Bir E. coli -bulaşıcı Bacteriophages sentezi ifade sistem boş hücre tabanlı

Özet

Boş hücre transkripsiyon-çeviri platformları yeni nesil Gen devreleri yürütülmesi ile biyokimyasal sistemleri vitro oluşturmak için tasarlanmış. Bu makalede, nasıl bacteriophages MS2, ΦΧ174 ve T7, gibi bir bütün E. coli boş hücre TXTL sistemini kullanarak kendi genom sentezlenmiş açıklayın.

Özet

Boş hücre transkripsiyon-çeviri (TXTL) sistemleri, bir daha fazla çok yönlülük ve modülerlik, temel ve Uygulamalı Bilimler test tüpü tepkileri gerçekleştirmek için yeni yetenekleri sağlamak için tasarlanmış yeni bir nesil. Son on yıl içinde boş hücre TXTL roman çok disiplinli araştırma alanları ile ilgili nicel ve sentetik Biyoloji geniş bir yelpazesi için güçlü bir teknik haline gelmiştir. Yeni TXTL platformlar oluşturmak ve sentetik veya doğal gen devreleri yürütülmesini biyokimyasal sistemlerde sorgulamak özellikle yararlıdır. Vitro TXTL uygun hızla prototip düzenleyici elemanlarının ve biyolojik ağlara de özetlemek için kendinden montajlı mekanizmaları oturma sistemlerinde bulunan moleküler kanıtlamıştır. Bu makalede, tarif biz nasıl bulaşıcı bacteriophages, gibi MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA) ve T7 (dsDNA), tamamen kendi genom kullanarak tüm Escherichia coli, TXTL sistem boş hücre bir pot reaksiyonlarda gelen sentez. Üç coliphages sentezi plak tahlil kullanarak sayılabilir. Gösterdiğimiz nasıl sentezlenmiş fajının verim reaksiyonlar biyokimyasal ayarlarına bağlıdır. Moleküler kalabalık, taklit 8000 PEG, kontrollü bir konsantrasyon büyüklükleri emriyle sentezlenmiş phages miktarını etkiler. Biz de phages yükseltmek ve onların genleri arındırmak anlatan. İletişim kuralları ve sonuçları bu çalışmada sunulan bir dizi boş hücre sentetik Biyoloji ve Biyomühendislikte multidisipliner araştırmacılar dahil ilgi olmalıdır.

Giriş

Son on yıl içinde ifade boş hücre teknolojisi acil çok disiplinli araştırma alanları ile ilgili sentetik ve nicel Biyolojide adres roman uygulamaları için tasarlanmış. Aslında proteinler yaşayan bir organizma bağımsız ifade etmek için kullanılan, önemli ölçüde bu teknoloji kapsamını genişleterek her iki temel ve Uygulamalı Bilimler^1,2, yeni boş hücre TXTL sistemleri geliştirilmiştir. TXTL platformları yeni nesil kullanıcı dostu, olmak için tasarlanmış daha verimli (2 mg/mL toplu iş modu³protein sentezi, daha ulaşan) transkripsiyon⁴düzeyde çok yönlü ve böylece olarak için modüler kolayca roman doğal entegre veya varolan biyolojik sistemleri^5,6yeteneklerini genişletmek sentetik işlevleri. Özellikle, boş hücre TXTL sistemleri tasarım yapı testin azaltarak, düzenleyici elemanlarının veya küçük genetik devreleri^7,8,9, gibi genetik programların hızlı prototipleme için kullanışlı hale gelmiştir bir kaç gün için döngüsü. Dikkat çekici, yeni TXTL da coliphages^10,11güçlü aktif genomik sulandırma desteklemek için yeterli performans gösteren, tam sentezi gibi büyük DNA programları işleyebilme yeteneği olan sistemlerdir DNA canlı varlıklar kodlanmış.

TXTL sistemleri geleneksel vitro yapıcı biyokimyasal deneyleri için karşılaştırıldığında birçok teknik avantajları mevcut. Boş hücre TXTL gen ekspresyon sürecin nihai ürün yaşam hücrenin karmaşık sitoplazma aksine, azaltılmış ve açık bir ortamda bağlar. TXTL DNA, modern DNA montaj teknikleri ile uygun fiyatlı ve titiz protein saflaştırma adımlar gerektirmeyen yanı sıra hızlı olan biyokimyasal sistemleri vitro, yeniden oluşturmak için kullanır. İfade boş hücre bileşenlerinin biyokimyasal reaksiyonlarda böylece moleküler etkileşimleri¹²daha derin bir diseksiyon izin doğrudan erişim sağlar. TXTL tepki olarak bir yaşam hücrede neredeyse imkansız olacaktır, biyokimya ve biyofizik ayarlarını değiştirebilirsiniz. Bu avantajları ve son gelişmeleri göz önüne alındığında, TXTL teknoloji sentetik ve nicel Biyoloji için alternatif bir platform olarak daha popüler hale geliyor. TXTL standart bir teknoloji olan Biyomühendislik hale geliyor ve TXTL kullanarak araştırma topluluğu hızla büyüyor olsa da, nasıl TXTL reaksiyonlar ve için icra etmek ile ilgili yeterli yöntemler geliştirmek için böyle platformlar kullanılacağını anlamak önemlidir sonuçların yorumlanması.

Bu makalede, biz nasıl sentez, one-pot tepkiler onların genom¹¹, MS2 gibi bacteriophages için bütün bir E. coli TXTL sistemi kullanılacağını açıklar (RNA, 3.4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5.4 kb) ve T7 (dsDNA, 40 kb). Biz nasıl phages miktarı ile ilgili olarak bazı reaksiyonlar (magnezyum ve potasyum konsantrasyonu) biyokimyasal ayarları değişiklikleri sentezlenmiş gösterir. Moleküler kalabalık, taklit bir PEG aralığı 8000 konsantrasyonları ile büyüklükte birkaç emir fajının sentezi üzerinde dramatik bir etkisi vardır. Aynı anda transkripsiyon, çeviri, süreçleri özetlemek ve kendinden montajlı Biyoloji ve biyofizik ile ilgili temel sorulara adresleme için ilginç tek tüp reaksiyonlar büyük tür biyokimyasal sistemlerde gerçekleşme ¹⁰ (gen düzenlemesi, kendinden montajlı), yanı sıra yeni nanoyapıların¹³oluşturmak için fajının işlevleri repurposing gibi uygulamalar, geliştirmek gibi. TXTL üzerinde bir pratik ek olarak, biz yöntemleri fajının amplifikasyon, genom çıkarma ve arıtma ve FAJ miktar için plak tahlil tarafından sağlar. Bu el yazması sunulan E. coli dayalı özü boş hücre sistemleri kullanan ve bacteriophages içinde ilgilenen araştırmacılar için uygun yöntemlerdir.

Bu çalışmada sunulan protokolleri takip özetlenebilir: 1) fajının amplifikasyon (gün 1: aşılama hazırlamak hücreleri, 2. gün: tek plak, birden çok fajının büyüme ve konsantrasyon ve 3. gün: FAJ arıtma), 2) çift sarmallı genomu DNA ekstraksiyon (fenol/kloroform çıkarma) ve 3) boş hücre fajının tepki ve titresi deney (gün 1: konak hücreleri plaka ve Ağar Kaplamalar, yapmak 2. gün: öncesi kültür ve gün 3 hücre hücre-Alerjik reaksiyon ve ana bilgisayar: konak hücre kültür ve FAJ titresi).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Not: aşağıdaki yükseltme adımları ve ayıklama yöntemi birçok çift iplikçikli DNA FAJ, Örneğin, bakteriyofaj T7, enterobacteria fajının T4 veya enterobacteria fajının λ (L) için büyük ölçüde genelleştirilebilir. Kimin genom ticari kaynaklardan satın almak için hazır değil bir fajının için ağırlıklı olarak kullanıldıkları.

1. fajının amplifikasyon

Not: tek-plak, çok döngüsü (SPMC) fajının üretim tekniği de T4 fajının Chen, vd., için anlatılan ¹⁴ aşağıdaki fajının amplifikasyon ve DNA ekstraksiyon yöntemi olan E. coli çift iplikçikli DNA phages, örneğin, T7, T4 veya L. ile kullanmak için bir genelleme İletişim kuralının nihai başarı ağırlıklı Seçili ana hücre zorlanma bağlıdır ' superinfection koşullara dayanacak şekilde s yeteneği. Konak hücreleri superinfection altında kararsız olan ya da superinfection asla ulaştı ve lizis asla bu kritik aşamada sınırına ulaşılmışsa Konfluent lizis protokolü ile devam etmek en iyisidir. Bu yüksek hızlı Santrifüjü ve ultrasantrifüj hızlarda fajının peletleme hücresel enkaz ayıran içerir. Tüm aşağıdaki koşullar ve parametreleri genel başlangıç noktası olarak tasarlanmıştır. Bir yerel ana hücre satırı için en uygun koşulları farklı olabilir; belirlemek ve uygun koşullar uygun.

1. Aşılama hücreleri hazırlamak
   1. 10 mL Luria-Bertani (LB) medya bir 15 mL kültür tüp E. coli ana bilgisayar hücrelerle aşılamak örneğin, B veya K12.
   2. Yer 250 devir/dakika ve 37 ayarla bir shaker ile doygunluğu büyümeye ° C. bırak gecede.
2. Tek-plak, çok döngüsü fajının büyüme ve konsantrasyon
   1. yetkili fajının plaklar bir tabak hazırlamak için 1 h için 37 ° C'de birkaç LB-Ağar kaplamalar sıcak, veya bir gece.
   2. Fajının stokunun (Örneğin, T7, T4 veya L) ~ 10 ² -10 ³ fajının/mL için amaçlayan LB medyada bilinen konsantrasyonunun birkaç dilutions hazırlanın.
   3. Ekle 100 µL konsantre konak hücre her plaka için gecede büyüme.
   4. Hazırlanan hacimleri Seç fajının dilutions 10-100 fajının/tabaktan bir aralığa karşılık gelen. Her plakasına fajının dilutions gerekli hacmi ekleyin (örneğin, 10 ³ fajının/ml; 100 µL bu ~ 100 plaklar üretmek gerekir). Tabak 37 ° C'de kuluçkaya ve başlamak bir sayım-up zamanlayıcı (+ 0 h). 4-5 h için kuluçkaya
   5. 250 mL şişe ve yer döner shaker 250 devir/dakika ve 37 49 mL LB medya hazırlamak ° C.
   6. , + 2,5 h, seyreltik hücreleri 50 x 1 mL doymuş hücre kültürünün gecede büyüme 49 mL LB orta içeren önceden ısıtılmış bir şişesi içine ekleyerek. Hücreleri günlük büyüme (+ 4-5 h) ulaştığınızda, 600 Absorbans ölçmek nm (OD ₆₀₀). 1.0 = 8 x 10 dönüşüm OD ₆₀₀ kullanarak hücre konsantrasyonu belirlemek ⁸ hücre/mL.
   7. Dilute 2 x 10 ⁷ hücre/mL ek LB büyüme ortamını kullanma. Kuluçka makinesi üzerinden fajının plaklar içeren agar plaka kaldırın. Hemen bir steril Pasteur pipet sonu çekirdek ve tek bir plak kaldırmak için kullanın. Plak seyreltilmiş hücrelere darbe ve bir ek 2 h (+ 6-7 h) için 37 ° C'de kuluçkaya.
   8. Test bir 1,5 mL tüp, ekleyerek 10 µL kloroform (CHCL ₃), ve hemen vortexing yüksek hızda bir 500 µL örnek alarak tam enfeksiyon için. Çözüm açıklık vardır gözlemlemek. Sonra hücreleri tamamen bulaşmış, kuluçkaya başka bir 2 h (+ 8-9 h için).
      Not: hücreleri tamamen bulaşmışsa, onlar hızla lyse (< 2 dk) ve çözüm açıklamak. Diğer sonuçlar tartışma bölümüne aşağıdaki kabul edilir. Hücreleri superinfected ama şu ana kadar koşullar değil. Lizis başlıyorsa, ayrıca Dnaz ve Santrifüjü tarafından hasat fajının yıkımı önlemek hemen başlamalıdır.
   9. Ekleyin Dnaz 5 µg/mL ve santrifüj 8.000 x g 4 ° C'de cips için de hücreleri. Süpernatant atmak. Pelet 1 x TRIS magnezyum klorür (TM) (50 mM Tris pH 7.8, 10 mM MgCl ₂) 10 ml 5 µg/mL ile Dnaz tampon resuspend. CHCL ₃ ve girdap 500 µL hücreleri parçalayıcı için yüksek hızda ekleyin. 4 12.000 x g 10 dk de Santrifüjü tarafından açıklık ° C. Decant 15 mL konik tüp ve 4 mağaza içine süpernatant ° C.

2. Feyc arıtma

Not: Sükroz arıtma fajının boyutunu büyük ölçüde bağımlı. Dikkat edilmesi gereken noktalar izole olmak Feyc kitle için yapılması gerekecektir ve degrade koşulları ayarlamalar yapılır. 10 ¹³ fajının/mL son viral titreleri bu yöntemle kolayca ulaşılabilir.

1. %5 ve % 45 w/v Sükroz 1 TM arabellek x 12 mL hazırlayın.
2. Hazırla 4 x 5-%45 Sükroz degradeler % 45 Sükroz 4 ultracentrifuge tüpler içine pipetting 2.5 mL tarafından. İle en iyi ~ % 5 sukroz, sıvı 2 mm tüp RIM ulaştığında durur 2.6 mL.
   Not: pipet ucu Sükroz çözüm yüzeyine temas yerleştirin ve yavaş yavaş sıvı dağıtmak. Hafif Sükroz çözüm üstüne daha ağır, ayrı bir sınır oluşturan yüzer olacak. Düzgün katmanlı bir çözüm ~ 1 mm arayüzü arka plan ışığı karşı düzenlenen olacak.
3. Mix degradeler Degrade aracı 43 için şekillendirme kullanarak tilt-tüp döndürme tarafından s 86° 23 rpm de. Hemen gerekirse kapak ile parafin film ve depolamak saat 4'te ° C.
4. Her üstünden kaldır 500 µL Sükroz gradyan ile 1 mL pipettor ve denge için ± 0,002 g. içinde hazırlanan
5. Havuzu fajının süspansiyonlar tüm tüpler (Adım 1.2.9 yükleme) üzerinden. 1 mL pipet kullanarak süspansiyon 500 µL ucunu sıvı yüzeyi ile temas getiren ve çok yavaş hızlı pipetting ile karıştırmak değil dikkatli olmak Sükroz geçişin üst birimi dağıtımı tarafından ekleyin. 4 ° C'de 20 dk için 70.000 x g, santrifüj
   Not: Denge içinde ± 0,002 g. daha küçük phages için degradeleri hazırlanan ilâ 1 h sürebilir
6. Bir steril enjektör ve künt kanül kullanarak fajının bantları çıkarın.
   Not: yan görüntülendiğinde fajının grup yaklaşık 5 mm içinde yükseklik, çevreye göre kalın ve sütlü olacak ve santrifüj tüpü aşağı yarı yolda yer alan.
   1. Submerge künt kanül ucu kadar çözüm içine fajının grup çok üst kenarında ortalanır. Feyc grup çoğunluğu kaldırılıncaya kadar şırınga pistonu üzerinde çizerek grup kaldırmak.
7. Askıya alınmış fajının Sükroz birimle 3-4 ultracentrifuge tüpler için ekleyin. En fazla 1,5 mL/tüp ekleyin. ~ 3-4 dolgu soğuk 1 tüp üstünden mm x TM. Parafin film ile kapak ve karıştırmak için tersine çevirin. Bir ultracentrifuge ve 145.000 x g 4 ° C'de 1 h için spin geri yerde cips için. Daha küçük phages 2 h. sürebilir
8. Hızlı bir şekilde süpernatant dökün ve baş aşağı drenaj tek kullanımlık mendil. Aşırı süpernatant kaldırmak için steril pamuklu çubukla ile tüp içine silin.
9. Bölmek TM tüm granül ve gecede 4 ° C'de resuspend 200-400 µL soğuk 1 x; sallama yok gereklidir.
   Not: Pelet temiz, değilse membran, Örneğin, kılçıklı parçaları DNA, vb, havuz ve ek Santrifüjü 17.000 x g. adlı bir microcentrifuge gerçekleştirmek
10. Titreleri, yapmadan önce gün E. coli konak hücreleri 10 mL LB büyüme medya kültürünün hazırlamak ve 250 devir/dakika ve 37 ° C gece ayarla titreyen bir kuluçka makinesine bırakın. Kültür plakaları için en az 1 h 37 ° C'de uygun miktarda titreleri fajının stokunun yapmadan önce kuluçkaya.
    Not: Kuluçkaya plakaların kaplama Feyc stokunun dilutions sayısına bağlıdır: her benzersiz seyreltme fajının stokunun iki kültür tabak gerektirir (örneğin, dört farklı dilutions fajının stok gerektirir sekiz kültür plakaları).
11. En iyi agar 100 mL 100 mL şişe 2.5 g LB ve 0.6 g bacto-agar ekleyerek hazırlayın. 100 mL ve basınçlı kap hacmi deiyonize suyla halinde katı geçiyoruz. Otoklav sonra yavaş yavaş şişe 6 - 8 kez ters çevir'i çözüm boyunca agar homojenize için. 15-20 dk sıcaklık . equilibrate 45 ° C su banyosunda şişe koyun
12. LB çözüm ile fajının stoklarının seri seyreltme hazırlayın.
    1. Ekleyin 990 µL LB 10 µL fajının stok 100-fold seyreltme için. Homojenize girdap. İçin bir seyreltme faktörü 10 fajının stokunun 100 µL eklemek için 900 µL LB. girdap lunaparkçı.
    2. Yukarıdaki seyreltme serisi olarak plaklar (10-100 plaklar) sayılabilir bir dizi elde etmek için gerektiği kadar yineleyin.
       Not: Bunu başarmak için 2-3 büyüklük beklenen fajının verim fajının/mL tepki açısından daha az fajının hisse senedi sulandırmak. Belirli fajının hisse senedi 10 ¹¹ bulaşıcı fajının/mL içeriyorsa, örneğin, bir 10, fajının hisse senedi plaka ⁸-kat veya 10 ⁹-seyreltme katlayın.
13. Bir alan 14 mL kültür tüpler (kültür tüpleri sayısına eşittir kaplama Feyc hisse senedi dilutions sayısı) birleştirerek fajının titreleri için hazırlamak. 2.12. adımdaki seyreltilmiş fajının hisse senedi örnekleri ve ana bilgisayar bakteri hücreleri adım 2.10 buz üzerinde yer
14. Ana bir karışım hazırlamak 5,25 mL üst agar (Adım 2.11) by pipetting, 220 µL fajının örnekleri (Adım 2.12) seyreltilmiş ve 50 µL ana bilgisayar bakteri hücreleri (Adım 2.10) 14 mL kültürüne tüp. Kültür tüp ve girdap yüksek hızda kap.
    1. 4'te kalan fajının çözüm depolamak ° C.
15. 37 ° C kuluçka iki kültür tabak (Adım 2.10) almak. 2,5 mL ana karışımı yavaş yavaş ilk plaka (olmadan kabarcıklar) Merkezi ekler. Tüm kültür plaka kapsaması el ile ana karışımı eşit dağıtmak için plaka Yavaşça döndürün. İkinci plaka ile yineleyin. En iyi agar katılaşma sağlamak için 20 dakika bekleyin. Plakalar için 4-7 h. 37 ° C'de kuluçkaya
16. Plaklar saymak ve her reaksiyon örnek fajının konsantrasyonu belirlemek.
    Not: Plaklar opak halı konak hücre içinde 1-2 mm açık daireler olarak görünür. Temsil edici sonuçlar için bkz. şekil 1. Başarılı fajının üretim son 10 ¹² -10 ¹³ fajının/mL konsantrasyonlarda sonuçlanır.

3. Çift sarmallı genomu DNA ekstraksiyon

Not: sallayarak, seyreltme ve Santrifüjü adımları kalın, katı protein sınır tabaka fenol ve sulu aşamalar arasında geliştirmek için optimize gerekir. Bu protein kirleticiler ücretsiz yüksek saflık genleri oluşturur. İlk seyreltme son fajının titresi üzerinde bağlıdır. Bir son derece yüksek titresi fajının stok (≥ 10 ¹³ fajının/mL) düşük titresi stokları (~ 10 ¹⁰ -10 ¹¹ fajının/mL) sadece gerekebilir süre emme önce 10-20-kat seyreltme gerekebilir bir logosuna 2 kat veya hiçbiri. Sonraki adımlar bir katı protein katman oluşturmak zordur veya sulu süspansiyon nedeniyle yüksek DNA toplama uygulanabilir olmak çok yapışkan çıkarma devam etmeden önce daha yüksek bir seyreltme fajının stoklarının düşünün. Herhangi bir genom işleme adımı sırasında herhangi pipetting wide-geçişli pipet ipuçları kullanmak önemlidir sulu aşamaları. Birçok fajının genleri oldukça büyük ve kolayca pipet kesme yoluyla parçalanmış. Bu ağır yamultmak genleri Ayrıca, herhangi bir vortexing açıkça kaçınılmalıdır.

1. TM arabellekte bir taze 1,5 mL tüp x 1 adım 2,9-400 µL fajının stoktan bir kısmını sulandırmak.
2. Tris:Phenol:Chloroform eşit bir hacmi seyreltme için ekleyin. 5 dk. santrifüj kapasitesi için 5-10 dakika süreyle benchtop santrifüj 17.000 x g de sonuç emülsiyon karışımı yavaşça bir laboratuvar rocker veya elle sallamak
   Not: Bir farklı ve beyaz protein temel fenol faz yüzeyinde mevcut katmanıdır.
3. Üst sulu faz Interphase sınır bozmamaya dikkat çekici bir yeni tüp için kaldırmak.
4. Adımları 3.2-3.3 ek 3 fenol çekimi toplam için 2 kere tekrar edin. Sulu faz için taze bir tüp aktarmak ve CHCl ₃ eşit bir hacmi ekleyin. Sallamak ve santrifüj (Adım 3.2). Sulu DNA örneği için temiz bir tüp transfer.
5. Saf DNA hacmi tahmin ediyoruz. 3 M sodyum asetat (CH ₃ COONa) 0.4 hacimleri ve % 95 etanol (alkol) 3 cilt ekleyin. -20 ° C-dondurucu gece yağış için yerleştirin. Santrifüj benchtop santrifüj 10-15 dakika süreyle 17.000 x g,
   Not: DNA hemen kurutmak ve süspansiyon tüp içinde bir kitle olarak görünür hale gelir. Beyaz ve tüp alt karşı iyi paketlenmiş uygun elde edilen Pelet.
6. Kaldırmak ve süpernatant ya decanting ya pipetting atın. 500 µL % 70 eklemek alkol ve Pelet ücretsiz tüp alttan yüzen kadar tüpü yavaşça çalkalanır. Santrifüj kapasitesi 17.000 x g 5 dk. Kaldır ve alkol, pelet bozmamaya dikkat çekici atın.
7. Tekrarlama adım 3.6. Hava üzerinde benchtop için 30-60 dk. ekle 50 µL GKD ₂ O pelet pelet Makinası ve RT, 1 h için kuluçkaya veya bir resuspend için 4 ° C gece. 280 emme ölçüler kullanarak DNA konsantrasyonu belirlemek nm.
   Not: Beklenen konsantrasyonları vardır 0.5-5 µg/µL bu tekniği kullanarak. Toplam genomik moleküler son genom konsantrasyonu belirlemek için ağırlık tarafından bölmek.

4. Fajının tepki ve FAJ titresi deney boş hücre

1. hazırlamak 25 g LB orta ve 15 g bacto-agar katı, bir 1 L şişe içine dökün ve deiyonize su 1 L. otoklav ekleyin.
2. Sterilizasyon sonra şişe kabarcıklar oluşumunu önlemek için yavaş yavaş 6 - 8 kez alarak bakım ters çevir. Şişe ters agar katı 1 L çözüm boyunca homojenize. Kültür plakalar dağıtım önce 20 dk 58 ° C su banyosunda şişe yerleştirin.
Bir kez LB-agar çözüm sıcaklığını equilibrated,
3. bir alev çevrenin açık kültür plakaları yakınındaki sterilize etmek için kültür plakaları yanında hazır olun. 1 L şişe su banyo aliquots yaparken agar katılaşma önlemek için tutmak. 25 mL 100 mm x 15 mm kültür plaka ekleyin. 1 L 40 kültür plaka üretecek.
4. Bir kültür plaka bir kenara koyun ve en az 1 h RT için kuvvetlendirmek izin; bu plaka konak hücreleri kaplama için kullanılacaktır. 39 kültür tabak 2 gündür RT. dükkanında 4 ° C'de kuvvetlendirmek veya hemen titreleri yapmak için kullanmak olsun.
Uygun bakteriyel zorlanma (Örneğin, ana bilgisayar streaking tarafından konak hücreleri
5. plaka B T7 için) bu LB-agar kültürü plaka üzerine-80 ° C'de depolandı. Çevre kirlenmesini önlemek için açık alev yanında çizgi. Gecede 37 ° C'de kuluçkaya Steril bir ortamda çalışmaya önemlidir bu yüzden konak hücreleri yok antibiyotik direnci var.
6. Hücre-Alerjik reaksiyon
   Not: Ham E. coli ayıklamak (8.9-9,9 mg/mL protein) diğer reaksiyon tamponu ve FAJ genomu oluşan % 67 ile % 33 boş hücre TXTL reaksiyonlar oluşur. Ham özü olarak daha önce açıklanan ^{15 , 16} hazırlanır. Son reaksiyon koşulları: 8.9-9,9 mg/mL protein (gelen ham ekstresi), 3-6 mM Mg-Glutamat, 40-100 mM K-Glutamat, % 2-4 8000 PEG, 3-4 mM yukarıda açıklanan ¹⁷ ve açıklanan bir enerji mix çözüm hazırlanan her amino asitin daha önce ¹⁵, 0,33-3,33 ile oluşan mM DTT, 50 mM HEPES, 1.5 mM ATP ve GTP, 0.9 mM CTP ve UTP, 0.2 mg/mL tRNA, 0,26 mM CoA, 0,33 mM NAD, 0,75 mM kampı, 0.068 mM folinic asit, 1 mM spermidine ve 30 mM 3 PGA. DNA tipi phages 0.5-10 nM konsantrasyonları genom çalıştırmaları ve RNA türü phages 50-150 nM bir dizi gerekir. Son tepki konsantrasyonları sentez belirli fajının benzersiz ve yukarıda açıklanan aralıklarda düşecek. İçin optimal oksijenlenme reaksiyonların son tepki birimleri 10-20 µL arasında olmalıdır. Genomik molekül forma bağımlı olan reaksiyon protokolündeki küçük varyasyon vardır. Örneğin, doğrusal genom molekülleri başka bir bileşen tarafından ham hulâsa içinde mevcut recBCD enzim doğrusal DNA parçaları sindirim etkisizleştirmek için tepki gerektirir.
   1. Tam " reaksiyon ayrıntıları " reaksiyonlar toplam sayısı ve tepki son hacim girerek Tablo 1 (PhageTXTL_JOVE) bölümünde.
   2. Reaksiyon değişken bileşenleri ve sürekli bileşenleri belirleyerek deney tasarlayın. Sürekli reaksiyon bileşenleri son tepki birim ve örneklerin sayısını ürün için Toplam hacim oranı ana mix fraksiyonel cilt yüzdesini girin. Girmek belgili tanımlık stok ve reaksiyon reaktifler son konsantrasyonları " Master Mix tepki tarifi " PhageTXTL_JOVE bölümünde. Girmek belgili tanımlık stok ve sınanacak değişken reagent(s) son konsantrasyonları.
      Not: Reaksiyon bileşenleri hacimleri otomatik olarak hesaplanabilir ana mix birim ve son birim her bireysel tepki temel.
   3. Tüpler gerekli miktarda kaldırma (belirtilen " çözülme tüpler " PhageTXTL_JOVE.xlsx bölümünü) ham hücre özü, enerji arabellek mix ve amino asit karışımı-20 ° C veya-80 ° C ve buz üzerinde tezcan
      Not: Bir kez çözdürülen, bileşenler gibi birden çok aliquots (gerekirse) birleştirmek.
   4. Aliquot belirtilen birimin ham özü, son tepki hacminin % 33 microcentrifuge tüpüne.
   5. Tablo 1 göre ana karışımı hazırlayın. Tüm bileşenleri altında homojenize " Master Mix tepki tarifi " tarafından vortexing. Her bileşenin uygun cilt ham özü ekleyin.
   6. Eğer bir Feyc ile doğrusal DNA genom (Örneğin, T7), ile çalışma bakteriyofaj lambda gam protein 1 µM tepki ¹¹ ' e ekleyin. Girdap çözüm homojenize ve 5 min için buzda tepki yerleştirmek için. Bu ham hulâsa içinde endojen sindirim doğrusal DNA parçaları karmaşık, recBCD tarafından inhibe.
   7. Tablo 1 göre son bileşen ekledikten sonra reaksiyon vortexing tarafından lunaparkçı. Ana karışımı n microcentrifuge tüpler içine bölünmüş.
      Not: Her bir Split kesirli ana mix hacmi yüzde ürün ve tepki son hacim birimdir. Örneğin, % 90 kesirli ana mix ses yüzdesi ve 12 µL son tepki hacmi için her bir Split 10.8 µL birimdir.
   8. Ana mix diziye değişken bileşenleri belirtilen birimleri ekleyin (bkz. Tablo 1). Su her tepki istenen son tepki birim ulaşmak için ekleyin. Her reaksiyon vortexing tarafından lunaparkçı. En az 8 saat veya gece boyunca 29 ° C'de microcentrifuge tüpler kuluçkaya.
7. Konak hücre öncesi kültür
   Not: seyreltilmiş 50: 1 titresi deneme için kullanılan ana hücreleri enfeksiyon verimliliği artırır orta log fazı içinde olduğundan emin olmak için gece öncesi kültürdür. Orta günlük hücre sonra tarafından 10 kat yeniden konsantre ve buz üzerinde depolanır.
   1. Steril pipet ucu kullanarak 5 mL LB 3-5 sağlıklı konak hücre koloniler ile bir kültür tüp aşılamak. İş kirlenmesini önlemek için açık alev yanında.
   2. Kültür tüp 37 ° C ve 250 devir/dakika, titreyen bir kuluçka 16 h veya gece kalmak için kuluçkaya. Hücreleri diğer gün doygunluk faz ulaşabilirsiniz.
8. Hücre kültür ve örnek hazırlama fajının titresi için ev sahipliği
   1. alüminyum folyo ile 500 mL Erlenmeyer şişesi ve kapak içine 50 mL LB dağıtmak. 20 dk. 37 ° C'de şişeye sıcak
   2. Konak hücre gece öncesi kültürün içine Önceden ısıtılmış LB. kuluçkaya 37 ° C'de 3-4 h ve 250 devir / dakikada sallayarak için aliquot 1 mL.
   3. Santrifüj 50 mL konak hücre kültürü 5000 x g., 10 min için atmak lb
   4. Pelet soğuk (4 ° C) 5 mL LB ile resuspend ve buz üzerinde tutmak
   5. Titresi deney başlamadan önce bir saat kuluçkaya kültür plakaları 37 ° c
      Not: Her benzersiz fajının reaksiyon (ve karşılık gelen seyreltme faktörü) iki tabak kullanacak. Ayrıca, (bkz: şekil 1 temsilcisi pozitif ve negatif denetimlerinde) deneysel denetimler için 4 plakaları kuluçkaya.
   6. Hazırlamak en iyi agar (Adım 2.11) 100 mL.
9. Boş hücre tepki LB çözüm ile seri bir seyreltme 2.12 bölümünde açıklandığı şekilde hazırlayın.
10. Fajının titresi
    Not: plakasına kültür yemekleri için en az 1 saat inkübe ve otoklav kaldırılması sonra 15-20 dk 45 ° C su banyosunda üst agar yapıldı sonra başlar.
    1. Titresi son hücre Alerjik reaksiyon-LB çözüm 2, bölümünde açıklanan adımları 2,14-2.16.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Biz dört temsilcisi sonuçları göster. Şekil 1' de, biz boş hücre TXTL sistemi ve FAJ DNA stokları yaşam ile kontamine değil olduğunu emin olmak için negatif denetimler kümesi mevcut E. coli hücreleri. Boş hücre TXTL sistem sağlam E. coli ücretsiz olduğundan emin olun hücre kirlenme genomik DNA (şekil 1A veB şekil 1) geçersiz b...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Chen, et al. teknikte takip ¹⁴ SPMC için önemli bir adım superinfection için uygun koşullar belirlerken ulaşılır. En yakın bir ana yük'ın yeteneği superinfection dayanacak şekilde denetleyen parametre sık ilk bulaşmasını fajının bölgedir. Konak hücreleri Logaritmik büyüme aşamasında ilk enfeksiyon fajının çok küçük bir miktar ile önce olması gerekir. Sonunda, fajının Ayrıca Logaritmik büyüme ulaşacak ve bırakmak fajının her konak hücrede birden ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultracentrifugation tubes	Beckman Coulter	344057
Conical tubes	Falcon	352070
Gradient maker	BioComp Gradient Master	see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9.
Syringe and Blunt Cannula	Monoject	8881513918 and 888202017
Wide-bore pipette tips	Fischerbrand	02-707-134
Plaque counter	New Brunswik Scientific	Colony Counter Model C-110
Culture tubes	Fischerbrand	14-961-33
Cell-free system	Mycroarray Inc	Mytxtl
BioComp Gradient Master	BioComp Instruments	Model 105ME
LB agar plate recipe			25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - product number 214010).