JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu iletişim kuralı bir fare modeli hastalığında serebral derin malformasyon indüksiyon gösterir ve kullanır kontrast mikro bilgisayarlı tomografi lezyon yük ölçmek için geliştirilmiş. Bu yöntem moleküler temelini ve serebral derin malformasyon için potansiyel tedaviler ve diğer serebrovasküler hastalıklar çalışmaya kurulan fare modelleri değerini artırır.

Özet

Mutasyonların CCM1 (aka KRIT1), CCM2, veya CCM3 (aka PDCD10) gene neden serebral derin malformasyon (CCM) insanlarda. Fare modelleri CCM hastalığının indüklenen tamoxifen silme postnatal hayvanlarda Ccm genlerin tarafından kurulmuştur. Bu fare modelleri moleküler mekanizması ve CCM hastalığı için tedavi yaklaşımları araştırmak için çok değerli çözümler sağlar. Lezyon yük ve ilerlemeyi değerlendirmek için doğru ve nicel bir yöntem bu hayvan modellerin tam değeri koşum için esastır. Burada, biz bir fare modeli hastalığında CCM indüksiyon göstermek ve x-ışını mikro Bilgisayarlı Tomografi (mikro-CT) yöntemi ölçü CCM lezyon yük fare beynindeki için geliştirilmiş kontrast kullanın. Doğum sonrası gün 1 (P1), Ccm2floxed alleli ayırmak için Cdh5-CreErt2 transgene Cre recombinase aktivitesinden etkinleştirmek için 4-hydroxytamoxifen (4HT) kullanılır. Fare beyin lezyonlarının CCM P8 analiz edildi. Mikro-CT için iyot dayalı Lugol'ın çözüm beyin dokusunda kontrast geliştirmek için kullanıldı. Biz tarama parametreleri en iyi duruma getirilmiş ve 9,5 µm, voxel boyutunun yaklaşık 25 µm minimum özellik boyutu için yol faydalanır. Bu çözünürlük CCM lezyon birimi ve numarasını genel olarak ve doğru bir şekilde ölçmek ve fare beynindeki CCM lezyonların yüksek kaliteli 3-b eşleme sağlamak yeterli olur. Bu yöntem moleküler temeli ve potansiyel tedaviler CCM ve diğer serebrovasküler hastalıklar için çalışmaya kurulan fare modelleri değerini artırır.

Giriş

CCM ince duvarlı, insan nüfusunun%10.5'yaygınlığı ile vasküler malformasyon beyin büyümüş. CCM nedeniyle işlev kaybı mutasyonlar birinde üç genleri dominant bozukluk olarak miras: CCM1 (aka KRIT1), CCM2ve CCM3 ( PDCD10olarak da bilinir)2,3,4 ,5,6. Bu genlerin tek bir karmaşık sinyal mevcut.

Çeşitli modelleri modeli insan CCM hastalık ve akış aşağı yolları CCM7,8,9,10için sorumludur CCM genlerin anlamak için geliştirilmiştir. En güçlü modeli yeni doğan yavrular8,10 Ccm genlerinde tamoxifen indüklenebilir Cdh5-CreERT2 , P1 ile herhangi bir koşullu olarak silmektir. Bu pups ileriye P6 beyin lezyonlarının CCM geliştirmek ve arama mekanizmaları için önceden klinik çalışmalar ve CCM hastalıkları tedavisinde terapötik ajanlar için ideal bir model olacağı tahmin ediliyor.

CCM lezyon yük fare beynindeki ölçülen öncelikle Histoloji tabanlı yöntemler tarafından son derece zaman alıcı bir yaklaşım ve araştırmacı tabi10,11,12önyargı. MRI tabanlı yöntemleri CCM lezyon yük yetişkin fare modeli9,13' te değerlendirmek için kullanılmaktadır. Ancak, son derece uzmanlaşmış küçük hayvan MRI enstrüman ve gece için birkaç saat uzun inceden inceye gözden geçirmek zaman CCM lezyonlar belirlenmesi için tatmin edici bir çözüme ulaşmak için gereklidir. Ayrıca, MRI CCM lezyonlar yenidoğan farelerde algılamak için kullanılıp kullanılamayacağı değil bildirilmiştir ve çözünürlük hassasiyeti sınırlayabilir.

Son zamanlarda bir mikro-CT teknik resim ve CCM lezyon14,15çözümlemek için geliştirdik. Bu yüksek çözünürlüklü, zaman ve maliyet-etkin yöntem önemli ölçüde mekanik ve tedavi edici çalışmalar CCM hastalığı modelinde değerini artırdı. Yumuşak doku ve fare embriyo16,17mikro-CT görüntüleme için kontrast arttırıcı, Bütün Dağı boyama yöntemleri kullanılmaktadır. Daha önce biz bir boyama Osmiyum tabanlı mikro-CT görüntüleme beyin14CCM lezyonların için kontrastı Artır için kullandık. Bu gazetede bir daha az toksik, yıkıcı olmayan-kullandık ve maliyet-etkin reaktifi tabanlı bir iyot Lugol'ın çözümü, mikro-CT görüntüleme için kontrastı artırmak için. İyot beyin diffüz ve kan18için yüksek bir yakınlık vardır.

Detaylı iletişim kuralı burada bir yenidoğan fare modeli ile birlikte görüntüleme lezyonlarının CCM indüksiyon ve CCM lezyonlar kontrast tabanlı mikro tomografi ile analizi için sunulan Bu mikro-CT tabanlı yöntem CCM lezyon birimin nicel küresel ölçüm sağlar, doğru sayı ve 3-b farenin beyin lezyonlarının CCM konumunu tanımlar ve büyük ölçüde maliyeti azaltır ve bu hayvanların fenotip için gerekli süre.

Protokol

tüm hayvan etik ve protokolleri Sydney yerel sağlık ilçe hayvan refahı Komitesi ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Tianjin Tıp Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Tüm deneyler yüzüncü Enstitüsü, University of Sydney ve Tianjin Tıp Üniversitesi yönergeleri/düzenlemeler altında yapılmıştır

1. Fare modellerinde serebral derin malformasyon indüksiyon

  1. çapraz Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl çöp ile oluşturmak için Ccm2 fl/fl ile fareler Cdh5-CreErt2; Ccm2 fl/fl (Ccm2 iECKO) pups ve littermate denetimleri (Ccm2 fl/fl). Cdh5-CreErt2 ve Ccm2 fl/fl hayvan-si olmak be önceden açıklanan 19.
  2. 4HT % 100 etanol içinde olur ve mağaza içinde 30 µL aliquots-80 ° C'de (4HT konsantrasyonu: 10 mg/mL). Kullanım günü, mısır yağı (0,5 mg/mL) bölünmemeli 4HT sulandırmak.
  3. İntragastrically 4HT 50 µL enjekte (0,5 mg/mL) için bir insülin Ģırınga kullanarak deneysel CCM lezyonlar ikna etmek için P1, Yenidoğan pups.

2. Örnek mikro-CT inceden inceye gözden geçirmek için hazırlık

  1. karbon dioksit Havasızlıktan Boğulma yoluyla P8, Yenidoğan pups ötenazi.
  2. 29'lik iğne %2 paraformaldehyde 3 mL ile PBS içinde bir 10 mL şırınga fare Kalp karıncığı ekleyerek intra kardiyak perfüzyon gerçekleştirmek.
    Dikkat: Paraformaldehyde toksik; uygun koruma giymek.
  3. Bir makas kullanarak gövdesini başından bağlantısını kesin. Bir makas kullanarak kafa derisini kaldırmak ve forseps kullanarak tüm beynini incelememize kafatası soyma.
  4. Al stereomicroscope ile beyin görüntüleri 7.82 x büyütme, 1 x kazanç, 0.6 gama ve 20 ms pozlama süresi,.
  5. Tamir disseke beyin ile %4 paraformaldehyde PBS çözümde gecede.
    Dikkat: Paraformaldehyde toksik; uygun koruma giymek.
  6. Ertesi gün hindbrains bir forseps kullanarak bağlantısını kesin ve yıkama PBS çözüm.
  7. Hindbrains içinde Lugol kuluçkaya ' s iyot çözüm için 48 h.
  8. Kuluçka kısa bir süre hava kuru aşırı Lugol kaldırmak için hindbrains ' s iyot çözüm.
  9. Lugol paketi ' s iyot lekeli hindbrains 0.65 mL microcentrifuge tüpler ve mühür ile doku büzülme ( Şekil 2 A) önlemek için tamamen plastik parafin film.
  10. 5 mL plastik tüpler ( Şekil 2 B) tarama sırasında hareket etmesini engellemek için sünger ile yer microcentrifuge tüpler.

3. Mikro-CT inceden inceye gözden geçirmek, CCM fare beyin

  1. dikey olarak mikro-CT sistemdeki bir tüp bir alüminyum kutusunda paketlenmiş arka beyin mount.
  2. 540 projeksiyonlar ve 2 s çekim hızı 50 kaynak şartlar ile tarama parametrelerini ayarlamak kV ve 10 W tomografik veri kümeleri (görüntü çözünürlüğü 9.5 mikron/piksel) elde etmek için.
  3. Üzerinden tarama ilerlemenin yeniden otomatik olarak mikro-CT sistem tarafından sağlanan donanım tabanlı projeksiyon imar yazılım tarafından 16-bit Aksiyel dilimler görüntü dizi üreten (" TXM " dosya).

4. Mikro-CT veri analizi

  1. resimle dosyasını açın (" TXM " dosyası) 3 boyutlu analiz yazılımı ve beyin kullanarak görselleştirmek " toplu oluşturma " işlev.
  2. Dönüştürmek istediğiniz yönlendirme kullanarak arka beyin " sınırlayıcı kutu " ve " kırpma uçak " fonksiyonları.
  3. Genişletilmiş Mod dönüştürülmüş görüntüyü yeniden örnekle ve Voksel boyutu korumak.
  4. Oluşturma " yeni etiket alanını düzenleyin " dönüştürülmüş görüntü (4.3) üzerinde ve sadece gri tonlama yoğunluğu kullanarak arka beyin vurgulayın.
  5. Vurgulanan alanlar ekleyin ve çalıştırın " etiket analysis " bütün arka beyin (Yani, Toplam hacim ve alan) ölçümleri elde etmek için. Ölçümler bir Excel dosyasındaki dışa.
  6. Arka beyin kullanarak görselleştirmek " isosurface işleme " işlev.
  7. Başka bir hesap oluşturun " yeni etiket alanını düzenleyin " gri tonlama yoğunluğu kullanarak lezyonlar ile dönüştürülmüş görüntü ve vurgulamak alanlarda.
  8. Vurgulanan alanlar ekleyin ve çalıştırın " etiket " lezyonları (Yani, Toplam hacim ve alan) arka beyin içinde ölçümleri elde etmek için analiz. Ölçümler bir Excel dosyasındaki dışa.
  9. Lezyonlar kullanarak görselleştirmek " yüzey oluşturmak " ve " yüzey görünümü " fonksiyonları.
  10. İstenen yönler, arka beyin görüntüleri anlık görüntü görüntü görüntüsünü veya lezyonlar, 3-D görüntüleme için bir film üretmek.

Sonuçlar

4HT P1, tek bir enjeksiyon beyincik lezyonlarının CCM ikna etmek için yeterli idi. Lugol'ın tezat iyot mikro-CT yeterince CCM lezyonlar tespit ve kendi birim ve sayı ölçmek. En iyi duruma getirilmiş mikro-CT kullanmak, biz hindbrains Ccm2iECKO farelerin lezyonlarının CCM görüntüsü. Taranan X-ray görüntüleri görselleştirme tüm lezyonların beyin parankimi farklı derinliklerde ve yönelimleri izin fare beyin 3 boyutlu görüntüleri ve değerlendirm...

Tartışmalar

CCM bireyler1ilâ % 0,5 etkiler ortak bir vasküler malformasyon var. CCM durum sporadik veya ailesel formunda oluşabilir. CCM lezyonlar beklenmedik biçimde kontur ve diğer nörolojik sonuçları neden rüptürü gibi hasta prognoz genellikle belli değildir. Şu anda, tek tedavi seçeneği cerrahi olarak yüksek riskli tarafından eşlik eder lezyonları kaldırmaktır.

İnsan CCM koşulları son zamanlarda çoğaltılamaz içinde hayvan modelleri7...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar imkanları ve Sydney mikroskobu ve Microanalysis araştırma tesisi (AMMRF) ve Avustralya Merkezi bilimsel ve teknik yardım mikroskobu & Microanalysis (ACMM) Sydney Üniversitesi için kabul edersiniz. Bu çalışmalar Avustralya Ulusal Sağlık tarafından desteklenen edildi ve tıbbi araştırma Konseyi (NHMRC) projesi 161558 ve APP1124011 (XZ) hibe.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
4-hydroxy tamoxifenSigma-AldrichH6278To activate Cdh5-CreErt2
Corn oilSigma-AldrichC8267-500MLTo dilute 4-hydroxy tamoxifen
StereomicroscopeLeicaM205FATo take macroscopic images
Lugol's Iodine solutionSigma-AldrichL6146To stain samples for contrast micro-CT
Plastic paraffin filmParafilmPM992To package samples
Micro-CTXradiaMicroXCT-400Micro-CT
3D rendering softwareFEI Visualization Science groupAvizo 3D image processing softwareTo analyse micro-CT scans

Referanslar

  1. Fischer, A., Zalvide, J., Faurobert, E., Albiges-Rizo, C., Tournier-Lasserve, E. Cerebral cavernous malformations: from CCM genes to endothelial cell homeostasis. Trends Mol Med. 19 (5), 302-308 (2013).
  2. Liquori, C. L., et al. Mutations in a gene encoding a novel protein containing a phosphotyrosine-binding domain cause type 2 cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 73 (6), 1459-1464 (2003).
  3. Laberge-le Couteulx, S., et al. Truncating mutations in CCM1, encoding KRIT1, cause hereditary cavernous angiomas. Nat Genet. 23 (2), 189-193 (1999).
  4. Sahoo, T., et al. Mutations in the gene encoding KRIT1, a Krev-1/rap1a binding protein, cause cerebral cavernous malformations (CCM1). Hum Mol Genet. 8 (12), 2325-2333 (1999).
  5. Denier, C., et al. Mutations within the MGC4607 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 74 (2), 326-337 (2004).
  6. Bergametti, F., et al. Mutations within the programmed cell death 10 gene cause cerebral cavernous malformations. Am J Hum Genet. 76 (1), 42-51 (2005).
  7. McDonald, D. A., et al. A novel mouse model of cerebral cavernous malformations based on the two-hit mutation hypothesis recapitulates the human disease. Hum Mol Genet. 20 (2), 211-222 (2011).
  8. Boulday, G., et al. Developmental timing of CCM2 loss influences cerebral cavernous malformations in mice. J Exp Med. 208 (9), 1835-1847 (2011).
  9. Chan, A. C., et al. Mutations in 2 distinct genetic pathways result in cerebral cavernous malformations in mice. J Clin Invest. 121 (5), 1871-1881 (2011).
  10. Zheng, X., et al. Cerebral cavernous malformations arise independent of the heart of glass receptor. Stroke. 45 (5), 1505-1509 (2014).
  11. McDonald, D. A., et al. Fasudil decreases lesion burden in a murine model of cerebral cavernous malformation disease. Stroke. 43 (2), 571-574 (2012).
  12. Maddaluno, L., et al. EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations. Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).
  13. Gibson, C. C., et al. Strategy for identifying repurposed drugs for the treatment of cerebral cavernous malformation. Circulation. 131 (3), 289-299 (2015).
  14. Choi, J. P., et al. Micro-CT Imaging Reveals Mekk3 Heterozygosity Prevents Cerebral Cavernous Malformations in Ccm2-Deficient Mice. PLoS One. 11 (8), 0160833 (2016).
  15. Zhou, Z., et al. Cerebral cavernous malformations arise from endothelial gain of MEKK3-KLF2/4 signalling. Nature. 532 (7597), 122-126 (2016).
  16. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiol. 9, 11 (2009).
  17. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), 61 (2006).
  18. Anderson, R., Maga, A. M. A Novel Procedure for Rapid Imaging of Adult Mouse Brains with MicroCT Using Iodine-Based Contrast. PLoS One. 10 (11), 0142974 (2015).
  19. Zheng, X., et al. Dynamic regulation of the cerebral cavernous malformation pathway controls vascular stability and growth. Dev Cell. 23 (2), 342-355 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T psay 127mikro bilgisayarl tomografiserebral derin malformasyonfare modelivask ler malformasyonCCM1 geneKrit1gene

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır