JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Karbonhidrat substrat bağlayıcı protein geniş bir biyokimyasal ve yapısal karakterizasyon Streptococcus pneumoniae gerçekleştirmek için akıcı bir protokol sunulmuştur.

Özet

Yeni antimicrobials ve aşı geliştirilmesi Streptococcus pneumoniae (pnömokok) için çoklu dirençli suşların hızlı artış durdurmak gerekli. Karbonhidrat substrat proteinler (SBPs) protein bazlı aşılar ve yeni antimicrobials geliştirilmesi için uygun hedefler nedeniyle ekstrasellüler onların Yerelleştirme ve pnömokok metabolizması için karbonhidrat alma merkezi temsil etmek, anılan sıraya göre. Burada açıklanan SP0092, pnömokok ve diğer bakteriler diğer karbonhidrat SBPs uzatılabilir kapsamlı bir karakterizasyonu gerçekleştirmek için entegre bir ayrıştıran protokoldür. Bu yordamı inhibitörleri bu sınıfın proteinlerin yapısı tabanlı tasarımı yardımcı olabilir. Sunulan bu yazının ilk bölümünde termal üst karakter tahlil göre biyokimyasal analiz için kurallarıdır, çok ışık saçılma (MALS) açı ve dışlama Kromatografi (sn), hangi istikrar optimize boyutu ve örnek polimerlerin yönelik kristalizasyon denemeler ve bu yüzden başarı geliştirin. Bu yordamı ikinci bölümü kristalize protein çözümlemek için kullanılan ölçüm verileri için ayarlanabilir dalga boyu anormal kırınım sinkrotron beamline ve veri koleksiyon iletişim kurallarını kullanma SBP kristalleri karakterizasyonu açıklar yapısı.

Giriş

S. pneumoniae (pnömokok) olduğunu asymptomatically neden otitis, septisemi, pnömoni, sepsis normalde steril nişler geçirmek için yeteneği ile insan solunum yolu üst solunum yolları içinde bulunan gram-pozitif bir bakteri ve Menenjit1,2. Ayrıca, pnömokok enfeksiyonu bir klinik ve ekonomik yük dünya çapında3,4' e katkıda bulunan topluluk edinilen pnömoni önde gelen nedenidir. Antibiyotik dirençli S. pneumoniae suşları dünya genelinde yayılmış ve yedi valent ve on üç-valent pnömokok protein eşlenik aşı yardımcı oldu rağmen antibiyotik direnci, yedek suşları oranını azaltmak aşı kullanımı ortaya çıkmıştır ve araştırma için artan talepleri pnömokok hastalığı5,6,7,8için yeni tedavilerin geliştirilmesi içine açmıştır.

Pnömokok ev sahibi bir karbon kaynağı9,10olarak alınan şeker bağlıdır; Gerçekten de onun alma makine taşıma 32 farklı karbonhidrat11,12,%1330'u ayırıyor. Bu ithalatçılar en az sekiz ABC-taşıyıcı13içerir. ABC Taşıyıcılar hücre dışı SBPs ligand için özgüllük belirleme ve hücre alımı için integral membran taşıyıcı için sunma temel bir rol oynar. Çünkü onlar yüzey proteinleri ve hücresel onların önemli rol SBPs yeni aşılar ve antimicrobials tasarımı için geçerli hedefler temsil eder.

Hedef protein karakterizasyonu ve ligand cepler ve etki alanları arasında esneklik gibi yapısal özellikleri ayrıntılı bir açıklama yararlı bir araç için uyuşturucu yapısı tabanlı tasarım14,15sağlar. X-ışını kristalografisi atomik çözünürlük yakın proteinlerin yapısal karakterizasyon için seçim yöntemi, ama kristalizasyon işleminin öngörülemeyen, zaman alıcı ve her zaman başarılı değil. Gelişmiş sistematik yöntemlerle başarı oranı ve örnek kalite ve istikrar önemli faktörlerdir. Kristalizasyon başarı oranını içindeki protein kimyasal özellikleri ve örnek hazırlama yöntemleri tarafından etkilenir. Bunlar etkisini değerlendirildi ve biyokimyasal karakterizasyonu16,17tarafından haberdar.

Bir başka komplikasyon yapısı tabanlı tasarımı için ele alınması gereken crystallographic faz sorun. Gibi daha fazla protein yapıları kullanılabilir, birçok yapılar homolog yapısı18gerektirir moleküler değiştirme yöntemi tarafından çözülebilir. SBPs esnek etki alanı yapısı sunmak, moleküler değiştirme de zorlu19olabilir. Hedef protein için yeterince benzer bir yapısal model kullanılabilir değilse, bir takım teknikler deneysel aşamalı20almak için kullanılabilir. Bunlar arasında tek dalga boyu anormal dağılımı (SAD) yöntemi birincil tekniği ortaya çıkmıştır ve yoğun faz sorun21çözmek için kullanılan. ÜZGÜN yönteminin kullanımı daha fazla donanım ve yazılım gibi algılama ve22,23, phasing için zayıf anormal sinyallerin kullanım izin vermek için veri toplama stratejileri geliştirmeleri ile gelişmiş 24. yapıları oluştururlar, hangi kırınım veri atomik çözünürlükte gerekli, geçmişte şimdi programda uygulanan olarak stereochemical bilgi Örneğin, birleştirerek yararlı olabilir için Ayrıca, doğrudan yöntemlerdeki gelişmeler ARCIMOLDO25. Kristalografi faz problem çözme yöntemleri yararlı bir daha gözden geçirme Taylor26tarafından verilir.

Burada karbonhidrat taşıma SBP, SP0092 S. pneumoniae, karakterizasyonu için ayrıştıran bir protokol biyokimyasal ve yapısal teknikleri (şekil 1) entegre mevcut. Bu adım adım iletişim kuralı hayat tüm Krallık içinde bulunan genel olarak, SBPs üzerinde yapısal çalışmaların başarı oranını artırmak için stratejiler yararlı örnek test olgusu sağlar. Özellikle, protokol hızlı ve etkili bir yöntem çözümde protein en istikrarlı oligomeric durumunu karakterize önemini vurgular ve kristalizasyon deneyler için takip etmek için en iyi tür tanımlamasını sağlar. 500'den fazla SBP yapıları içinde Protein veri Bankası27rapor olsa da, moleküler yedek bir menteşe bölgesi19tarafından bağlı iki α/β etki alanı doğal esnek yapısı nedeniyle zor olabilir. Böylece, iletişim kuralının ikinci bölümü, üzgün phasing üzgün yöntemiyle ilişkili metal iyonları SBPs ortak yanı sıra selenomethionine birleşme ve selenyum (Se) kullanımı olan phasing için açıklar.

Protokol

Not: sinyal peptid silindi kodlama dizisi standart bir füzyon protokol sonrası pOPINF vektörde klonlanmış; yerli protein Escherichia coli BL21 Rosetta hücrelerdeki bir etiket onun füzyon olarak ifade 28 , 29. değişken etiketli selenomethionine üretici 30 göre standart yöntemleri aşağıdaki ifade edilir. SBP daha önce saflaştırılmış rekombinant 31 , 32 açıklanan.

1. biyokimyasal karakterizasyonu

  1. termal kayması tahlil
    1. hazırlamak 48 tampon çözeltiler 4.0 arasında değişen pH 9,5 ve NaCl konsantrasyon için 0-0, 5 M ve açıklandığı gibi bir 96-şey plaka 40 µL dağıtmak Tablo 1 33.
    2. eklemek için 1-2 mg/mL konsantrasyonu SBP çözümün de 5 her µL.
    3. Eklemek için 20 x için (bkz: Malzemeler tablo) protein flüoresan leke de 5 her µL.
    4. Pipetting tarafından çözümleri karıştırmak, şeffaf yapışkan film kullanarak plaka mühür ve spin 112 x g oda sıcaklığında 2 min için.
    5. Deney gerçek zamanlı bir makinede çalıştırın: 99 ° C ile 10 s ayrı tutma zamanı için 4'ten 3 ° C/dak bir sıcaklık rampa ayarlayın ve floresan her 0,5 ° C uyarma, 483 nm ve emisyon 568, okumak nm.
    6. Analiz için erime sıcaklık (T m) türevi en az tanımlayan her arabellek durumuna Floresans emisyon eğrileri.
      Not: Bu yordam protein istikrar düzelme yardım için en iyi arabellek çözüm iyi bir göstergesi verir. PH aralığı ve tuz konsantrasyonu yüksek T m ile arabellek durumuna göre seçim ve gliserol ve 0,5 mM, %2.5 (v/v) eklemek tris(2-carboxyethyl) aşağıdaki adımları (sn-tampon) için arabellek çözüm tanımlamak için fosfamin (TCEP).
  2. MALS ve analitik sn
    1. degassed filtrelenmiş su (kullanım geniş moleküler ağırlık 24 mL sütun) ile ambalajlı jel filtrasyon sütunun iki sütunlu cilt yıkama gerçekleştirmek.
    2. Sütun ışık saçılma bulmak-e doğru bağlamak ve termal üst karakter tahlil kararlı sn arabelleğinden sütunla equilibrate.
    3. 5 mg/mL dengelenmiş sn sütun ve akış bir sütun hacmi sn-tampon içine, saflaştırılmış SBP enjekte 100 µL.
    4. Elüsyon Kromatografik tek veya birden çok tepeler için kontrol ve molar kütle ve tüm türler için polydispersity dizin edinme analiz yazılımı kullanarak saçılma verileri incelemek.
      Not: bir oligomeric türlere karşılık gelen her zirve için polydispersity kontrol etmek yararlı olduğunu dizin hesaplanan molar kitle ağırlıklı molekülleri (Mw/Mn) sayısına kütle/azı kitle üzerinde ağırlıklı olarak. Polydispersity değeri 1 yakın bir monodispersed pik gösterir.
      Not: Bütün Oligomerizasyonda türlerin tanımladıktan sonra daha yüksek konsantrasyonlarda daha büyük oligomer oluşumu lehine protein konsantrasyonu, bağımlılığını eğitim yararlı gibi.
    5. Yürütmek birden çok analitik sn çalıştırma; artan konsantrasyonları (0.1 - 10 mg/mL) dengelenmiş jel filtrasyon sütuna (kullanım geniş molekül ağırlığı 5 mL sütun), saflaştırılmış SBP 100 µL enjekte ve her zaman bir sütun birim sn-arabelleği akış.
    6. Elüsyon Kromatografik tek veya birden çok tepeler için kontrol ve 280 Absorbans Koyulukları çözümlemek için farklı başlangıç protein konsantrasyonları karşılık gelen eğrilerinin nm. Farklı doruklarına göreli yoğunluklarda sabit kalırsa, oligomeric türler arasında arası dönüştürme mevcut değildir. Farklı konsantrasyonlarda göreli Koyulukları içinde çeşididir şekilde protein konsantrasyonu bağlıdır farklı oligomeric türler arasında bir göstergesi.
      Not: Bu karakterizasyonu hangi tür kristalizasyon için daha uygundur tanımlamak için temel adımdır. Gerçekten de, farklı monodispersed tür tanımlanmış bir konsantrasyon bir sabit oligomeric durumda olmaları durumunda kristalize daha yatkındır.

2. Protein hazırlık ve kristalizasyon

  1. partiye hazırlık sn
    1. bir tek sütunluk birimi sonra yıkama degassed süzülmüş suyla equilibrate sn-tampon ile (geniş bir Moleküler ağırlığı 120 mL partiye hazırlık ambalajlı jel filtrasyon sütun sütun).
    2. 1-5 mL, 5-50 mg/mL saf SBP dengelenmiş jel filtrasyon sütun ve akış bir sütun hacmi sn-tampon içine enjekte.
    3. Sütun akışı aracılığıyla 1 mL kesirler toplamak.
    4. Bir tek monodisperse zirveye karşılık gelen kesirler havuz; 15 mL aralıklarla filtreleri 1.500 g de örnekte spin ve istenen konsantrasyonu elde kadar konsantrasyonu ölçmek (genellikle SP0092 için 50-100 mg/mL).
  2. Kristalizasyon
    1. kristalizasyon deney öncesi kristalizasyon Test üretici tarafından açıklandığı gibi kullanarak en iyi toplama aralığını belirlemek:
      1. besleme 0.5 - 1.0 mL her dört kristalizasyon testi 24-iyi oturan farklı bir rezervuar çözümlerinde kristalizasyon plaka bırakın.
      2. Protein çözüm 1 µL rezervuar çözüm 1 µL ile karıştırılarak kristalizasyon damla hazırlamak, plaka mühür ve oda sıcaklığında en az 1 (bir gecede kuluçka sonra daha güvenilir sonuçlar elde edilen) s için kuluçkaya.
      3. Kontrol damla kalite 10 x büyütme mikroskop kullanarak her yoğunlaşması.
        Not: Test en az üç farklı protein konsantrasyonu: (I) açık kalan damla çoğunu belirtmek protein çok seyreltik kristalizasyon için; (II) damla çoğu ağır çökelti varlığı bir aşırı yüksek konsantrasyon anlamına gelir; ve (III) dengeli bir oluşum açık düþer ve çökelti (Eğer ışık daha iyi) test konsantrasyon kristalizasyon için olumlu olduğunu iyi bir göstergesidir.
    2. 96-şey oturma inis kristalizasyon tabak hazir; her rezervuar iyi 34 , 35 , farklı ticari kristalizasyon çözeltinin 100 µL dağıtmak 36 , 37.
    3. dağıtmak 100 nL kristalizasyon Robotik sistem kullanarak tüm kristalizasyon damla Wells önceden tanımlanmış konsantrasyonu (Adım 1.1.6) adlı protein örneği.
      4. Karşılık gelen kristalizasyon
    4. dağıtmak 100 nL farklı baraj gölünün çözümler adım 2.2.3 reçete protein ile karıştırmak için kuyu bırak. Buharlaşma önlemek ve kristalizasyon damla ile havzanın denge etkinleştirmek için kristalizasyon plaka mühür.
    5. Kontrol damla düzenli olarak (başlangıçta her 1-2 günde, daha sonra her hafta) 10 x (en az) kullanarak kristal oluşumu ve büyüme değerlendirmek için büyütme mikroskobu.
      Not: protein kristalizasyon için kullanılan için otomatik görüntüleme sistemi görselleştirme ve yakalama düşüyor.
< p sınıf "j =ove_title "> 3. Kristal karakterizasyonu ve x-ışını veri toplama

  1. kristal montaj
    1. hazırlamak cryoprotectant çözüm % 25'i (v/v) gliserol (son konsantrasyonu) ekleyerek (böylece ilk suda % 25'i yerine kristalizasyon durumuna karışımı) 38.
    2. Doldurmak bir köpük dewar sıvı azot ve yer dewar içine uni-Pak örnek muhafaza parçası ile. Sıvı azot sıcaklık için soğumasını bekleyin.
    3. Kes ve mühürleme teyp kristalizasyon plaka nerede kristalleri oluşan açılan kaldır.
    4. Bir damla hedef damla yakın konumlandırılmış bir coverslide üzerine cryoprotectant çözüm 1 µL yerleştirin.
    5. Seçili kristal bir manyetik değnek 39 , 40 üzerinde monte edilmiş bir omurga standart üsteki bir naylon cryo-döngü kullanarak cryoprotectant çözüm damla özgün damla--dan transfer.
    6. Hızlı bir şekilde kristal cryoprotectant damla--dan sıvı azot döngüsü uni-Pak örnek sahibi ilk boş pozisyon yerleştirerek, transfer.
    7. İstenen kristalleri hasat ve uni-Pak örnek tutucu içinde depolanan kadar (sızdırmazlık bandı kesme) tekrarlayın.
    8. Yer uni-Pak temel uni-Pak puck değnek kullanarak ve beamline (sıvı azot koşullarda) Pak almak.
      Dikkat: Son derece düşük derece!
    9. Kullanmak cryo-maşa ve Pak dewar yükleme aracı uni yüklemek için-puck(s) beamline örnek değiştirici robot içine dewar. Uni-Pak örnek sahibi örnek döngü sahipleri örnek robotun içine dik bırakarak temel kapak üzerinden ayırmak dewar ve böylece sıvı nitrojeni maruz ve örnek değiştirici robot tarafından erişilmesini.
  2. Kristal karakterizasyonu
    Not: hasat kristaller daha sonra bir laboratuvar x-ışını kaynağı'nı kırınım kalitesi için veya bir sinkrotron radyasyon (SR) x-ışını kaynağı ekranlı. Makromoleküllerin kristalografisi (MX) beamlines yapı çözüm için anormal kırınım yararlanmak için ayarlanabilir enerji kaynağı sağlamak. Aşağıdaki bölümde, deneysel yetenekleri doğrultusunda çalışma talimatların elmas ışık kaynağı MX beamlines bir dizi teklif edilir ancak bu yönergeleri de MX beamlines, diğer synchrotrons dünya çapında adapte edilebilir.
    1. İlk adım olarak, onaylamak veya anormal scatterers kristal tanımlamak yararlıdır. Bu uygun bir x-ışını Floresans spektrum kristal üzerinden ölçerek elde edilebilir. İlk beamline x-ışını enerji tüm öğeler genellikle makromoleküllerin kristalleri için beklenen heyecanlandırmak için yüksek ayarlanır emin olun (14 keV veya daha yüksek).
    2. Örnek değiştirici robot tarafından monte edilebilir örnek seçmek için beamline kontrol yazılımı kullanın; döngü otomatik olarak x-ışını ışının içinde ortalanır ve kristal merkezleme beamline kontrol yazılımı kullanarak el ile onaylanabilir.
    3. Kayıt beamline kontrol yazılımı kullanarak bir x-ışını Floresans spektrum: kullanıcı bir çekim hızı seçer ve ölçüm başlatır (floresan/floresan spektrum ayarı, → koş, şekil 2A). Beamline kontrol yazılımı otomatik olarak Floresans dedektörü yerleştirin ve en az olay Floresans dedektörü okunabilir bir sinyal almak için x-ışını akı belirler X-ray konumlandırır. Edinsel spektrum sonra doğal olarak meydana gelen için donatılmış emisyon zirveleri ile otomatik bir biçimde analiz biyolojik öğeler. Bu yordamlar beamline kontrol yazılım grafik kullanıcı arabirimi (GUI) - GDA (www.opengda.org) Firmamız ve synchrotrons Europe 41 , 42 boyunca içinde kullanılabilir.
      4. Eğer uygun öğeleri tespit
    4. bu anormal kırınım deney için yararlanılabilir, kristal anormal kırınım veri toplama için en uygun dalga boyu belirlemek için bir x-ışını soğurma kenar enerji taraması gerçekleştirin: beamline tarihinde kontrol yazılımı, öğeyi seçin ve tarama başlatmak (floresan/floresan ayarı, inceden inceye gözden geçirmek → Atom adı, → koş, şekil 2B).
      Not: bir tek anormal kırınım deneme için emme kenar zirvesine anormal saçılma en üst düzeye çıkarmak için kullanılır. Deneysel dikkat edilmesi gereken noktalar bir çok dalga boyu anormal kırınım deneyi gerçekleştirmek için daha önce ayrıntılı 43 olmuştur.
      5. Kristal birim hücre parametreleri, simetri ve kırınım sınırı belirlemek için
    5. salınım yöntemini kullanarak 45 ° aralıklarla üç x-ışını kırınım desen ölçmek (veri toplama/tarama → geçerli, koşmak Şekil 2C). Beamline kontrol yazılımı, salınım açısı ve çekim hızı ve röntgen ışını yüzdesi ayarlamak için yeteneği ile kullanıcıya sunar. Standart kristal tarama için 0.5°, bir çekim hızı 0.5 s ve % 5 x-ışını demeti iletim salınım açısı önerilir. Ölçülen kırınım görüntüleri EDNA boru hattı tarafından otomatik olarak analiz edilir ve stratejileri tam veri kümesi 22 topluluğu için bir dizi dönmek.
  3. X-ışını veri toplama
    Not: Kullanıcı standart salınım modu veya Friedel arkadaşları yakın zaman ve x-ışını doz ve yaklaşık aynı emme davranışı ile kayıt altına sağlar ters ışın modu verilerini toplamak üzere seçebilirsiniz anormal farklılıklar daha doğru bir ölçüm sağlar. İkincisi özellikle küçük anormal farklılıklar bekleniyor ve/veya örnekleri radyasyon hassas anormal kırınım deney gerçekleştirirken kullanışlıdır. En iyi veri toplama stratejileri kullanmak için önemli noktalara kapsamlı bir şekilde gözden geçirilmiş 22 , 23 , 44 , 45 olmuştur , 46 , 47.
    1. beamline kontrol yazılımı kullanarak içe aktarma veri koleksiyon parametrelerini sağlayacak strateji program tarafından önerilen:
      ı. ω-dönme ekseninin başlangıç konumunu
      II. Salınım genişliği ω-eksen dönme açısı için her kırınım görüntü
      III. Pozlama süresi her kırınım resim için
      IV. Sayı-in imge (dolaylı olarak toplam ω-eksen döndürme açısını tüm veri toplama için tanımlama) tam veri kümesi için
      aşırı pozlama ve radyasyon zarar görmemesi için x-ışını demetinin zayıflama yüzdesi v.
      Not: bizim kurumu için veri toplama çalışan, toplanan verilerin otomatik işleme için yazılım boru hatları iyi kurulmuş: (i) kırınım veri (dizin oluşturulmuş, tümleşik ve ölçekli) azalır xia2 boru hattı tarafından hangi kullanıcı için yansıma mtz dosyaları üretir aşamalı ve yapı çözüm/arıtma 48 için giriş olarak. (ii) ne zaman önemli bir anormal sinyal algılandığında veri çözümlemesi sırasında SHELX kullanarak bir ilk hızlı otomatik yapı çözüm boru hattı (fast_ep) ağır atom altyapı deneysel çözmeye çalışır phasing, aşamalı elektron yoğunluğu harita sağlayan nerede mümkün. Bir ikinci daha kapsamlı yapı çözüm boru hattı otomatik olarak çözmek ve structu inşa girişimleri taahhüt ederkullanarak bağımsız yazılım suites 49 , 50 , 51 , 52; Nerede bu başarılı olmadığı durumlarda, kullanıcı bir ilk model ve elektron yoğunluğu harita ile sağlanacaktır. Bu arıtma tamamlayıp modeli seçim crystallographic yazılım paketleri ile doğrulamak kullanıcı için temel sağlar.

Sonuçlar

Bu tümleşik iletişim kuralı dört ile başarılı olmak için kanıtlanmıştır (iki yayınlandı ve iki yapıları yayımlanmamış) pnömokok bağlayıcı protein hedefler altı karbonhidrat analiz32,53bugüne kadar. Bu bölümde, biz SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyon SBPs yapısal çalışmaların genel rehberlik için temsil edici bir sonucu olarak mevcut.

Sonra SBP SP0092 ifade edilen ve daha önce32tanımlandığı gibi saf saf protein termal üst karakter tahlil kullanarak arabellek istikrar için analiz edildi: SP0092 sergileyen bir artan Tm pH 6,5 NaCl varlığında 0 - 0.2 M konsantrasyon aralığı (şekil 3A). Bunun ışığında, aşağıdaki adımları için arabellek çözüm olarak tanımlanmıştır: 0,02 M MES pH 6.5, 0.2 M NaCl, %2.5 (v/v) gliserol, 0,5 mM TCEP. SP0092 farklı Oligomerizasyonda durumları mutlak molar kütlesi tetrameric, trimeric, dimerik ve monomeric türleri için karşılık gelen 187.2, 140.8, 97.0 ve 49,4 kDa, moleküler ağırlık ölçme sn birleştiğinde MALS tarafından ölçüldü () sırasıyla Şekil 3B). Farklı protein dilutions sn profilde analizini artan protein konsantrasyonu, daha büyük reaksiyonlar genellikle kullanılan daha yüksek konsantrasyonlarda daha kararlı olduğunu düşündüren Oligomerizasyonda tetiklediği saptandı kristalizasyon. Nitekim, saflaştırılmış büyük oligomeric türler kristalizasyon denemeler için yönetmen başarıyla üretilen protein kristalleri tür did değil monomer tamamlayın.

En iyi duruma getirilmiş kristalleri yerli elde edilen ve Se-metiyonin SP0092 türlü etiketli x-ışını kırınım tarafından karakterize. Bu kristaller gelen x-ışını Floresans ölçümü Se beklendiği gibi sadece Se-metiyonin kristalleri için algılandı ise protein, bağlanan Zn için emisyon tepeler her iki durumda da ortaya koydu. Hangi olay x-ışını dalga boyu ilgili x-ışını soğurma kenarlarına Zn veya Se ayarlamak için doğrudan deneysel veri kristallerin anormal sinyal en üst düzeye çıkarmak için mevcut sağlanan x-ışını soğurma taramaları Se ve Zn kenarlarında sonra gerçekleştirilen Sonuç veri (şekil 4A-B) üzerinden elde edilebilir.

Düşük iletim adlı üç kırınım şablonlarını ölçmek sonra tam bir anormal veri kümesi EDNA (şekil 4 c) tarafından önerilen veri toplama stratejisini kullanarak elde edildi. Anormal sinyal mevcut otomatik aşamalı boru hattında alt yapısını belirlemek için beamline tetikler ve elde edilen ilk deneysel aşamalarında dayanan, üreten ilk haritalar ve sonra rafine ve doğrulanmış modelleri (şekil 4 d ).

Özet olarak, olası tehlikelere tekniği öncelikle kristal mevcudiyeti ve kalitesinden ortalanır. Optimizasyon protein kararlılığınızı geliştirmek için arabellek koşulların yanı sıra protein çözümde, birden fazla oligomer tanımlandığında kullanılacak en uygun oligomeric durumunu tanımlaması kristalizasyon başarısızlık riskini azaltabilir sahne. Erken bir aşamada teşhis ilişkili metal iyonları kullanımı istismar yapı çözüm kadar hız ve moleküler değiştirme yöntemleri başarısız olduğunda protein etiketli selenomethionine gereksiz üretimini önlemek.

figure-results-3621
Şekil 1. Karbonhidrat SBPs biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu için iş akışı diyagramı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-4042
Şekil 2. Kristal karakterizasyonu GDA içinde. (A)GDA beamline kontrol yazılımı x-ışını Floresans denetimi sekmesindeki ekran görüntüsü. (B) GDA x-ışını enerji kenar-tarama denetimi sekmesinde ekran görüntüsü. (C) GDA veri toplama kristal tarama sekmesinde ekran görüntüsü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-4711
Şekil 3. SP009239-491biyokimyasal karakterizasyonu. (A)3D-Yüzey grafiği pH bir fonksiyonu ve arabellek çözüm NaCl konsantrasyonu SP009239-491 erime sıcaklığı komplo. (B) sn ve MALS sonuçları için SP009239-491. Emme 280 nm mavi renkle gösterilir. Farklı Oligomerizasyonda Birleşik molar kitlelerin kırmızıyla gösterilir. Paneli (B)32değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-5493
Şekil 4. SP009239-491yapısal karakterizasyonu. (A)ve (B) x-ışını soğurma enerji Zn ve Se kenarına SP009239-491 kristalleri için tarama. Zn ve kristalleri içeren Se ölçülen Floresans gösterilen mavi ve mavi, hesaplanan f' ve f "anormal saçılma kesirler are yeşil ve kırmızı, anılan sıraya göre. X-ışını kırınım şablon örnekleri (C) SP009239-491 kristalleri toplanan. (D) Cartoon SP009239-491 dimer yapısı gösterimi. Bir protomer renkli beyaz ve diğer macenta (artıkları 39-366) ve violet (artıkları 367-491), ve anormal saçılma atomları mavi ve mavi topları Zn ve Se, sırasıyla gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

0,1 M sitrik asit pH 4.00,1 M sitrik asit pH 4.50,1 M fosfat pH 5,00,1 M sitrat pH 5.50,1 M Bis-tris pH 60,1 M ADA pH 6,50,1 M BEZLERİ pH 70,1 M HEPES pH 7.50,1 M Imidazole pH 8.00,1 M Tris pH 8,50,1 M CHES pH 90,1 M CHES pH 9,5
NaCl 0 M40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL40 μL
40 μL 40 μL 40 μL NaCl 0.1 M 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL NaCl 0.2 M 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL NaCl 0,5 M 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL 40 μL

Tablo 1. Termal üst karakter tahlil için arabellek oluşturma.

Tartışmalar

Bu kağıt, açıklama ve karbonhidrat SBPs proteinler S. pneumoniaesayfasından belirli bir vurgu ile biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu için entegre bir iletişim kuralı doğrulama. Yine de, bu diğer SBPs farklı organizmalar üzerinden ve hatta diğer ilgisiz çözünür proteinler analizi için standart bir prosedür olarak kullanılabilir.

Protokol ilk bölümünü protein istikrar ve protein örnekleri hazırlanırken kristalizasyon yararlanan dördüncül yapı biyokimyasal bilgilerini sağlamaya odaklanmıştır. Termal kayması deneyleri bölümünde, biz sadece pH ve bu yordamı genel hükümlerini korumak için NaCl toplama varyasyon tanımlamak. Buna rağmen birçok diğer arabellek şartlar benzer bir şekilde, örneğin, herhangi bir kimyasal bileşik teskin katkı maddesi kullanılan da dahil olmak üzere test edilebilir: özellikle belirli bir SBP bağlamak gerçek ligand(s) Tartırmada son derece etkili m bir kaç santigrat derece31tarafından. Bazı durumlarda, denaturing eğriler kötü düşük sinyal veya protein toplama veya kısmi elinde tutmasına neden bir yüksek floresan arka plan nedeniyle tanımlanabilir. Bunu önlemek için bir protein: boya titrasyon belirsiz denaturing eğrileri en iyi duruma getirmek için gerçekleştirilebilir. Hiçbir gelişme edindiyseniz, protein kararlılığını iyileştirmek çeşitli katkı maddeleri eleme tavsiye edilir ve uygun ekranları yukarıda açıklanan54olmuştur.

Genellikle, çoğu SBPs doğal ortamlarında monomeric, ama burada gösterildiği multimerization kristalizasyon deneylerde kullanılan daha yüksek konsantrasyonlarda oluşabilir, böylece MALS ve SEC tarafından sağlanan Oligomerizasyonda davranış karakterizasyonu kristalizasyon için en uygun istikrarlı monodisperse Oligomerizasyonda durumunu değerlendirmek için gerekli. Bununla birlikte, farklı kimyasallar proteinler Oligomerizasyonda davranışı üzerinde kristalizasyon koşul dahil etkisini tahmin etmek zordur. SN ve MALS muayene protein örneği kapsamlı toplama gösteriyorsa, bu oluşma olasılığını azaltmak için aşağıdaki tavsiye ederiz: taze protein örneği (değil donma çözdürülen) kullanmak ve termal ile gerçekleştirilen sabitleme analiz genişletin shift deneyleri, olası katkı maddeleri ve hafif deterjanlar son bir kaynak olarak toplama en aza indirmek için test. Bu yazıda, bu protokol genel hükümlerini korumak için yüksek üretilen iş seyrek matris ticari kristalizasyon tarama kullanarak kristalizasyon için temel kuralları tanıtacağız. Ancak, yüksek çözünürlüklü x-ışını kırınım protein kristalleri elde etme kristalizasyon koşulları precipitant konsantrasyonu, pH, kimyasal katkı maddeleri, farklı sıcaklıklarda, ilavesi ile ilgili olarak en iyi duruma getirmek için yinelemeli ince ayar gerekir ve diğer kristal damla ve rezervuar16,17arasında değişen denge dynamics faktörler.

Protokolünün ikinci parçası üzerinde üzgün phasing için anormal veri edinimi x-ışını kırınım veri koleksiyonu belirli bir odak için en iyi strateji tanımlamak için protein kristalleri karakterizasyonu açıklar. SBPs benzer bir genel yapısı korumak (ve potansiyel olarak kullanılabilir modeller başlangıç olarak yatırılan 3D modellerinden olsa bile), bu Proteinlerin moleküler değiştirme yöntemi tarafından aşamalı her zaman değişkenlik nedeniyle basit değil İkincil yapı elemanları ve bu proteinlerin iç esneklik. Bu nedenle, biz üzgün yöntemi teklif ve bu proteinler zaten özünde metaller veya gerçekten özel bağlama metallerin anormal diffracting öğeleri bir dizi sağlayabilir kristalizasyon arabellek koşullar bağlı olduğunu vurgulamak bir bizim genel iletişim kuralı standart adımda.

Sonuç olarak, bu iletişim kuralı bir standart güdümlü iş akışı yanı sıra yapı belirlenmesi başarı oranını artırmak hızlandırmak için istismar SBPs biyokimyasal ve yapısal özellikleri ayrıntılı açıklamasını sağlayan yordamlar tanımlar SBPs yapısal karakterizasyon genel olarak.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Klonlama, Gemma Harris sn-alışveriş merkezleri ve beamlines I03 ve I04 elmas ışık kaynağında bilim adamları için'yardım OPPF-İngiltere anıyoruz.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
SelenoMethionine Medium CompleteMolecular DimensionsMD12-500Based on a synthetic M9 minimal media supplemented with glucose, vitamins and amino acids with the exception of L-methionine. Other equivalent products are commercially available by other companies.
MicroAmp Optical 96-Well plateApplied Biosystems4306737The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems® 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.
SYPRO OrangeMolecular ProbesS6651SYPRO Orange Protein Gel Stain is a sensitive, ready-to-use fluorescent stain for proteins in 1D gels. Quite universal and well-established protein dye for hydrophobic regions.
MicroAmp Optical Adhesive filmApplied Biosystems4311971The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate. It is ideal for optical measurement, because it gives low background.
7500 Fast Real-time PCR SystemApplied Biosystems4362143The Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System enables standard 96-well format high speed thermal cycling, significantly reducing your run time for quantitative real-time PCR applications, delivering results in about 30 minutes. The Upgrade Kit is available to upgrade a standard 7500 Real-Time PCR System to the Fast Configuration via a field service installation. Other RT-PCR machine can be used. Data export not easy for the old data analysis software.
Superdex 200 increase 10/300 GL columnGE Healthcare28990944Superdex 200 Increase 10/300 GL is a versatile, prepacked column for size exclusion chromatography in small-scale (mg) preparative purification as well as for characterization and analysis of proteins with molecular weights between 10 000 and 600 000, such as antibodies. Optimal separation ideal for high resolution biophysical techniques.
DAWN HELEOS IIWyattDAWN HELEOS II is the premier Multi-Angle static Light Scattering (MALS) detector for absolute characterization of the molar mass and size of macromolecules and nanoparticles in solution. The DAWN offers the highest sensitivity, the widest range of molecular weight, size and concentration, and the largest selection of configurations and optional modules for enhanced capabiliites. Other MALS detecting systems from other companies apart from Wyatt have not been tested, so no additional feedback can be provided.
Superdex 200 5/150 GLGE Healthcare28906561Superdex 200 are prepacked size exclusion chromatography columns for high-resolution small-scale preparative and analytical separations of biomolecules. Superdex 200 has a separation range for molecules with molecular weights between 10 000 and 600 000. The peak separation is not as optimal as for the "increase" version but this model is ideal for the standard day by day use.
HiLoad 16/600 Superdex 200 pgGE Healthcare28989335HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade are prepacked XK columns designed for high-resolution preparative gel filtration chromatography.
24 Well "Big" Sitting Drop Crystallization PlateMiTeGenXQ-P-24S-AThe 24 well "big" crystallization plate is used mainly for protein crystal screening by sitting drop vapor diffusion techniques, and for crystallization condition optimization. It has quite large reservoir well and sample container, which favor manual handling and big sized protein crystal growth. In addition, its flat surfaces are easily to be sealed by transparent tape or cover slips.
PCT Pre-Crystallization TestHamptonHR2-140The PCT Pre-Crystallization Test is used to determine the appropriate protein concentration for crystallization screening.
96 Well CrystalQuickGreiner bio-one6098xxSquare-well plates have three crystallization wells per reservoir, making it possible to test 288 samples per plate. Generally used only for the inital screening because their squared edge make crystals fishing difficult.
Uni-PuckMolecular DimensionsMD7-601The Universal V1-Puck (Uni-puck) is a sample pin storage and shipping container for use with the majority of automated sample mounting systems worldwide - includes the ACTOR, SAM and CATS systems amongst others (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI and across the USA)
Standard Foam DewarMolecular DimensionsMD7-355.7" diameter by 2.8" deep. 800mL capacity.
Mounted CryoLoop - 20 micronHamptonHR4-955Mounted CryoLoops with 20 micron diameter nylon. These nylon loops are bonded to hollow, stainless steel MicroTubes™ that are used to mount, freeze, and secure the crystal during cryocrystallographic procedures and X-ray data collection. Different sizes exist and they can be adapted in lenght. They are quite versatile tools.
CryoWandMolecular DimensionsMD7-411
Puck dewar loading toolMolecular DimensionsMD7-607This tool is used to separate uni-pucks to load them into the robot dewar. It consists of two pieces: a Teflon tube part and a metal rod part.

Referanslar

  1. Austrian, R. Prevention of pneumococcal infection by immunization with capsular polysaccharides of Streptococcus pneumoniae: current status of polyvalent vaccines. J Infect Dis. 136, S38-S42 (1977).
  2. Bogaert, D., De Groot, R., Hermans, P. W. Streptococcus pneumoniae colonisation: the key to pneumococcal disease. Lancet Infect Dis. 4 (3), 144-154 (2004).
  3. van Mens, S. P., et al. Longitudinal analysis of pneumococcal antibodies during community-acquired pneumonia reveals a much higher involvement of Streptococcus pneumoniae than estimated by conventional methods alone. Clin Vaccine Immunol. 18 (5), 796-801 (2011).
  4. Weycker, D., Strutton, D., Edelsberg, J., Sato, R., Jackson, L. A. Clinical and economic burden of pneumococcal disease in older US adults. Vaccine. 28 (31), 4955-4960 (2010).
  5. Doern, G. V. Antimicrobial use and the emergence of antimicrobial resistance with Streptococcus pneumoniae in the United States. Clin Infect Dis. 33, S187-S192 (2001).
  6. Vasoo, S., et al. Increasing antibiotic resistance in Streptococcus pneumoniae colonizing children attending day-care centres in Singapore. Respirology. 16 (8), 1241-1248 (2011).
  7. Black, S., et al. Efficacy, safety and immunogenicity of heptavalent pneumococcal conjugate vaccine in children. Northern California Kaiser Permanente Vaccine Study Center Group. Pediatr Infect Dis J. 19 (3), 187-195 (2000).
  8. Hanage, W. P., et al. Diversity and antibiotic resistance among nonvaccine serotypes of Streptococcus pneumoniae carriage isolates in the post-heptavalent conjugate vaccine era. J Infect Dis. 195 (3), 347-352 (2007).
  9. Burnaugh, A. M., Frantz, L. J., King, S. J. Growth of Streptococcus pneumoniae on human glycoconjugates is dependent upon the sequential activity of bacterial exoglycosidases. J Bacteriol. 190 (1), 221-230 (2008).
  10. King, S. J. Pneumococcal modification of host sugars: a major contributor to colonization of the human airway?. Mol Oral Microbiol. 25 (1), 15-24 (2010).
  11. Tettelin, H., et al. Complete genome sequence of a virulent isolate of Streptococcus pneumoniae. Science. 293 (5529), 498-506 (2001).
  12. Buckwalter, C. M. Pneumococcal carbohydrate transport: food for thought. Trends Microbiol. 20 (11), 517-522 (2012).
  13. Bidossi, A., et al. A functional genomics approach to establish the complement of carbohydrate transporters in Streptococcus pneumoniae. PLoS One. 7 (3), e33320 (2012).
  14. Zheng, X., Gan, L., Wang, E., Wang, J. Pocket-based drug design: exploring pocket space. AAPS J. 15 (1), 228-241 (2013).
  15. Singh, S., Malik, B. K., Sharma, D. K. Molecular drug targets and structure based drug design: A holistic approach. Bioinformation. 1 (8), 314-320 (2006).
  16. Dessau, M. A., Modis, Y. Protein crystallization for X-ray crystallography. J Vis Exp. (47), (2011).
  17. Bergfors, T. . Protein crystallization: techniques, strategies, and tips. A laboratory manual. , (1999).
  18. Scapin, G. Molecular replacement then and now. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69 (Pt 11), 2266-2275 (2013).
  19. Mao, B., Pear, M. R., McCammon, J. A., Quiocho, F. A. Hinge-bending in L-arabinose-binding protein. The "Venus's-flytrap" model. J Biol Chem. 257 (3), 1131-1133 (1982).
  20. McCoy, A. J., Read, R. J. Experimental phasing: best practice and pitfalls. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 458-469 (2010).
  21. Dodson, E. Is it jolly SAD?. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 11), 1958-1965 (2003).
  22. Incardona, M. F., et al. EDNA: a framework for plugin-based applications applied to X-ray experiment online data analysis. J Synchrotron Radiat. 16 (Pt 6), 872-879 (2009).
  23. Popov, A. N., Bourenkov, G. P. Choice of data-collection parameters based on statistic modelling. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 7), 1145-1153 (2003).
  24. Terwilliger, T. C., et al. Can I solve my structure by SAD phasing? Planning an experiment, scaling data and evaluating the useful anomalous correlation and anomalous signal. Acta Crystallogr D Struct Biol. 72 (Pt 3), 359-374 (2016).
  25. Millan, C., Sammito, M., Uson, I. Macromolecular ab initio phasing enforcing secondary and tertiary structure. IUCrJ. 2 (Pt 1), 95-105 (2015).
  26. Taylor, G. L. Introduction to phasing. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 325-338 (2010).
  27. Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28 (1), 235-242 (2000).
  28. Bird, L. E., et al. Green fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in Escherichia coli. J Vis Exp. (95), e52357 (2015).
  29. Berrow, N. S., et al. A versatile ligation-independent cloning method suitable for high-throughput expression screening applications. Nucleic Acids Res. 35 (6), e45 (2007).
  30. Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): a vehicle for direct determination of three-dimensional structure. EMBO J. 9 (5), 1665-1672 (1990).
  31. Culurgioni, S., Harris, G., Singh, A. K., King, S. J., Walsh, M. A. Structural Basis for Regulation and Specificity of Fructooligosaccharide Import in Streptococcus pneumoniae. Structure. , (2016).
  32. Culurgioni, S., Tang, M., Walsh, M. A. Structural characterization of the Streptococcus pneumoniae carbohydrate substrate-binding protein SP0092. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 73 (Pt 1), 54-61 (2017).
  33. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal Biochem. 357 (2), 289-298 (2006).
  34. Wooh, J. W., Kidd, R. D., Martin, J. L., Kobe, B. Comparison of three commercial sparse-matrix crystallization screens. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 4), 769-772 (2003).
  35. Gorrec, F. Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Drug Discov Today. 21 (5), 819-825 (2016).
  36. Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium. J Mol Biol. 221 (1), 31-34 (1991).
  37. Newman, J., et al. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 10), 1426-1431 (2005).
  38. Garman, E. F., Mitchell, E. P. Glycerol concentrations required for cryoprotection of 50 typical protein crystallization solutions. Journal of Applied Crystallography. 29 (5), 584-587 (1996).
  39. Teng, T. -. Y. Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a free-standing thin film. Journal of Applied Crystallography. 23 (5), 387-391 (1990).
  40. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 10), 1251-1259 (2006).
  41. Gabadinho, J., et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. J Synchrotron Radiat. 17 (5), 700-707 (2010).
  42. Leonard, G. A., et al. Online collection and analysis of X-ray fluorescence spectra on the macromolecular crystallography beamlines of the ESRF. Journal of Applied Crystallography. 42 (2), 333-335 (2009).
  43. Walsh, M. A., Evans, G., Sanishvili, R., Dementieva, I., Joachimiak, A. MAD data collection - current trends. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 55 (Pt 10), 1726-1732 (1999).
  44. Dauter, Z. Data-collection strategies. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 55 (Pt 10), 1703-1717 (1999).
  45. Finke, A. D., et al. Advanced Crystallographic Data Collection Protocols for Experimental Phasing. Methods Mol Biol. 1320, 175-191 (2016).
  46. Gonzalez, A. Optimizing data collection for structure determination. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 11), 1935-1942 (2003).
  47. Leslie, A. G. The integration of macromolecular diffraction data. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (Pt 1), 48-57 (2006).
  48. Winter, G., Lobley, C. M., Prince, S. M. Decision making in xia2. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69 (Pt 7), 1260-1273 (2013).
  49. Sheldrick, G. M. Experimental phasing with SHELXC/D/E: combining chain tracing with density modification. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 4), 479-485 (2010).
  50. Skubak, P., Pannu, N. S. Automatic protein structure solution from weak X-ray data. Nat Commun. 4, 2777 (2013).
  51. Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65 (Pt 6), 582-601 (2009).
  52. Vonrhein, C., Blanc, E., Roversi, P., Bricogne, G. Automated structure solution with autoSHARP. Methods Mol Biol. 364, 215-230 (2007).
  53. Culurgioni, S., Harris, G., Singh, A. K., King, S. J., Walsh, M. A. Structural Basis for Regulation and Specificity of Fructooligosaccharide Import in Streptococcus pneumoniae. Structure. 25 (1), 79-93 (2017).
  54. Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens. Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyokimyasorunu 128ABC ta y c larStreptococcus pneumoniaekarbonhidrat al m nsubstrat ba lay c proteintermal st karakter tahliloklu a k sa lma MALSboyutu d lama Kromatografi snx n kristalografisi k r n mveri toplamaprotein yap z m

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır