. Piksel (veya biliniyorsa mm, Dönüştür) Ölçüm ölçeği ve zaman dilimi için kullanılan aynı zaman aralığını mikroskobu sırasında yanında tıkırtı üstünde ayarlayın " resim " > " özellikler. "
4. Tu§ları doku GFP analiz için çevresinde ilgi (ROI) bir bölge koyun.
   Not: geçerli protokolünde bir dairesel ROI 50 piksel (0,65 mm) çapında kullanıldı faiz 3 yerlerde: site (Fs), midrib (Sm) yaprağın sistemik bir bölge ve sistemik bölge midrib için bitişik besleme yaprak biti (" lateral doku " Sl) ( Şekil 2).
   1. Yatırım Getirisi bir oval çizerek oluşturma (kullanın " oval aracı ") ve boyutu kullanarak düzenlemek " düzenleme " > " seçim " > " belirt. " bkz: Şekil 2.
5. Bu tedavi yaprak (Yani, yaprak yaprak biti tedavi yaprağına beslenen nerede olarak aynı bölge) seçili yaprak karşılaştırılabilir bölgelerinde ROIs tedavi edilmezse denetim için seçin ( Şekil 2).

Resim 2: GCaMP3 floresan mikroskop altında analiz. Sol: tedavi edilmezse denetim yaprak. Sağ: yaprak yaprak biti tedavi. Yaprak biti beslenme sitesi ok ucu ile belirtilir. Ölçek çubuğu 1 mm. (a) parlak alan görüntü =. Büyütme: 7,8 X, odak:-127.833 mm, pozlama: 1 s. (B) GFP görüntü showiNG Floresans kantitatif analiz için kullanılan ROIs. FS = besleme site, Sm sistemik midrib, Sl = sistemik yan doku =. Büyütme: 7,8 X, odak:-127.833 mm, pozlama: 1 s. GFP 450-490 nm metal halide lamba kullanarak heyecan duymuştur ve floresan emisyon 500 ve 550 nm arasında ele geçirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

6. tıklatarak zaman serisi Çözümleyicisi eklentisi kullanmak " eklentileri " > " zaman serisi Analyzer " (F) ham Floresans değerlerde ROI zamanla çözümlemek için. İlgi YG ekleyin (" Ekle [t] "). ROI seçili olduğundan emin yapma seçin " ortalama; al " bu o yatırım Getirisini her çerçeve için F değerlerinin bir tablosu görüntüler.
7. Bu verileri elektronik tabloya kopyalayın.
8. Beslenme sitesi sinyal alan bölge kullanarak seçerek hesaplamak " serbest seçim aracı. " maksimal GFP sinyal anahat ve sonra bu şeklin alanını tıklatarak hesaplamak " analiz " > " ölçü birimi. "
9. Tıklatarak MTrackJ eklentisi kullanarak beslenme site sinyal hızını hesaplayın " eklentileri " > " izleme " > " MTrackJ. "
   1. tıklayın üzerinde " Ekle " düğmesini tıklatıp ardından imleci ortasına ilk görünür olduğunda sinyal. Tıklayın tekrar sinyal onun noktada en uzak kenarına yayıldı. ' I tıklatın " ölçü " sinyal hızını hesaplamak için.

6. Veri analizi

1. tanımla yaprak biti Fiji mikroskobu üzerinden görüntü kareleri ile oynayarak yerleşme amacı.
   Not: yerleşme zamanı sırasında yaprak biti 5 dakika veya daha fazla tek bir konumda kalır çerçevedir. Olaylar yerleşme süresi de Fiji görüntülerden hesaplanabilir.
2. Normale göre denklem ΔF/F F veri (ΔF/F) = (F - F ₀) / f ₀ F ₀ ortalama temel Floresans nerede, hesaplanan F ortalama kayıt önce yaprak biti ilk 60 kare üzerinden gelen yerleşmiş. Tedavi edilmemiş kontrol için tekrar ediyorum.
3. Tedavi ve tedavi edilmezse varak ki ROI için zaman içinde normalleştirilmiş GFP floresan (ΔF/F) arsa. Tedavi edilmemiş kontrol büyük Ca ^{2 +} geçişler (Yani, ΔF/F yükselir yukarıda 0,2) gösteriyorsa örnekleri (her iki yaprağı) atmak.
4. Genotip en az 20-30 uygun örnekleri analiz var kadar yineleyin.

7. Zaman-ders Video oluşturma

1. 32-gem imge eğe içine heatmaps tıklatarak NucMed_Image AÜSS eklentisi kullanarak dönüştürmek " eklentileri " > " NucMed " > " arama tabloları. " arama tabloları menüsünde seçin " mavi yeşil kırmızı " ısı haritaları için görüntüleri dönüştürmek.
2. Yaprak biti elde edildi GFP vurgulamak için heatmap karşıtlığını sinyalleri kullanarak geliştirin " işlem " > " kontrastı Artır " > " ayarlamak doymuş piksel %. "
3. Ekle zaman bilgi yanında tıkırtı üstünde zaman Stamper eklentisi kullanarak " eklentileri " > " zaman Stamper ". Ayarla " başlangıç saati ", " 0 " ve " aralığı " mikroskobu (Örneğin, 5 s) için kullanılan saat aralığı temel.
4. Bu video bir audio video Interleaved (AVI) dosyası olarak verin.
   Not: Bu video sonra düzenlenebilir daha diğer yazılım paketleri (Örneğin, Microsoft Movie Maker).

Sonuçlar

Şekil 3 ve şekil 4 vardır temsilcisi sonuçları bir yaprak biti tedavi yaprağı Tedavi edilmezse denetimi ile karşılaştırarak bir deneme. Ca^{2 +} dynamics tedavi edilmezse denetim yaprak kalmak nispeten (şekil 3A ve 3B) kararlı iken GFP Floresans çok yerelleştirilmiş bir artış örnekleri, çoğunluğu bir kaç dakika içinde beslenme sitenin etrafında görülebilir. GFP Floresans bazı deneyler (3B rakam) ilk zirve sonra ikincil artar gözlemlemek mümkündür. % 50 tedavi yaprak, yaprak bitleri değil razı ve örnekleri atılmalıdır. Hangi yerleşme oluşur içinde örnekleri örnekleri % 27'si açık artar GFP floresan çevresinde besleme (şekil 3 c ve Tablo 1); içinde sergilemek değil Bu nedenle, 25-30 Çoğalt örnekleri kantitatif analiz için ortalama. Çevrenin görselleştirme ve beslenme sitesi [Ca^{2 +}]_cyt yükselme hızı yaklaşık 110 µm 6 µm/s (Tablo 1) seyahat bir sinyal ortaya çıkarmak. Buna ek olarak, hiçbir [Ca^{2 +}]_cyt yükselmeler sistemik yaprak yaprak biti tedavi, sistemik midrib (şekil 4A) veya sistemik yan doku bölgeleri (şekil 4B) üzerine içinde tespit edilmelidir. Temsil edici bir örnek [Ca^{2 +}]_cyt dinamiklerinin zaman içinde Video 1' de gösterilen. Yaprak biti yerleşim davranışı numarası ve mikroskop altında bireysel dispersiyon olayların süresini izleyerek analiz etmek mümkündür. Bu davranışlar için temsilcisi sonuçları Tablo 1' de, yerleşmeden önce yaklaşık 10 dk yaprak bitleri almak ve başarıyla razı olduğunda, bu ortalama için 20 dakika sürer gösterilen gösterilir. Bu nedenle, böcekler [Ca^{2 +}]_cyt ayrıcalık tamamını için tek bir konum düzenlenmiştir.

Şekil 3: GCaMP3 algılamak yaprak biti elde edildi Ca için kullanılabilir^{2 +} besleme sitedeki müstakil bırakır, sinyalleri. Sol: temsilcisi izlemeler (n = 30) normalleştirilmiş GFP floresan (ΔF/F) 35S::GCaMP3 yaprak. besleme sitenin çevresinde, İzlerini 5 dk 25 dk sonrası yerleşme kadar yerleşmeden önce görüntüler. Denetim eşdeğer bir tedavi edilmezse 35S::GCaMP3 yaprak konumunda =. Sağ: temsilcisi stereomicroscope görüntüsü_cyt 35S::GCaMP3 yaprak ücreti besleme bir yaprak biti görülme [Ca^{2 +}] ayrıcalık. GFP Floresans iç metin ölçeğin göre renk kodlu. Özetlenen beyaz ve beslenme sitesi yaprak biti kimliği ok ucu ile gösterilir. Büyütme: 7,8 X, odak:-127.833 mm, pozlama: 1 s. GFP 450-490 nm metal halide lamba kullanarak heyecan duymuştur ve floresan emisyon 500 ve 550 nm arasında ele geçirildi. (A) bir büyük yaprak biti kaynaklı [Ca^{2 +}]_cyt ayrıcalık örneği. (B) bir ortalama yaprak biti kaynaklı [Ca^{2 +}] örneği_cyt ayrıcalık. (C) hiçbir yaprak biti kaynaklı [Ca^{2 +}]_cyt ayrıcalık örneği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Parametre	Ortalama (± SEM)
[Ca2 +] CYT yükseklik
Örnekleri [Ca2 +]cyt ayrıcalık görüntüleme yüzdesi	% 73
Hızını dalga açık bir	5.9 µm/s (± 0,6)
Yayılan en fazla alan	110 µm2 (± 18)
Yaprak biti davranış
Yerleşir sayısı (> 5 dk)	2 (± 0.1)
Yerleşir (tüm sürelerin) toplam sayısı	3,8 (± 0,4)
B görüntüleme için zaman yerleşti	20 dk (± 2)
Zamana kadar ilk yerleşmek c	11 dk (± 1.4)
Harcanan toplam zamanın yerleşmiş	%62 (± 3)

Tablo 1: [Ca^{2 +}]_cyt yükseklik ve yaprak biti davranış parametrelerini 35S::GCaMP3 sırasında görüntüleme. Parametreleri hesaplanan yerleşme hangi içinde kalıcı örneklerinden > 5 dk oluştu. (A)hızını görünür sinyal başlama noktasından en uzak noktaya yayılmış. (B) süresi Floresans çözümlemesi için kullanılan ilk yerleşim olaylar. (C) görüntüleme başlangıcı ve ilk yaprak biti arasındaki sürenin uzunluğunu yerleşmek. [Ca^{2 +}] Bitki hücre için daha önce gönderdiğiniz _cyt yükseklik verileri (geçerli durumu: ilk QC).

Resim 4: GCaMP3 yaprak biti elde edildi Ca^{2 +} sinyalleri besleme siteye sistemik algılayamaz. Temsilcisi izlemeler (n = 30) normalleştirilmiş GFP floresan (ΔF/F) sitedeki besleme yaprak biti için sistemik yerlerde, 35S::GCaMP3 bırakıyor. İzlerini 5 dk 25 dk sonrası yerleşme kadar yerleşmeden önce görüntüler. Denetim eşdeğer bir tedavi edilmezse 35S::GCaMP3 yaprak konumunda =. (A)ΔF/F sistemik midrib bölgesi. (B) ΔF/F sistemik yan doku bölgesinde. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Video 1: GCaMP3 Variety zamanlı bir yaprak biti beslemeleri olarak. GFP Floresans iç metin ölçeğin göre renk kodlu. Yaprak biti besleme sitesinin konumu ok ucu ile belirtilir. Sol: bir M. persicae için yetişkin maruz 35S::GCaMP3 yaprağı. Sağ: Bir 35S::GCaMP3 no-yaprak biti denetimi yaprak. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Tartışmalar

Bu makalede açıklanan yöntemi bitki gerçek zamanlı analiz için böcek besleme gibi biyotik stres sırasında sinyal Ca^{2 +} sağlar. Bu tür tehditlerin ilk bitki yanıtlarını bir yerelleştirilmiş [Ca^{2 +}]_cyt yükselmesine beslenme çevresinde böcek biri olduğunu gösterir. Mutantlar kullanımı ile bu yöntem sağlayacak böyle sinyallerin moleküler ve fizyolojik karakterizasyonu daha önce mümkün değildi. Bu iletişim kuralı kritik bir adımda müstakil yaprakları (Adım 3.2) ayırma işlemi sırasında veya böcekler yaprakları (Adım 4.5) aktarırken aşırı rahatsız olmadığını sağlamaktır. Geçerli protokol bir mutlak konsantrasyon yerine [Ca^{2 +}]_cyt göreli bir ölçü sağlar verilen bu mikroskop ayarları deney boyunca sabit tutulur hayati önem taşımaktadır. Ayrıca insan önyargı için potansiyel ROIs yelpazesi ve veri analizi sırasında ve bu nedenle, bu deneyler çift-kör yapılmaktadır önerilir.

Bu iletişim kuralı ile biyotik stres sırasında [Ca^{2 +}]_cyt ölçme çok önemli avantajı vardır. Birincisi, tek bir fluorophore ile yüksek bir floresan verimli kullanımı confocal mikroskop kullanarak daha az pahalı olduğu bir stereomicroscope üzerinde yapılacak görüntüleme sağlar. Kaydetmek için bir ölçüm olarak tek bir fluorophore da veri toplama ve analiz basit, kullanır. Buna ek olarak, bir stereomicroscope kullanımına bitki yaprak biti etkileşimler de dahil olmak üzere birçok biyotik etkileşimler meydana büyük bir kayma ölçekte verilen bu gerekli olan tüm yaprakları, görüntüleme için izin verir. Görüntü yüksek zamansal çözünürlük GCaMP3, bağlama^23,30 ve yüksek floresan verim sonra Ca^{2 +} algılayıcı disassociation hızlı temel ile mümkün yakalama, ilâ alınması ölçülerini sağlar Her 5 s. Ayrıca, yaprak tahlil böcek, Bütün bitkiler ^{(hazırlık aşamasında)}üzerinde bu tür deneyler için adım sınırlayan bir anahtar kaçış engeller. Müstakil yaprakları da böcek önce sırasında ve sonrasında beslenme Ca^{2 +} dinamikleri analiz için izin önceden tanımlanmış bir konumdan beslemeleri emin olun. Bu iletişim kuralı da benzer gelişim aşamalarında yaprakları analiz için kullanılmasını sağlar.

Ana dezavantajı ise bu protokol bir sigara ratiometric Biyoalgılayıcı kullanımından kaynaklanır. İle tek-FP biyosensörler, GFP emisyon varyasyon [Ca^{2 +}]_cyt, hücresel pH, hareket veya Biyoalgılayıcı ifade düzeyinde değişiklikler gibi dışında deneysel değişkenleri neden olabilir. YFP CFP enerji aktarımı yalnızca Ca^{2 +} bağlama üzerine gerçekleştiği sırada bu sorunları perde Cameleons ile perde sırasında karşılaşılan değil. Bireysel fluorophores floresan özelliklerini değiştirmek diğer koşullara karşı değişiklikleri CFP yoğunluğunu YFP taklit vermemektedirler ve bunların çoğu ölçülerini doğal olarak kullanılır ratiometric hesaplama normalleştirir diğer optik eserler^23,30. Bu mutlak [Ca^{2 +}]_cyt tahminler FRET Cameleons ile daha güvenilir kılar. Algılamak ve bitkiler^{5,(in preparation)}biyolojik olayları ayırdetmek hala yeterli olsa da sonuç olarak, GCaMP3 en iyi bir Biyoalgılayıcı göreli [Ca^{2 +}]_cyt, ölçmek için kullanılır. Bu nedenle, gözlenen etkisi Ca^{2 +}Ca dahil^{2 +}nedeniyle, olduğunu göstermek için denetimleri kullanmak esastır-genetik mutantlar^{(hazırlık aşamasında)} veya farmakolojik Ca^{2 +} kanal inhibitörleri La^{3 + gibi ilişkili} . Önemlisi, tek-FP biyosensörler genellikle büyük floresan verim ve daha fazla dinamik alan (Yani, Variety Ca^{2 +} bağlama üzerine bir artış) perde Cameleons²³GCaMP için daha uygun hale getirir, daha görüntüler doku düzeyinde görüntüleme, perde Cameleons bir confocal mikroskop^5,25ile hücresel görüntüleme için yararlı bir araç iken.

Bu iletişim kuralı çalıştırılırken, bazı konularda sorun giderme gerektiren ortaya çıkacak mümkündür. Örneğin, bu büyük [Ca^{2 +}]_cyt yükselmeler vardır (tedavi edilmezse) denetim yaprak görüntüler (adım 6.3) atılma örnekleri önerilir. Böyle geçişler olasılıkla mikroskobu tarafından indüklenen stres sonucu oluşur. Gerçekten de, mavi ışık bilinen Ca temin için sinyalleri^{2 + 38,39,40,41}ve yoğun ışık da sıcaklık ve ozmotik vurguluyor, neden olabilir her ikisi de Ayrıca [Ca^{2 +}]_cyt yükselmeler^21,25,42temin. Sonuç olarak, böyle stres azaltmak için iyi havalandırılmış ve ısı kontrollü bir odada deney yapmak için ve gereksiz yere uzun pozlama süreleri önlemek için önemlidir. Yaprakları aşırı dekolmanı veya dokunmatik elde edildi [Ca^{2 +}]_cyt yükselmeler^43,44,45önlemek için mikroskobu sırasında değil bozmaya önemlidir. Sorunlarla da böcek yerleşme ile karşılaşılabilir. M. persicaeile böcekler birkaç örnekte yapraklarda razı değil. Bu yara elde edildi savunmasında müstakil yaprakları^46,47ya da böcekler tarafından mavi ışık rahatsızlık sonucu olabilir. Nitekim, M. persicae imgelemde 490 nm⁴⁸bir en yüksek hassasiyetle da dahil olmak üzere üç photoreceptors tarafından yönetilir. Mikroskopi maruz kalma azaltmak ve yaprak biti itina ile işleme sıkıntı azaltmak ve yerleşme teşvik olabilir.

Geçerli kağıt özetlenen Protokolü bitki böcek etkileşimleri moleküler anlayışı ve biyotik stres bitki yanıt üzerine yeni anlayışlar verir. Bu böcek besleme için ilk bitki yanıtlardan birini görselleştirme sağlar ve araştırmalar önemli Arabidopsis genetik kaynakları kullanılabilir kullanımı ile daha da kolaylaştırır. Ayrıca, bu iletişim kuralı için canlı organizmalar, kullanımına izin verir olarak⁴⁹ veya elicitors⁵⁰ayıklar. Gelecekte, bu teknik ek böcek türleri, nematodlar veya mikrobiyal patojenler, gibi diğer biyotik streslere yanı sıra abiyotik stres uygulanabilir. GCaMP3 mikroskobu diğer bitki doku, yaprak veya hatta bütün bitkiler alternatif ROIs görüntü için de değiştirilebilir. Ayrıca, genetik olarak Biyoalgılayıcı için potansiyel olduğunuly ek bitki türü kodlanmış. Sonuç olarak, bu yazıda belirtilen iletişim kuralı moleküler temeli bitki ve diğer türler arasında roman biyotik etkileşimlerin bir aralıktaki sinyal Ca^{2 +} gizli potansiyeline sahiptir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S::GCaMP3 Arabidopsis	John Innes Centre/Universty of Wisconsin	-	Step 1.1
100 mm2 square plastic plates	R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK		For growing GCaMP plants (Step 1.1)
¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium	homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water	-	For growing GCaMP plants (Step 1.1)
Col-0 Arabidopsis	-	-	For growing aged aphid colony (Step 2.1)
Myzus persicae(Sulzer)	clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn	-	Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1)
Artist's paintbrush size 2	Hobbycraft	610101	To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6)
96-well MicrotitreTM plate	ThermoFisher Scientific	2101	To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2)
Aluminium foil	Wrap Film Systems, Telford, UK	26B06	To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3)
Clear plastic wrap	SC Johnson & Son, Racine, WI, USA		To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7)
M205FA stereo microscope	Leica Microsystems	-	For GFP imaging (Step 4.1)
Leica Application Suite v3.2.0	Leica Microsystems		Microscope software (Step 4.1)
Fiji (Image J) v1.48a	National Institutes of Health, USA)	-	For image analysis (Step 6.1)