JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol kimyasal ikinci harmonik üretimi görüntüleme ve diferansiyel kalorimetre taramakullanarak tavşan sklera cross-linking değerlendirmek için teknikler açıklanır.

Özet

Yapısal proteinler (fibriler collagens) tedavisi için içine kimyasal bağları (enzimatik olmayan cross-linking) tanıtarak doku güçlendirmek için yöntemleri fotokimyasal cross-linking ve doku (TXL) yöntemleri cross-linking içerir. Mekanik doku özellik değişikliklerini inducing için tür yöntemler için kornea Keratokonus gibi ilerici miyopi, sklera gibi hastalıklarda kornea incelme (mekanik olarak zayıflamış) nerede inceltme ve arka zayıflaması istihdam olmak sklera oluşur ve büyük olasılıkla Aksiyel uzaması için katkıda bulunur. Böyle doku güçlendirilmesi için birincil hedef proteinler Kuru Ağırlık proteinler kornea ve sklera büyük çoğunluğu oluşturan fibriler collagens vardır. Tesadüfen, fibriler collagens ikinci harmonik üretimi sinyalleri doku ekstrasellüler alanda ana kaynağıdır. Bu nedenle, kollajen proteinlerin bu terapiler, cross-linking ile indüklenen gibi değişiklikler potansiyel olarak algılanabilir ve ikinci harmonik üretimi mikroskobu (SHGM) kullanımı ile quantitated. SHGM izleme bir kızılötesi uyarma ışık ile birleştiğinde mikroskobu sistem tarama bir lazer kullanılarak sinyalleri Biyomedikal bilimlerde yaygın kullanımı zevk heyecan verici bir modern görüntüleme yöntemi kaynağıdır. Böylece, mevcut çalışma ölçmek için bir yol cross-linking etkileri ex vivo tavşan sklera, bir kimyasal ajan (sT), alt-bilir'ın uzaya cross-linking enjeksiyonu takiben indüklenen gibi SHGM mikroskobu kullanımını değerlendirmek için yürütülen bir enjeksiyon yaklaşım yani oküler anestezi Oftalmolojik klinik işlemler sırasında neden için standart bir uygulama. Kimyasal ajan cross-linking, sodyum hydroxymethylglycinate (SMG), kozmetik koruyucu ajanlar (FARs) serbest formaldehit bilinen bir sınıf geliyor. SHG sinyalleri artışlar scleral değişiklikleri SMG ile reaksiyonu takip sonuçlandı ve vardiya termal denatürasyon sıcaklık ile ilişkili, değerlendirmek için standart bir yol etkileri cross-linking doku indüklenen.

Giriş

İlerici miyop öne enzimatik olmayan scleral (fotokimyasal ve/veya kimyasal), cross-linking yoluyla tedavi edilebilir olması için verilen bu kollajen enzimatik cross-linking engelleme deneysel formu yoksunluk (FD) artırabilir hangi mantıklı-indüklenen miyopi1. Elsheikh ve Phillips2 son zamanlarda ele fizibilite ve standart ultraviyole-bir ışınlama (UVA) kullanarak potansiyel-riboflavin aracılı fotokimyasal (Dresden protokolü olarak da bilinir) kısaltılmış cross-linking burada (riboflavin CXL) olarak miyopi Aksiyel uzama durdurmak posterior scleral istikrar için. Fotokimyasal bu yöntem başarıyla istikrarsızlık Keratokonus ve post-LASIK keratectasia görülen anterior küre yüzeyi (Yani, şişkin kornea) tedavisi için kullanılır. Ancak, bu CXL iletişim kuralı sklera için uygulanması gereken çok daha büyük doku yüzey alanı değiştirmek için yanı sıra bir ultraviyole (UV) ışık kaynağı ile posterior sklera erişim zorlukları ile ilgili sorunlar tarafından engelliyordu. Birden çok arka sklera bölgelerinde ki çalışma3birden çok ayrı ışınlama bölgelerinde gerekli, ancak söyleniyor, CXL yaklaşım görsel biçimde Aksiyel uzama durdurmak için oluşturulduğunu tavşan (tarsorrhaphy tarafından), yoksun. Buna karşılık, enjeksiyon sT alanı üzerinden kimyasal teskin ajan (Yani, cross-linking agent) UV ışık kaynağı tanıtmak için ihtiyaç kaçınarak posterior sklera değiştirmek için daha basit bir yolu temsil edebilir. Bu enjeksiyon tekniği iyi katarakt cerrahisi4,5,6gibi Oftalmolojik yordamları sırasında oküler anestezi inducing kullanışlı bir yol olarak bilinir. Wollensak7 daha önce gliseraldehit (bir kimyasal cross-linking agent kavramına benzer bu çalışmada açıklanan ajanlar (FARs) serbest formaldehit için) kullanarak bir sT enjeksiyon kullanımı nitelendirdi tavşan sklera ve genipin sıkın için vardır FD eskiden şiling şimdi pigs8,9Aksiyel uzunluğu sınırı gösterilmiştir. Bu müfettişler çözünür bir kimyasal ajan üzerinde fotokimyasal CXL tekniği kullanarak açık bir avantaj gösterdi. Böylece, scleral enjekte edilebilir bir kimyasal ajan FARs (Yani, TXL) dahil olmak üzere bazı tip kullanarak cross-linking10, scleral uzama miyopi içinde görülen ilerlemesini durdurmak için uygun tedavi yöntemi verebilir.

Burada sunulan iletişim kuralları kadavra tavşan gözler sklera için sT enjeksiyon yolu ile teslim bir kimyasal cross-linking çözümü sodyum hydroxymethylglycinate (SMG), kullanın. Biz daha önce topikal kimyasal kornea cross-linking için benzer iletişim kuralları hayata geçirdik. Özellikle daha önce bildirilen bu çalışmalarda, konsantrasyon etkileri cross-linking bağımlı SMG, o şeyden de termal denatürasyon analiz11 tarafından belirlenen fotokimyasal CXL ile ulaşılabilir kapsayan etkisi aralığı kullanarak elde .

Burada sT enjeksiyonları scleral doku, termal denatürasyon diferansiyel tarama Kalorimetre (DSC) ve ikinci harmonik üretimi mikroskobu (SHGM) kullanarak üzerinden teslim SMG cross-linking etkisini değerlendirmek için iletişim kurallarını açıklar.

Diferansiyel tarama Kalorimetre (DSC), Termal Analiz olarak da bilinir, bir termal denatürasyon geçiş, scleral doku olduğu çoğunlukla onlar toplu çoğunluk teşkil beri fibriler collagens özellikleri tarafından destekli ölçülür protein. Bu yöntem kollajen moleküler yapısı kararlılığını ve kollajen liflerinde, asıl Tersiyer protein yapısı stabilize çapraz bağlı Tahvil değerlendirir. DSC içinde Isıtma sırasında kritik geçiş sıcaklığı denatürasyon kollajen molekülünün üçlü sarmal, ne jelatin yaygın formları bir süreç, sökme ortaya çıkan sonuçları elde edilir. Bu termal denatürasyon kollajen molekülü boyunca hidrojen bağları bozan ve daha yüksek sıcaklıklara indüklenen cross-linking yöntemleri12,13arası kaymıştır. Bu yöntem özellikle Biyomalzeme sektöründe uzun yıllar için ve deri-yapma içeren işlemler için kullanılmıştır. Ancak, bu yöntem sklera doku çıkarılması gerektirir ve bu nedenle sadece bir ex vivo teknik olarak yararlı olabilir.

İkinci harmonik üretimi mikroskobu (SHGM) ile sigara centrosymmetric moleküler ortamlar belirli malzemelerin doğrusal olmayan optik özellikleri temel alır. Tür malzemelerin, yoğun ışık, örneğin ışık lazerler tarafından üretilen, olay ışık frekans katıdır SHG sinyalleri üretir. SHG sinyalleri oluşturmak için bilinen biyolojik kollajen, mikrotübüller ve kas myosin malzemelerdir. Örneğin, kollajen 860 nm dalga boyu bir kızılötesi ışık ile heyecanlı-ecek göndermek 430 nm dalga boyu ile görünür aralıktaki bir SHG sinyal. İkinci harmonik üretimi (SHG) sinyal görüntüleme tedavi kollajen cross-linking değerlendirmek için umut verici bir yöntemdir. Bu dokularda kollajen liflerinde SHG sinyalleri14yayarlar 30 yıldan fazla zamandır. Ancak, yakın zamanda yüksek çözünürlüklü görüntüleri15 dokular, tendon16, Cilt, kıkırdak17, kan damarlarının18, dahil olmak üzere çeşitli ve kollajen jelleri19elde edilebilir.

Bu bilgiye dayalı, bu çalışmada kollajen kimyasal olarak indüklenen SMG cross-linking aracılığıyla sklera indüklenen SHG sinyal değişiklikleri değerlendirir. Sonuçları, sklera SMG değişiklik doku kollajen lif demetleri (kollajen liflerinde oluşan yüksek sipariş dördüncül yapı) üretilen SHG sinyalleri artırır ve ayrıca kollajen bir yapısal morfolojik değişiklik üretir gösterir fiber ağ, yansıyan fiber bundle "düzleştirme içinde."

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm yordamları kullanarak kadavra tavşan gözler bozulmadan outbred tavşan başkanları içinde gerçekleştirilmiştir. Bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı tüm kurumsal ve ulusal yönergeleri takip edildi.

1. hazırlanması çözümleri

  1. TXL için SMG hazırlık:
    1. 1 mL 0,2 M konsantrasyon sodyum bikarbonat çözüm (NaHCO3) çözüm 0.0165 g 1 mL distile su içinde çözünmüş NaHCO3 tozu kullanarak hazırlayın.
    2. Toz sodyum hydroxymethylglycinate (SMG) 0.1016 mg 1 mL distile su 800 mM SMG son bir konsantrasyon almak için geçiyoruz. Sodyum bikarbonat çözüm 0.1 M NaHCO3 ve 400 mM SMG son bir konsantrasyon için ayarlayın. SMG konsantrasyonları bağlı olarak istenilen cross-linking etkisi. Burada açıklanan protokolünde 40, 100 ve 400 mM SMG kullanılır.

2. subTenon'ın enjeksiyon TXL SMG kullanmak için

  1. İki 1 mL insülin şırınga (25 G iğneler) 400 µL kontrol ve SMG çözüm, sırasıyla doldurun.
  2. Tavşan kafası profil uçağa yardımı ile bir yastık yerleştirin. Strafor veya bir kağıt yığını kafa içinde en uygun bir pozisyon düzeltmek için kullanılabilir.
  3. Göz kapakları ile Pediatrik göz spekulum geri çek.
  4. İlk göz içi basıncı (GiB) bir applanation tonometry aygıtı kullanarak ölçmek.
  5. Bir doku işaretçisi ile işaret amaçlanan enjeksiyon limbus üst orta kısmında yer.
  6. Konjonktival forseps (veya herhangi bir Forseps ile tırtıklı yuvarlak uç) ile Enjeksiyon Makinası çevreleyen konjonktiva geri çekmek ve bilir'ın kapsül biraz ötesinde işaretli limbal sitesi (Yani, 2-3 girme konjonktiva, iğne ekleme ««limbus mm'den). Konjonktiva küçük bir insizyon attım da Iris makasla bilir'ın kapsül ile iğne geçişini kolaylaştırmak amacıyla yapılabilir.
  7. Bir kez bilir'ın kapsül içinde yan yana hareket ettirerek iğne serbestçe hareket eden olduğundan emin olun. Bu süre boyunca, dünya taşımamalısınız. Bu alt-bilir'ın (sT) sklera yukarıda iğne uygun yerleştirme onaylar alanı.
  8. Eriyik--dan belgili tanımlık tenkıye enjekte ve iğne atın. Hemen enjeksiyonu, bir ön şişkinliği konjonktiva (örneğin, chemosis) görülen oluşturma sT alanda sıvı birikir.
  9. GiB ölçüm amacıyla Dünya yanlışlıkla bir delikli nedeniyle değişmedi onaylamak için yineleyin.
  10. Kapak spekulum kaldırmak ve kapalı göz kapakları ile dijital masaj yaklaşık 2-3 dakika için gerçekleştirin.
  11. Baş 3.5 h bir kuluçka dönemi için bırakın (Oda sıcaklığı 18 ° C =), sonraki adıma geçmeden önce.

3. doku hazırlık

  1. Dünya erişimi en iyi duruma getirmek için göz kapağı spekulum kullanarak göz kapakları geri çek. Gözün boyutuna göre en iyi şekilde büyüklükte spekulum seçin.
  2. Limbus çevreleyen konjonktiva ayırın. Zaten enjeksiyon bölgesine yakın kazıma, böylece bir inoculum boyutu yaklaşık 1 x 1 cm içerecektir çepeçevre sınırlarını genişletmek.
  3. Ekstra oküler kas scleral ekleme kendi sitelerinde de kes.
  4. Arka taraftan bastırıyor Forseps ile göz küresi yükseltmek. Bu arka dünya erişim sağlar ve optik sinirin oftalmik arter ve ven dünyanın kutup posterior bulunan kesme kolaylaştıracaktır.
  5. Corneoscleral işaretli enjeksiyon yeri de dahil olmak üzere dış kenarlığı ile karmaşık, kes. Leke hala sklera kalan kısmını görünür olmalıdır.
  6. Corpus vitreus ve doku Forseps ile çekiş uygulayarak sklera iç tarafına bağlı tüm katmanları kaldırın.
    Not: Daha fazla adımlar aşağıdaki yordamları üzerinde gerçekleştirilen bağlıdır: 4. - DSC analizi, 5. - SHG mikroskobu.

4. için bölgesel DSC analizi

  1. Tedavi göz için: diğer scleral bardaktan makasla kesmek enjeksiyon sitenin üst sektöründe yer alan ve merkezi olarak hizalanmış için dört scleral sektörler. Her iki yan tarafı (Yani, burun ve temporal) ve alt kalan 3 sektörlerden kesti.
    Not: daha fazla kareler (1-16) ayrılır (1-4) sektörler numaralandırma şekil 1A' gösterilmiştir.
  2. Scleral sektörler (1-4) daha küçük kareler (1-16) yaklaşık olarak 4 x 4 mm her halinde kesin. Sektör 1 (enjeksiyon tam site bir bireysel kare [kare 2] olun) 9 kareler bölünmüş olmalıdır. Sektör 2 ve 3 (10-11 ve 12-13 kareler) 2 karelere ve sektör 4 (kareler 14-16) 3 karelere bölün.
  3. Eklenen alanın konumunu analiz dokudan mesafe yerelleştirmek için şekil 1A', gösterildiği gibi her kareye bir numara atamak.
  4. Denetim göz için: doku dört scleral sektörler (tedavi dokusu ile benzer) içine bölme doku kare parçalarını dışarı aşağıdaki konumlardan kestikten sonra: 3 kareler üst bölgeden (sektör 1), her iki tarafın (sektör 2 ve 3) ve 1'den 1 alt sektör (sektör 4).
  5. Gırç kalan retina ve choroidal katmanları ve yıkama iki kez taze PBS ile her zaman çözüm için yaklaşık 10 batık adet bırakarak teker s.

5. için SHG görüntüleme

  1. 1 x 1 cm alan merkezi olarak hizalanmış Enjeksiyon Makinası ile oluşturmak için makas kullanarak sklera üst kısmı kesilmiş.
  2. Scrape off diğer retina ve choroid katmanları ve çözüm için yaklaşık 10 adet bırakarak her zaman iki kez taze PBS ile yıkayın s.
  3. Yer 1 mL tüpler doku görüntüleme merkezine ulaşım için PBS çözüm ile dolu. Kuluçka zaman aşağıdaki ve göz küresi diseksiyon ile başlayan tüm yordamları, bir saat içinde yapılmalıdır.

6. mikroskobu Protokolü

Not: Bu iletişim kuralı için görüntüleme arka dağınık SHG sinyalini kollajen sklera doku mikroskobu tarama lazer için hazırlanmıştır.

  1. Kurmak mikroskobu
    1. En üst düzeye çıkarmak için sinyal ve kararlılık ne zaman SHG mikroskobu yapmak kullanın bir objektif lens ışık ve yüksek sayısal diyafram (NA) ile kızılötesi iletimi için en iyi duruma getirmek. Bizim hedefimizdir Nikon Apo LWD 25 x / NA1.1 su daldırma.
    2. Coverslip, 0,17 milimetre kalınlığında örnek derinliği bu durumda eşleştirmek için lens düzeltme yaka ayarlayın.
    3. 25 x objektif lens mount ve görüntüleme yüzey örnek montaj önce karşılamak için su bazlı jel yağlama cömert bir miktar ekleyin. Su bazlı jel deneme sırasında buharlaşır değil ve bu nedenle görüntü kalitesini korur.
    4. PBS ile 1 mL tüp scleral dokudan iki 25 mm yuvarlak coverslips (episcleral tarafı aşağı) episclera ve coverslip yüzey arasında'deki sağlayan maksimal temas arasında kurutma olmadan yerleştirin.
      Not: Doku da coverslip üzerinde ele geçen yerleştirilebilir. PBS iyi bir miktar görüntüleme sırasında sulu doku tutmalı. Bu durumda, doku parçası ve PBS cellchamber montaj sonra ekleyin.
    5. Hücre odası 25 mm yuvarlak coverslip, tek yerleştirerek veya odası alt kısmında bir sandviç tekniği montaj ve mühürlü bir oda oluşturmak için aşağı üst kısmı canı cehenneme. Sıkı bir üst coverslip, yapay olarak düzleştirme önlemek ve dokusuna zarar için kullanıldığında aşağı yatmayacaksın.
    6. Hücre odası doku örneği ile mikroskop Sahne Alanı'nda bağlayın.
    7. Mikroskop görünüm iletilen ışık için ayarlayın.
    8. Sahne getirin ve örnek alt yüzeyine odakta, parlak alan muayene göz parça aracılığıyla tarafından belirlenen öyle ki amaç yüksekliğini ayarlayın.
    9. Bilgisayar monitörü hariç tüm ışıkları kapatın ve alüminyum folyo levhalar mikroskop Sahne Alanı'nda bol dökümlü ile mümkün olduğu kadar MONITOR gelen ışık engellemek. GaAsP NDD dedektörleri yüksek hassasiyet gibi herhangi bir kaçak ışık dedektörleri ulaşan en aza düşük gürültü satın alma, garanti eder.
    10. Yazılım Ti Pad panelinde objektif tanımı doğru olup olmadığını denetleyin.
    11. A1 kompakt GUI panelinde IR lazer görüntüleme için seçin, NDD dedektörleri seçin ve bir 400-450 nm bant filtre ile donatılmış DAPI kanalını seçin.
    12. 860 nm ve açık Kızılötesi Lazer dalga boyu A1 MP GUI Masası'nda ayarlanan çekim.
    13. Lazer tarama koşulları A1 kompakt GUI panelinde aşağıdaki gibi ayarlayın. Seçin: (a) Galvano inceden inceye gözden geçirmek, (b) tek yönlü tarama, (c) piksel Işınma Zamanı 6.2 µs, (d) çerçeve boyutu 1024 x 1024 piksel, (e) satır ortalama 2 x
      Not: Galvano inceden inceye gözden geçirmek ve tek yönlü tarama hassas noktasına uyum sağlar. Boyutu 1024 x 1024 tam görüş alanı için 0.5 mikron /pixel piksel boyutunu çevirir. Satır ortalama görüntü çekim gürültü azaltır.
    14. Lazer güç ve Dedektör kazanç ayarlayarak koşulları A1 kompakt GUI Masası'ndaki görüntüleme ayarla. Geçerli yansımadaki pixel yoğunluk değerleri histogramını görüntüler yukarı bak Tablo panelini (AÜSS) açın. Canlı görüntüleme "Bulmak" modunda açın ve lazer güç ve Dedektör kazanç ayarlayarak piksel aralýðý algılanan en üst düzeye çıkarmak. Doygunluk kaçının. Tipik değerlerdir 2,35 W 860, toplam % 2.5 lazer iktidardan nm ve 100 HV (Dedektör kazanç).
    15. Not: Bu kurulum için bir dahili güç metre ile ölçülen lazer 5.2 güçtür mW. Her saat bir deney gerçekleştirilir, öyle ki iç güç ölçüm 5.2 sabittir lazer yeniden yüzdeye mW görüntüleme oturumları arasında. Lazer güç ayarlarken özen gösterilmelidir. Bukalemun II lazerdir 3 W lazer 800 nm ve % 10 veya daha yüksek güç potansiyel olarak doku hasarına neden.
  2. Resim alma
    1. Önizleme modunda XYZ genel bakış aracını kullanarak doku alan tarama.
    2. Düşsel hız yukarıya imge içinde bu tarz edinimi için daha düşük çözünürlük (256 x 256 piksel ve hiçbir satır ortalama) için ayarlayın.
    3. 5 x 5, 3 x 3 veya tek alanları doku tüm yüzey kapsayacak şekilde bakış yakalamak. Daha önce genel bakış yakalama her yerde canlı "Scan" modunu ve doku odak haline getirmek. Dokusunun farklı bölgelerde farklı pozisyonlar eksenel yönde olduğunu unutmayın.
    4. Nerede kollajen lifleri görüş tüm alanı görülür ve o konumda sahne o belirli konuma taşımak için genel bakış aracı çift tıklatın düz bir alan bulun.
    5. Canlı "Scan" modunu alt uçak odakta öyle ki amaç Z konumunu ayarlamak ve Ti defterinde, Z sürücü optik uçak 10-15 mikron bu alt tabaka üzerinde taşımak için kullanın.
    6. 1024 x 1024 piksel ve ortalama, "Yakala" düğmesini kullanarak 2 x çizgi ile yüksek çözünürlükte bir görüntü elde etmek.
    7. Kaydetme konumu XYZ genel bakış içindeki "+" düğmesini kullanarak. Bu doku aynı bölgede değil tekrar sağlar.
    8. Doku her parça için alanları bakış üst üste 10 çekim.

7. DSC Protokolü

Not: doku hazırlık tam, bölgesel DSC analizi için veya SHGM gerçekleştirildiğinde doku görüntüleme sonra en kısa zamanda bu adıma geçin.

  1. DSC tava, tartılır ve etiketli hazırlayın.
    Not: Bu adım, doku kuruma en aza indirmek için doku diseksiyon önce yapılmalıdır.
  2. Her scleral bir kare bir emici doku ile kuru ve düz dişli forseps kullanarak bir DSC pan dibinde yatıyordu.
  3. Doku içinde ve kapak sıkışmasını tavayla tartmak ve kaplı doku almak için ağırlık ıslak (örnekleri kütlesi 5-11 mg aralığında olmalıdır).
    Not: Sonraki doku örneği geçmeden önce crimper kullanarak mühür her pan. Tava hermetik, Termal Analiz önce herhangi bir su kaybını önleme mühürlü.
  4. Bir kez örnek sıkışmasını, belirlenen konumu DSC tepsiye yerleştirin. Denetim için 6 örnekleri ve 16 tedavi göz için olmalıdır.
  5. Yazılımları yönetme, doku ağırlığını belirtme aracı kullanarak bir yöntem oluşturun ve aşağıdaki parametreleri kullanarak Termal Analiz çalıştırın: Sıcaklık aralığı 40-80 ° c, Isıtma oranı: 1 ° C/dak, ısı akışı: 17.37 mW, gaz (N2) akış: 19,8 mL/dk, Gaz basıncı: 2,2 bar.
  6. Bir kez tam, yazılımları yönetme aracı kullanarak hangi termal denatürasyon geçiş sıcaklığı zirvesinde oluşur ayıklanıyor tarafından her örnek için veri analiz.

8. görüntü analizi

  1. SHG sinyal
    1. Resmin çoğunlukla kollajen lifleri tarafından işgal öyle ki en az 5-10 her tedavi ve onun kontrol en iyi temsil eden görüntülerin seçin.
    2. Her resim ImageJ yazılım yükleme ve ortalama piksel yoğunluğu seçerek ölçmek Analiz > ölçüm etkin görüntü için.
    3. Çıkarılan değerler ortalama piksel yoğunluğu bildirilir ve menüden seçerek histogram yoğunluklarını komplo tarafından da gösterilebilir Analiz > çubuk grafik.
    4. Buna göre tüm ölçülen verileri belgelemek için bir tablo oluşturmak bir Excel sheet kullanarak örnek kimliği
    5. Ortalama ve standart sapma tedavi ve kontrol her koşul için piksel yoğunluğunu hesaplamak.
    6. Öğrencinin kullanarak t-Testi, konsantrasyonları (Yani, 40 mM SMG 0 ve 400 mM SMG 0 vs vs) tüm ikili karşılaştırmalar için farkları karşılaştırın. [P≤0.05].
  2. Dalgalılık
    1. Kollajen lifleri görüntüler bir görüntü seçin. Örnek başına en az 10 resim (bir denetimi örneğini her konsantrasyon - en az 40 toplam için de dahil olmak üzere) analiz edilmelidir.
    2. Açık ImageJ > Eklentiler > NeuronJ. NeuronJ önceden yüklenmiş olmasını gerektirir.
    3. Tüm imagesby açılan bir NeuronJ penceresine sürükleyerek yükleyin.
    4. Fare ile Fibriller kontur takip lifleri, doğrultuda izleme oluşturma (Tablet çizim kalem kullanılabilir), M toplam lif uzunluğu mesafeyi ölçmek için'ı tıklatın.
    5. "Teğet düz bir çizgi çizmek ve başlangıç ve daha önce çizilmiş lif dağılımı sonuna bağlamak için" seçeneği. Şimdi uçtan uca uzunluğu ölçmek için M'yi tıklatın.
    6. Resim başına en az 10 liflerinde üzerinde aynı işlemi tekrarlayın.
    7. Bu iki ölçüm her 10 liflerinde toplamak ve veri uzunluğu [eğri] ve [doğrusal], uzunluğu toplam lif uzunluğu (kontur) ve uçtan uca uzunluğu (düz çizgi bağlantı) ifade bir excel elektronik tablosu içine sırasıyla giriş.
    8. Dalgalılık Endeksi (W) formül kullanılarak hesaplanır: W = uzunluk [eğri] / [doğrusal] uzunluğu.
    9. Tedavi samples(SMG) görüntüleri kontrol örnekleri formülü kullanarak görüntüleri ile gelen verileri karşılaştırarak dalgalılık % hesaplamak: (W [SMG] - 1) / (W [denetim] - 1)
    10. İkili bir t-test dalgalılık dizin (W) için farklı tedavi koşulları ve denetim arasındaki istatistiksel farklar (p-değerler) kollajen lif morfolojisi belirlemek amacıyla gerçekleştirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Termal denatürasyon sıcaklık (Tm) etkisi cross-linking TXL değerlendirmek için bir tahlil yöntemi olarak: Toplam 16 çift tavşan gözler bu deneylerde TXL yordamı için kullanılmıştır. Bu çalışmanın ilk bir parçası, SMG cross-linking Agent kadavra tavşan kafası uzayda sT üzerinden tek bir enjeksiyon tarafından indüklenen cross-linking efekti yerelleştirmesini değerlendirilmiştir. Daha fazla yerde enjeksiyonları sklera istenen bir alanını denge...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Yapılan deneyler sklera, gelecekteki olasılığını tedaviler cross-linking için bir izleme aracı bu tekniği kullanarak yetiştirmek etkileri cross-linking kollajen değerlendirilmesi için bir yöntem olarak SHG sinyal mikroskobu kullanımı destekleyen kanıtlar göstermiştir kollajen protein hedef. Not, bir enstrüman potansiyel olarak bu SHG sinyal yakalayabilir klinik zaten. Her ne kadar bu araç öncelikle görüntüleme cilt insan DermIS için tasarlanmıştır, bu başarılı bir şekilde görüntü kornea...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar Tongalp Tezel, MD, istişare sT enjeksiyon ile ilgili için teşekkür ederiz; Theresa Swayne, doktora, Danışma SHG mikroskobu ile ilgili olarak; ve Jimmy Duong tasarım ve Biyoistatistik kaynak ve Biostatistical çekirdek tesisi Columbia Üniversitesi Tıp Merkezi Irving Enstitüsü.

Kısmen körlüğü önlemek için araştırma ve ulusal kurumları, sağlık hibe NCRR UL1RR024156, NEI P30 EY019007, ncı P30 CA013696 ve NEI R01EY020495 (DCP) tarafından desteklenen. Columbia Üniversitesi'nde ilgili fikri mülkiyet sahibi: verilen ABD patent no: 8,466,203 ve yok: 9,125,856. Uluslararası patent bekleyen: PCT/US2015/020276.

Görüntüleri Confocal içinde toplanan ve İhtisas mikroskobu paylaşılan kaynak-Herbert Irving kapsamlı Kanser Merkezi, Columbia Üniversitesi, NIH tarafından desteklenen hibe #P30 CA013696 (Ulusal Kanser Enstitüsü). Confocal mikroskop NIH ile satın alınmış #S10 RR025686 verin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
MILLI-Q SYNTHESIS A10 120VEMD Millipore, Massachusetts, USADouble distilled, deionized water. - protocol step 1.1.1
Sodium hydroxymethylglycinate Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USACrosslinking reagent - protocol step 1.1.2
Injection needle with luer-lock syringeBD Eclipse, NJ, USASyringe for sub tenon injection. - protocol step 2.1
Rabbit headLa Granja poultryOutbredRabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. - protocol step 2.2
Tono-pen Reichter Technologies Depew, NYIOP measurements - protocol step 2.4
DSC 6000 AutosamplerPerkin-Elmer Waltham, MA, USAThermal denaturation analyzer - protocol step 7.4
Pyris software Perkin-Elmer, Waltham, MA, USAVer 11.0 protocol step 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MPNikon Instruments, Melville, NY, USAA water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm - protocol step 8.1.1.
GenTeal Alcon, Fort Worth, TX B000URVDQ8Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation - 8.1.1
Chameleon Vision II Coherent, Santa Clara,CA, USATi:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. - protocol step 8.1.11
AttoFluor cell chamberThermo Fisher Scientific IncA7816Fixation of the cover slip - protocol step 8.1.3
25-mm round coverslips, #1.5Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USAGG-25-1.5protocol step 8.1.3
Eclipse Ti-ENikon Instruments, Melville, NY, USAprotocol step 8.1.4.
Non-descanned (NDD) GaAsP detectorNikon Instruments, Melville, NY, USAEquipped with a 400-450 nm band pass filter - protocol step 8.1.7
A1R-MP laser scanning systemNikon Instruments, Melville, NY, USACompatible with infrared (IR) multi-photon excitation. - protocol step 8.1.8
NIS Elements softwareNikon Instruments, Melville, NY, USAVer 4.3refered to as "software" in the text - protocol step 8.1.9
Fiji/ImageJNational Institute of Health protocol step 9.1.2
NeuronJEric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlandshttps://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2
Microsoft Excel Microsoft Corporation, Redmond, WA, USAVer 14protocol step 9.2.8

Referanslar

  1. McBrien, N. A., Norton, T. T. Prevention of collagen crosslinking increases form-deprivation myopia in tree shrew. Exp Eye Res. 59 (4), 475-486 (1994).
  2. Elsheikh, A., Phillips, J. R. Is scleral cross-linking a feasible treatment for myopia control? Ophthalmic Physiol Opt. 33 (3), 385-389 (2013).
  3. Dotan, A., et al. Scleral cross-linking using riboflavin and ultraviolet-a radiation for prevention of progressive myopia in a rabbit model. Exp Eye Res. 127, 190-195 (2014).
  4. Canavan, K. S., Dark, A., Garrioch, M. A. Sub-Tenon's administration of local anaesthetic: a review of the technique. Br J Anaesth. 90 (6), 787-793 (2003).
  5. Guise, P. Sub-Tenon's anesthesia: an update. Local Reg Anesth. 5, 35-46 (2012).
  6. Ahn, J. S., et al. A sub-Tenon's capsule injection of lidocaine induces extraocular muscle akinesia and mydriasis in dogs. Vet J. 196 (1), 103-108 (2013).
  7. Wollensak, G., Redl, B. Gel electrophoretic analysis of corneal collagen after photodynamic cross-linking treatment. Cornea. 27 (3), 353-356 (2008).
  8. Liu, T. X., Wang, Z. Collagen crosslinking of porcine sclera using genipin. Acta Ophthalmol. 91 (4), e253-e257 (2013).
  9. Wang, M., Corpuz, C. C. Effects of scleral cross-linking using genipin on the process of form-deprivation myopia in the guinea pig: a randomized controlled experimental study. BMC Ophthalmol. 15, 89(2015).
  10. Babar, N., et al. Cosmetic preservatives as therapeutic corneal and scleral tissue cross-linking agents. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1274-1282 (2015).
  11. Kim, S. Y., et al. Evaluating the Toxicity/Fixation Balance for Corneal Cross-Linking With Sodium Hydroxymethylglycinate (SMG) and Riboflavin-UVA (CXL) in an Ex Vivo Rabbit Model Using Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Cornea. 35 (4), 550-556 (2016).
  12. da Cruz, L. G., Moraes, G. D. A., Nogueira, R. F., Morandim-Giannetti, A. D. A., Bersanetti, P. A. DSC characterization of rabbit corneas treated with Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville extracts. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. , (2017).
  13. Bersanetti, P. A., et al. Characterization of Rabbit Corneas Subjected to Stromal Stiffening by the Acai Extract (Euterpe oleracea). Curr Eye Res. 42 (4), 528-533 (2017).
  14. Freund, I., Deutsch, M. Second-harmonic microscopy of biological tissue. Opt Lett. 11 (2), 94(1986).
  15. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  16. Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophys J. 88 (2), 1377-1386 (2005).
  17. Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J Anat. 215 (6), 682-691 (2009).
  18. Tsamis, A., Krawiec, J. T., Vorp, D. A. Elastin and collagen fibre microstructure of the human aorta in ageing and disease: a review. J R Soc Interface. 10 (83), 20121004(2013).
  19. Raub, C. B., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys J. 92 (6), 2212-2222 (2007).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
  22. Zyablitskaya, M., et al. Evaluation of Therapeutic Tissue Crosslinking (TXL) for Myopia Using Second Harmonic Generation Signal Microscopy in Rabbit Sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (1), 21-29 (2017).
  23. Steven, P., Muller, M., Koop, N., Rose, C., Huttmann, G. Comparison of Cornea Module and DermaInspect for noninvasive imaging of ocular surface pathologies. J Biomed Opt. 14 (6), 064040(2009).
  24. Han, M., Giese, G., Bille, J. F. Second harmonic generation imaging of collagen fibrils in cornea and sclera. Optics Express. 13 (15), 5791-5797 (2005).
  25. Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).
  26. Teng, S. W., et al. Multiphoton autofluorescence and second-harmonic generation imaging of the ex vivo porcine eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1216-1224 (2006).
  27. Rao, R. A., Mehta, M. R., Leithem, S., Toussaint, K. C. Jr Quantitative analysis of forward and backward second-harmonic images of collagen fibers using Fourier transform second-harmonic-generation microscopy. Opt Lett. 34 (24), 3779-3781 (2009).
  28. Morishige, N., Petroll, W. M., Nishida, T., Kenney, M. C., Jester, J. V. Noninvasive corneal stromal collagen imaging using two-photon-generated second-harmonic signals. J Cataract Refract Surg. 32 (11), 1784-1791 (2006).
  29. Aptel, F., et al. Multimodal nonlinear imaging of the human cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2459-2465 (2010).
  30. Winkler, M., et al. Nonlinear optical macroscopic assessment of 3-D corneal collagen organization and axial biomechanics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (12), 8818-8827 (2011).
  31. Morishige, N., Takagi, Y., Chikama, T., Takahara, A., Nishida, T. Three-dimensional analysis of collagen lamellae in the anterior stroma of the human cornea visualized by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (2), 911-915 (2011).
  32. Gore, D. M., et al. Two-photon fluorescence microscopy of corneal riboflavin absorption. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (4), 2476-2481 (2014).
  33. Park, C. Y., Lee, J. K., Chuck, R. S. Second Harmonic Generation Imaging Analysis of Collagen Arrangement in Human Cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (9), 5622-5629 (2015).
  34. Quantock, A. J., et al. From nano to macro: studying the hierarchical structure of the corneal extracellular matrix. Exp Eye Res. 133, 81-99 (2015).
  35. Morishige, N., et al. Quantitative analysis of collagen lamellae in the normal and keratoconic human cornea by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (12), 8377-8385 (2014).
  36. Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (3), 1087-1094 (2007).
  37. Steven, P., Hovakimyan, M., Guthoff, R. F., Huttmann, G., Stachs, O. Imaging corneal crosslinking by autofluorescence 2-photon microscopy, second harmonic generation, and fluorescence lifetime measurements. J Cataract Refract Surg. 36 (12), 2150-2159 (2010).
  38. Bueno, J. M., et al. Multiphoton microscopy of ex vivo corneas after collagen cross-linking. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (8), 5325-5331 (2011).
  39. McQuaid, R., Li, J. J., Cummings, A., Mrochen, M., Vohnsen, B. Second-Harmonic Reflection Imaging of Normal and Accelerated Corneal Crosslinking Using Porcine Corneas and the Role of Intraocular Pressure. Cornea. 33 (2), 125-130 (2014).
  40. Laggner, M., et al. Correlation Between Multimodal Microscopy, Tissue Morphology, and Enzymatic Resistance in Riboflavin-UVA Cross-Linked Human Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (6), 3584-3592 (2015).
  41. Chai, D., et al. Quantitative assessment of UVA-riboflavin corneal cross-linking using nonlinear optical microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4231-4238 (2011).
  42. Scarcelli, G., et al. Brillouin microscopy of collagen crosslinking: noncontact depth-dependent analysis of corneal elastic modulus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (2), 1418-1425 (2013).
  43. Shao, P., Besner, S., Zhang, J., Scarcelli, G., Yun, S. H. Etalon filters for Brillouin microscopy of highly scattering tissues. Opt Express. 24 (19), 22232-22238 (2016).
  44. Kumar, C. M., McNeela, B. J. Ultrasonic localization of anaesthetic fluid using sub-Tenon's cannulae of three different lengths. Eye (Lond). 17 (9), 1003-1007 (2003).
  45. Winder, S., Walker, S. B., Atta, H. R. Ultrasonic localization of anesthetic fluid in sub-Tenon's, peribulbar, and retrobulbar techniques. J Cataract Refract Surg. 25 (1), 56-59 (1999).
  46. Ripart, J., Eledjam, J. J. [Locoregional anesthesia for ophthalmic surgery: unique episcleral injection (sub-tenon) in the internal canthus]. Ann Fr Anesth Reanim. 17 (4), Fi72-Fi74 (1998).
  47. Meek, K. M., Hayes, S. Corneal cross-linking--a review. Ophthalmic Physiol Opt. 33 (2), 78-93 (2013).
  48. Wollensak, G., Spoerl, E. Collagen crosslinking of human and porcine sclera. J Cataract Refract Surg. 30 (3), 689-695 (2004).
  49. Paik, D. C., Wen, Q., Airiani, S., Braunstein, R. E., Trokel, S. L. Aliphatic beta-nitro alcohols for non-enzymatic collagen cross-linking of scleral tissue. Exp Eye Res. 87 (3), 279-285 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T psay 131sodyum hydroxymethylglycinatedoku cross linkingy ksek miyopiskleraikinci harmonik retimi sinyaltermal denat rasyon s cakl kdiferansiyel tarama Kalorimetretav an g zler

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır