Kitosan-esaslı enjekte edilebilir Hydrogels ve kendi uygulamasında 3D hücre kültürü hazırlanması

Özet

Burada facile hazırlanması enjekte edilebilir hydrogels kitosan tabanlı dinamik imin kimya kullanarak açıklar. Hidrojel'ın mekanik mukavemeti ve 3D hücre kültürü kendi uygulamasında ayarlamak için yöntemleri sunulmaktadır.

Özet

Protokol kitosan tabanlı hydrogels dinamik imin kimya kullanarak hazırlamak için facile, verimli ve çok yönlü bir yöntem sunuyor. Hidrojel çözümleri glikol kitosan, sentezlenmiş benzaldehyde sonlandırıldı polimer gelator ile karıştırılarak hazırlanır ve hydrogels verimli bir şekilde oda sıcaklığında birkaç dakika içinde elde edilir. Glikol kitosan, polimer gelator ve su içeriği arasında değişen oranlarda tarafından farklı jelleşme kez ve sertliği ile çok yönlü hydrogels elde edilir. Zarar görmüş, hidrojel onun Görünüşe ve modülü, dinamik imin Tahvil reversibility crosslinkages olarak nedeniyle kurtarabilirsiniz. Kendi kendine healable bu özellik hidrojel enjeksiyon işleminden sonra sıkılmış parçaları bir ayrılmaz toplu hidrojel kendi kendine iyileşmiş olabilir bu yana enjekte edilebilir olmasını sağlar. Hidrojel da çok farklı denge durumları dinamik imin Tahvil nedeniyle birçok biyo-aktif uyaranlara cevap veriyor. Bu hidrojel biyo uyumlu doğrulandı ve L929 fare fibroblast hücreleri katıştırılmış aşağıdaki Standart prosedürler ve Hücre proliferasyonu kolayca 3D cep ekimi işlemi tarafından değerlendirildi. Hidrojel farklı araştırma nerede bir 3D çevre hücreler için fizyolojik bir taklit kazançlı için ayarlanabilir bir platform sunar. Çok duyarlı, kendi kendine healable ve enjekte edilebilir özellikleri ile birlikte, hydrogels potansiyel olarak uyuşturucu ve gelecekteki bio-tıbbi uygulamalar hücrelerde birden çok taşıyıcıları olarak uygulanabilir.

Giriş

Hydrogels çapraz polimer malzemeler büyük miktarda su ve yumuşak mekanik özellikleri ile ve birçok bio-tıbbi uygulamalar^1,2' kullanılmıştır. Hydrogels hücreleri içinde vivoiçin fizyolojik çevre çok benzer bir yumuşak ve ıslak ortam sunmaktadır. Bu nedenle, hydrogels 3D hücre kültür^3,4için en popüler iskele biri haline gelmiştir. 2D Petri kabına hücre kültürü için karşılaştırıldığında, 3D hücre kültürü, microenvironment başvurun ve yayılmasını önleme ve ayırt etme amacıyla⁵için bir araya hücreler için bir hücre dışı Matriks (ECM) taklit sunmak için hızla ilerlemiştir. Ayrıca, doğal polimerler içeren hydrogels biyo uyumlu ve teşvik ortamları çoğalırlar ve³ayırt etmek için hücreleri için önerebiliriz. Sentetik polimerler elde Hydrogels hayvan kökenli proteinler veya virüs gibi karmaşık etkileri dışlamak onların basit ve net bileşenleri için tercih edilir. Tüm hidrojel adaylar arasında 3D hücre kültürü için kolayca hazırlanır ve tutarlı bir özellik olan hydrogels her zaman tercih edilir. Farklı araştırma gereksinimleri uyacak hidrojel'ın özelliklerini ayarlamak için tesisin iyi⁶önemlidir.

Burada bir çok yönlü hidrojel platform 3D hücre kültür⁷için olur dinamik imin kimya kullanarak bir glikol kitosan tabanlı hidrojel facile hazırlanması tanıtmak. Bu yöntemde, iyi bilinen biyo uyumlu glikol kitosan çerçeveler hidrojel'ın ağlar kurmak için kullanılır. Onun amino grupları ile sona benzaldehyde polietilen glikol dinamik imin Tahvil hydrogels⁸crosslinkages oluşturmak için polimer gelator olarak tepki. Dinamik imin Tahvil formu ve çevresi, hydrogels mekanik olarak ayarlanabilir çapraz ağlar^9,10,11ile endowing için geri döndürülebilir ve responsively ayrıştırmak. Yüksek su içeriği, biyo uyumlu malzemeler ve ayarlanabilir mekanik güçlü nedeniyle hidrojel başarıyla 3D hücre kültürü^12,13L929 hücreler için bir iskele olarak uygulanır. İletişim kuralı burada polimer gelator sentezi, hidrojel hazırlama, hücre katıştırma ve 3D hücre kültürü çalışmalarının da dahil olmak üzere yordamlar, ayrıntıları.

Hidrojel aynı zamanda birçok diğer özellikleri nedeniyle çok duyarlı çeşitli biyo-uyarıcılara (asit/pH, B6 vitamini türevi piridoksal, protein papain, vb) dahil olmak üzere, hidrojel olabileceğini gösteren onun dinamik imin crosslinkages gösterir fizyolojik şartlarda⁸altında çürümeye bağlı. Hidrojel hidrojel minimal invaziv enjeksiyon yöntemi ile idare ve uyuşturucu ve hücre teslimatlar^14,15dakika sonra bir avantaj Yani kendi kendine healable ve enjekte edilebilir, da. Hidrojel işlevsel katkı maddeleri veya belirli önceden tasarlanmış polimer gelators ekleyerek, manyetik, sıcaklık, pH duyarlı, hangi yerine vb^16,17, gibi belirli özellikleri kazanıyor için uyumlu bir araştırma gereksinimleri çok çeşitli. Bu özellikleri bir enjekte edilebilir olmak potansiyel kapasite hidrojel'ın uyuşturucu ve hücreler içinde in vitro ve in vivo bio-Medikal araştırma ve uygulamalar için birden fazla taşıyıcıları ortaya koyuyor.

Protokol

dikkat: ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formları (MSDS) kullanmadan önce lütfen danışın. Lütfen uygun güvenlik uygulamaları kimya deneyleri, bir duman hood ve kişisel koruyucu ekipman (koruyucu gözlük, koruyucu eldiven, önlük, vb) kullanımı da dahil olmak üzere yerine getirirken kullanın. Standart hücre işleme teknikleri (sterilizasyon, hücre kurtarma, cep passaging, hücre dondurma, hücre boyama, vb) protokolü gerektirir.

1. hazırlık Hydrogels

1. 1. öncesi kuruma, PEG benzaldehyde sentezi di functionalized polietilen glikol (DF PEG) sona polimer
      1. tartmak 4.00 g PEG (MW 4.000, 1.00 mmol), bir yuvarlak alt şişesi (250 mL) aktarmak ve toluen (100 mL) ekleyin.
         Not: Farklı molekül ağırlıkları ile diğer mandal hidrojel oluşumu için çalışabilir ancak farklı sertlik götürecek.
      2. Isı tabancası (ya da sıcak bir tabak yaklaşık 40 ° C) hafif polimer çözülür yardımcı olmak için çözüm ısı. Tüm polimerler geçiyoruz sonra bir Buharlaştırıcı tüm çözücüler kaldırmak için kullanın. Bu erime ve kuru süreç kurutulmuş PEG polimerler yapmak için iki kez yineleyin.
         Dikkat: Bu bir duman başlıklı aşırı özenle yapılmalıdır. Toluen yanıcı.
   2. Benzaldehyde fesih tepki PEG
      1. şişesi için manyetik karıştırıcı ve tetrahydrofuran (THF, 100 mL) ekleyip PEG bir karıştırıcı kullanarak geçiyoruz. 4-carboxybenzaldehyde (0,90 g, 6.0 mmol) ve 4-dimethylaminopyridine (0,07 g, 0.6 mmol) sırayla tüm katı tamamen erimesi için çözümler ekleyin.
      2. Ekle N, N '-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 1,25 g, 6.0 mmol) çözümü ve susuz CaCl ₂ şişeye doldurulur bir kurutma tüp ekleyin. Reaksiyon karıştırma altında oda sıcaklığında tutmak (~ 20 ° C) için yaklaşık 12 h.
   3. Sonrası tepki süreci
      1. reaksiyon tamamlandıktan sonra vakum tarafından çözümde oluşturulan beyaz katı filtre. Çözüm beyaz katı çökelti için karıştırma altında soğuk Dietil eter (500 mL) dökün. Beyaz katı göre filtrele toplamak ve katı bir duman başlıklı kuru.
      2. Beyaz katı THF yeniden dağıtılması, çözünmez herhangi bir beyaz katılar filtre, çözüm taze soğuk Dietil beyaz katı çökelti eter dökün ve kuru. 2-3 kez bu adımları tekrarlayın ve sonra beyaz katı bir vakum kurutma fırın (20 ° C, 0.1 mbar) onları tamamen kurumasını yerleştirin. Nihai ürün olarak beyaz toz toplamak: benzaldehyde sona DF PEG.
2. Hydrogels hazırlanması
   1. tartmak DF PEG (0,11 g, 0,028 mmol 0,22 g, 0,055 mmol; 0,44 g, 0.110 mmol) farklı miktarda bir tüp (10 mL), deiyonize su (5.0 mL) ekleyin ve bir girdap veya manyetik karıştırıcı yardımcı olması için kullanın Polimer çözülür.
   2. Glikol chitosan (0.495 g, x 10 ^-3 mmol 6,18) deiyonize su (15,0 mL) bir tüp (50 mL) dağıtılması ve kitosan çözüm (3 wt %) homojenize için birkaç dakika için bir girdap kullanın.
   3. Glikol kitosan çözüm (0.2 mL, 3 wt %) ve DF PEG Çözümleri (0.2 mL) sırayla bir tüp (2.0 mL) ekleyin. Bir girdap formu hydrogels homojen çözümlerinize birkaç dakika içinde karıştırmak için kullanın. Hydrogels farklı mekanik güçlü yapmak için Tablo 1 ' deki oranları izleyin.
      Not: hidrojel zaten oluşmuş olup olmadığını belirlemek için tüp ters çevirme yöntemini kullanın.
3. Reolojisi analizleri
   1. Reolojisi analizleri dönüş rheometer paralel bir çelik plaka üzerinde yürütmek (çapı: 20 mm). Jelleşme test için Glikol kitosan çözüm (0.2 mL, 3 wt %) daha düşük bir tabağa yayıldı. O zaman, DF PEG sulu çözümler (0.2 mL, 2 wt %) eşit olarak dropwise kitosan çözüm yüzeye ve hızlı bir şekilde bir pipet ile karıştırın. Düşük aşağı üst plaka ve test için başlar
   2. İçin hidrojel ' s sertlik testi, kesilmiş bir hidrojel bir çember içine (çapı: 20 mm) ve depolama modülü ölçmek (G ') değerleri frekans analizleri % 1 zorlanma, karşı. Tipik G ': 6,3 rad s değerleri ^{− 1} Tablo 1 ' de listelenen.
      Not: 0,5 h hidrojel Reolojisi analizleri hidrojel dinamik bağ istikrar sağlamak için hidrojel oluşumu sonra taşımak.
   3. İçin hidrojel ' s kendi kendine healable özelliği testi, bir hidrojel paramparça ve duyulursa ayrılmaz bir parçası için parçaları bir araya toplamak. Bir daire yapmak hidrojel parça kesme (çapı: 20 mm) ve Reolojisi analizlerini incelemek rheometer üzerinde koydu.

2. Hydrogels 3D cep ekimi

1. hidrojel jelleşme çözümleri hazırlanması
   1. tartmak DF PEG (0,44 g, 0,11 mmol) steril tüp (4.0 mL), hücre kültürü medya (RPMI-1640, 2.0 eklemek mL) ve bir girdap veya karıştırıcı polimer çözüm (20 wt %) elde etmek için polimer çözülür yardımcı olması için kullanın. Çözüm bir şırınga (10.0 mL) içinde yük ve sonra mikrop bakteri kuvvetli filtreden (0,22 µm) geçirerek sterilize.
   2. Glikol chitosan (0,165 g, 2,06 x 10 ^-3 mmol) bir steril tüp (15,0 mL) tartmak, hücre kültürü medya (RPMI-1640, 4.0 mL) ve girdap glikol kitosan çözüm (4.0 wt %) elde etmek için polimer çözülür yardımcı olmak için ekleyin. Bir şırınga (10.0 mL) çözümde yük ve 0,22 µm bakteri kuvvetli filtre ile filtre.
2. Hydrogels hücre ekimi
   dikkat: gerçekleştirmek tüm doku kültürü başlıklı ilgili yordamları cep. Steril tekniği konusunda temel bilgi bekleniyor.
   1. Hücre süspansiyon
      1. RPMI-1640 hücrelerde kültür L929 hazırlanması orta % 10 ile desteklenmiş FBS, %5 penisilin (10 mL) bir Petri çanak (çapı 10 cm) ve 37 ° C, % 5 CO ₂ kuluçkaya. Orta kullanmadan önce her gün değiştirin.
      2. Hasat L929 hücreleri tripsin (0.025 w/v %) ve EDTA içeren PBS ile (% 0,01 w/v), (70 x g, 5 min) santrifüj kapasitesi ve RPMI-1640 orta (1.0 mL) hücreleri yeniden askıya alma. Kan sayım kurulu standart operasyon kullanarak hücre sayımı gerçekleştirmek. Hücre toplama ayarlamak için hücreleri yeniden askıya ~ 3.75 × 10 ⁶ hücre/mL.
   2. Hydrogels hücre katma
      1. L929 hücre süspansiyonlar (0.4 mL, 3,75 x 10 ⁶ hücre mL ^-1) glikol kitosan çözüm (0.4 mL) girdap tarafından bir tüp (4.0 mL) ile karıştırın. L929/glikol kitosan çözüm (0.8 mL) confocal Petri kabına ortasına pipette (çapı 2,0 cm). DF PEG Çözümleri (0.2 mL) aynı çanak içine pipette ve yavaşça çözüm mix ve hidrojel oluşumu teşvik pipet.
         Not: hidrojel oluşumu petri kabına eğerek değerlendirmek.
      2. Doğrudan hücre kültürü için ek RPMI-1640 kültür medya (1.0 mL) hidrojel üstüne miktarda ekleyebilirsiniz. Gömülü hücre hydrogels (1.0 mL, 1,5 wt % glikol kitosan, 4.0 wt % DF PEG, 1.5 × 10 ⁶ hücre mL ^-1) (37 ° C, % 5 CO ₂) bir kuluçka makinesine koy ve orta her gün değiştirin. Gün 1, 3, 5 ve 7'den sonra hücre kapsülleme hücre görüntüleme için hazır olun.
   3. 3D cep sonrası kültür için hydrogels enjeksiyon sonra yüklü hücre hidrojel hazırlamak (1.0 mL, bkz: adım 2.2.2) bir şırınga (10.0 mL, 48 G iğne) içinde. Sonra hidrojel formları hidrojel yavaş yavaş bir petri confocal görüntüleme için içine enjekte. Üstünde tepe-in hidrojel (1.0 mL) kültür ortamının ek bir miktar ekleyin ve her gün değiştirin. Petri kabına (37 ° C, % 5 CO ₂) bir kuluçka makinesine koy ve daha sonra görüntüleme için hazır olun.
      Dikkat: Lütfen kontrol edin ve bir şırınga Emanet işlem protokolü izleyin.
3. Hücre canlılığı analizi
   1. Confocal gözlem
      1. PBS (1.0 mL) ile hydrogels için iki kez yıkayın. Floresein diacetate (FDA, 0.5 mL, 0,05 mg/mL) ve propidium iyodür (PI, 0.5 mL, 0,08 mg/mL) çözümleri için 15 dk ile hydrogels leke. Boyama sonra tüm maddeleri kaldırın.
      2. Gözlemlemek confocal mikroskop altında uyarma dalgaboyu 488, kullanarak hydrogels nm ve 543 canlı görselleştirmek için nm ve ölü hücreleri, anılan sıraya göre. Z-yığınlar hücreler eşit dağılımı doğrulamak için hydrogels her 2 µm derinliğe üzerinden alın.
         Not: PI ölü hücreleri lekeleri ise FDA canlı hücreleri lekeleri.
   2. Hidrojel (1.0 mL) Asetik asit (HAc, 3 v %, 1.0 mL) 5 min ve pipet ile bir tüpe (4.0 mL) bozulmasına yol açar. Hücreleri tarafından santrifüj (70 x g, 5 min) toplamak ve RPMI-1640 hücre kültür orta (1.0 mL) hücreleri yeniden askıya alma. Bir kan sayım kurulu kullanarak hücre sayımı gerçekleştirmek.

Sonuçlar

Bu protokol hidrojel hazırlık ve 3D hücre kültürü olarak kullanılmasını şematik bir sunumunu şekil 1' de sunulmaktadır. Bilgi hidrojel'ın içindekiler ve farklı mekanik güçlü ile hazırlanan oranları Tablo 1' de özetlenmiştir. Hidrojel kendi kendine healable ve depolama modülü Frekans testi Şekil 2' deki karşı tarafından hidrojel'ın sertlik Reolojisi özelliği sunar. Hücre confocal görüntüleri ve gün ile hücre s...

Tartışmalar

Bu Protokolü (şekil 1) sunulan hidrojel iki ana bileşenden oluşur: doğal polimer glikol chitosan ve sentetik bir benzaldehyde sona polimer gelator DF PEG, hangi her iki Biyouyumlu malzemelerdir. DF PEG sentezi bir tek adımlı değişiklik tepki kullanılarak sunulur. Moleküler ağırlık 4.000 PEG bu protokol çözünürlük, değişiklik verimliliği gibi hidrojel sertlik endişelerini için seçildi. Hydrogels ile farklı mekanik güçlü bir dizi hazırlanan kullanarak farklı kat?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycol chitosan	Wako Pure Chemical Industries	39280-86-9	90% degree of deacetylation
4-Carboxybenzaldehyde	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	619-66-9	99%
N, N'-dicyclohexylcarbodiimide	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	538-75-0	99%
Calcium chloride anhydrous	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	10043-52-4	96%
4-dimethylamiopryidine	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co.,LTD	1122-58	99%
Polyethyleneglycol	Sino-pharm Chemical Reagent	5254-43-7	99%
Tetrahydrofuran	Sino-pharm Chemical Reagent	109-99-9	99%
Toluene	Sino-pharm Chemical Reagent	108-88-3	99%
Ethyl ether	Sino-pharm Chemical Reagent	60-29-7	99%
Acetic acid	Sino-pharm Chemical Reagent	64-19-7	99%
Anhydrous CaCl2	Sino-pharm Chemical Reagent	10043-52-4	99%
Fluorescein diacetate	Sigma	596-09-8	99%
Propidium iodide	Sigma	25535-16-4	94%
RPMI-1640 culture media	Gibco
Fetal bovine serum	Gibco
Trypsin-EDTA	Gibco		0.25%
PBS	Solarbio		0.01 M
Penicillin streptomycin solution	Hyclone		10,000 U/mL
Rheometer	TA Instrument		AR-G2
Confocal microscope	Zeiss		710-3channel
L929 Cells	ATCC		NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L
Evaporator	EYELA		N-1100
48 guage needle	ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD		48-guage
Microscope	Leica		DM3000 B
Microscope software	Imaris
Heat gun	Confu		KF-5843
Petri dish	NEST