Serum ve plazma kopya sayı algılama gerçek zamanlı PCR kullanarak

Özet

Bu el yazması kopya numarası varyasyon analizi serum veya plazma DNA gerçek zamanlı PCR yaklaşımı kullanarak gerçekleştirilen açıklar. Bu yöntem için tahmin kastrasyon dayanıklı prostat kanseri hastalarda ilaç direnci uygundur, ama aynı zamanda diğer hastalıklar için bilgilendirici olabilir.

Özet

Serum ve Plazma hücre ücretsiz DNA (cfDNA) biyolojik kanser tanısı, prognoz, izleme ve tedavi direnci tahmini için bir bilgilendirici, non-invaziv kaynağı olarak gösterilmiştir. Androjen reseptör (AR) Gen kopya numarası (CN) kazanç varsayımını başlayarak sık olay metastatik kastrasyon direnç prostat kanseri (mCRPC), bu durumda cfDNA bir potansiyel akıllı biyomarker olarak analiz etmek önerdiğimiz.

Biz AR CN 2 farklı gerçek zamanlı PCR deneyleri ve 2 başvuru genler (RNaseP ve önce1) kullanarak cfDNA olarak değerlendirildi. DNA bir miktar olan 60 ng her tahlil birleşim için kullanıldı. AR CN kazanç dijital PCR daha doğru bir yöntemle doğrulandı. CN varyasyon analizi zaten tedavi direnci mCRPC ortamda tahmin için bilgilendirici olmak kanıtlanmıştır, ama aynı zamanda farklı hasta ortamlarda başka amaçlar için yararlı olabilir. CfDNA CN analiz çeşitli avantajları vardır: non-invaziv, hızlı ve gerçekleştirmek kolay ve serum veya plazma malzeme küçük bir birimden başlar.

Giriş

Hücre ücretsiz DNA (cfDNA) kan dolaşan biyolojik kanser tanısı, prognoz, izleme ve tedavi direnci^1,2tahmini için en iyi bir kaynağı olmak kanıtlanmıştır. Birçok çalışma DNA değişiklikler (mutasyonlar, kopya numarası varyasyonları, dokularda epigenetik değişiklikler) ve tümör DNA (ctDNA) dolaşan olduğunu teyit karşılık gelen plazma örnekleri¹' de bulunanlar arasında iyi bir uyum göstermiştir birincil ve metastatik tümör doku değişiklikleri³için bilgilendirici. CtDNA eğitim imkanı böylece genomik düzenlemeler ve kopya numarası varyasyonları (CNVs) belirli oncogenes⁴potansiyel metastatik klonal ve subclonal hücreleri tanımlayan, yeniden inşası için izin verir. CtDNA belirli mutasyonlar ve özel hedeflenmiş tedaviler^5,-⁶ile ilgili CNVs, limanlar gibi özellikle kanser tedavi izlemek için klinik olarak yararlı olabilir göstermiştir. Ayrıca doku biyopsisi ihtiyacını üstesinden gelir ve non-invaziv bir şekilde belirli kanser tedavisi sırasında farklı zamanlarda elde edilecek sonuçlar sağlar.

Prostat kanseri, boş hücre androjen dolaşan arasında önemli bir bağıntı ile ilgili olarak reseptör (AR) CNVs ve tedavi yanıt-e doğru abiraterone ve enzalutamide gösterilen, gösteren AR Gen kopya numarası (CN) cfDNA-ebilmek var olmak bir umut verici biyomarker tedavi direnci^7,8,9,10,11tahmin yeteneğine sahip. CNVs ctDNA belirli genlerin değerlendirilen farklı duyarlılık, maliyet ve hız ile farklı yaklaşımlar kullanarak (örn. gerçek zamanlı, dijital PCR ve sonraki nesil sıralama).

Burada serum ve plazma örnekleri^7,8cfDNA AR CN değerlendirmek için gerçek zamanlı PCR teknolojisinde çift yönlü deneyleri temel basit ve hızlı bir yaklaşım açıklar. Biz iki farklı genomik Berisi Bölgeler Klasiği intron 5 AR (Xq12) ve iki diğer genler, prostat kanseri (RNaseP, normal kopya numarası durumundaki bilinen iç standart referans genler olarak tasarlanmış iki farklı PCR deneyleri kabul 14q11 üzerinde bulunan; 1'de yer alan önce1, p 34). Biz bir duyarlık ve sonuçları duyarlılığını artırmak için yerine, iki referans genler seçildi. Bir DNA miktar olan 60 ng her tahlil birleşimi (kombine tahlil ve AR-assay_2 + AGO1 AR-assay_1 + RNaseP için) için güçlendirilmiş. Sağlıklı erkek üç serum veya plazma DNA örnekleri havuza alınmış ve bir Kalibratör kullanılır. Biz cutoffs, kabul > AR kazanç için 1.5 ve < 0,5 silinmek. Bu yöntemin ana avantajlarından biri bu esnek ve diğer genler Ayrıca, standart iç başvuru genler, tümör tipi ve özellikleri temelinde değiştirme değerlendirilebilir olduğunu olmasıdır.

Protokol

DNA izolasyonu kopya numara analiz için gerçek zamanlı PCR gerçekleştirmek için serum veya plazma numuneleri, protokol oluşur. DNA ekstraksiyon, DNA miktar denetimi (Spektrofotometre) ve gerçek zamanlı PCR belirli hedefleri için yapıldı. Şekil 1' de, zaman çizgisi ve yordamlar bir özetini bildirilir.

Protokol IRST insan araştırma Etik Komitesi kuralları izler.

1. serum toplama ve işleme

1. Yaklaşık 5 mL tam kan serum elde etmek için antikoagülan olmadan bir serum tüp toplamak. Kan tüpleri 4 ° C'de işleme kadar korumak.
2. Santrifüj tüpleri, 1000 x g 4 ° C'de 15 dakika
3. Dikkatle serum 2 mL tüpler içine aktarın.
4. Toplama tüp atmak ve hemen süpernatant-80 ° c kadar kullanmak dondurma.

2. plazma toplama ve işleme

1. Yaklaşık 10 mL tam kan plazma elde etmek için EDTA ile plazma tüp içinde toplamak. Tüp tamamen doldurmak ve sonra 8 kere tersine çevirin. Kan tüpleri 4 ° C'de işleme kadar korumak.
2. Tüp 1800 x g oda sıcaklığında 15 dakika santrifüj hiçbir fren ayarı ile santrifüj kapasitesi.
3. Dikkatle plazma üst kısmındaki 2 mL tüpler içine aktarın. En az 1 mL süpernatant beyaz hücre katmanı üzerinde bırakarak transferi, tekrarlayın.
   Not: üst kısmındaki süpernatant aktarma hücreleri veya hücre artıkları bulaşma riskini azaltır.
4. Toplama tüp atmak ve hemen süpernatant-80 ° c kadar kullanmak dondurma.

3. Serum veya plazma DNA izolasyonu

Not: Aşağıdaki adımlarda modifiye ticari iletişim kuralını kullanarak serum veya plazma DNA izolasyonu uygulanmalıdır.

1. (0,5 2 mL içeren) bir aliquot serum veya plazma oda sıcaklığında erimek.
2. Girdap ve örnek mix ve 0.5 mL serum veya plazma net 1.5 mL tüp içine aktarın. Geri kalan malzeme-80 ° C'de dondurmak
3. 50 µL İndinavir k (20 mg/mL) doğrudan örneğine ekleyin.
4. 0.5 mL lizis arabelleği için örnek ve de pipetting tarafından karıştırın.
5. Tüpler kapatın ve örnekleri 56 ° c ısı blok 15 dk için kuluçkaya.
6. % 100 etanol belirtilmiş miktarı yıkama arabellek 1 ve 2, üreticinin yönergelerini tarafından belirtildiği şekilde eklenir.
7. Örnekleri geri oda sıcaklığına getirmek ve mutlak etanol 0.5 mL ve de pipetting tarafından karıştırın.
8. 650 µL adım 3.7 ayrılık sütun ve 1 dk. için 6.000 x g, santrifüj elde karışımı ekleyin.
9. Aracılığıyla akış içeren tüp atın ve sütun yeni bir temiz toplama tüp yerleştirin. Adım 3.8 ve 3,9 bir kez daha yineleyin.
10. 500 µL yıkama tampon 1, sütun ve 1 dk. için 6.000 x g, santrifüj kenarında ıslatmadan ekleyin.
11. Aracılığıyla akış içeren tüp atın ve eski yerine koymak o ile yeni bir temiz toplama tüp.
12. 500 µL yıkama tampon 2, sütun ve 3 dak için tam hızda (20.000 x g) santrifüj kenarında ıslatmadan ekleyin.
13. Aracılığıyla akış içeren tüp atın ve eski yerine koymak o ile yeni bir temiz toplama tüp.
14. Herhangi bir kalıntı çamaşır arabellek kaldırmak için 3 dakika için tam hızda (20.000 x g) santrifüj kapasitesi.
15. Sütun bir temiz 1.5 mL tüp içine yerleştirin. 150 µL elüsyon arabelleği ekleyin ve bu arabellek sütun ıslatıyor emin olmak için 7 dk. bekleyin.
16. 1 dk. için 8000 x g de santrifüj kapasitesi.
17. Elute DNA'ın en büyük kurtarma sağlamak 1 dk için tekrar aynı sütun ve santrifüj tam hızda (20.000 x g) içine 3,16 adım pipette.

4. DNA miktar ve seyreltme

1. Miktar DNA bir Spektrofotometre kullanarak gerçekleştirin. Örnek 2 µL tezgah üstü Spektrofotometre başına üreticinin yönergelerini kullanın.
   Not: Eğer DNA miktar gerçek zamanlı PCR ile devam etmek yeterli değildir (en az 120 ng), yeni bir DNA izolasyon işlemi gerçekleştirin.
2. DNA için son hacim (yaklaşık 50 µL) tüm gerçek zamanlı PCR yeterli 2.5 ng/µL serum veya plazma sulandırmak.

5. gerçek zamanlı PCR

1. Tezcan kopya numarası deneyleri, referans gen tahlil, seyreltilmiş DNA örnekleri ve buzun içinde havuzlu KALİBRATÖRLER. Oda sıcaklığında 4 ° C'de depolanan ana mix equilibrate
2. Hedef tahlil, referans gen testin 1 µL ve ana Mix 10 µL 1 µL karışımı her örnek ve KALİBRATÖRLER havuzlu 3 çoğaltır için hazırlar. Negatif kontrol (su) ve 2 ilave örnekler de dahil olmak üzere karışımı hazırlayın.
3. 96'plaka, aliquot 12 µL her kuyuya karışımı iyi. Pipet ya da spin tüpleri var.
4. Her DNA örneği ve her kuyuya havuzlu KALİBRATÖRLER 8 µL (2.5 ng/µL konsantrasyon) ekleyin. Pipet ya da spin tüpleri var. Her şey için belgili tanımlık uç değiştirin.
   Not: 96-şey plaka kullanarak gerçek zamanlı her deneme için 30 DNA örnekleri işlenebilir: 30 x 3 örnekleri + 1 x 3 KALİBRATÖRLER havuza alınan + negatif kontrol 94 =.
5. Kısaca spin plaka 1000 x g de aşağı.
6. Aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak plakayı araştırmanı: 40 devredir 15 95 ° C'de 10 dakika, 95 ° C'de sahne tutun s ve 60 ° C için 1 dakika.

6. veri analizi ve yorumu

1. Amplifikasyon arsa sonuçları altındaki "seçeneği" bölümünde, analiz ilk hedef gen için 0.2 Ct eşik ayarlayın. Kümedeki her hedef veya başvuru genler için yineleyin. .Txt uzantısı gerçek zamanlı PCR dosyasında dışa aktarmak için araç çubuğu'na "Dışa Aktar" tuşuna basın. Sadece "sonuçlar" Seç bayrak → verilecek veriyi uzantısı .txt → basın "start verme" → yakın dosya türü olarak verme aracını seçin.
2. Analiz yazılımı açın ve dosyayı .txt (araç çubuğu → alma) alın.
3. Analiz ve araç çubuğu (oyun sembol) tarafından analiz ayarı seçmek için dosya adını seçin.
4. Kalibratör örnek ve hedef (Örneğin, 1 AR gen için kopya) kopya bilinen sayısını belirtin. Basın "uygulanır."
5. Her örnek için farklı delta Ct (ΔCt) ile karşılaştırıldığında diğer wells ile bir şey atlayın.
6. Deney (basın oyun sembol) yeniden çözümle.
7. Arsa veya tablo bar kopya sayısıyla sonuçlarını değerlendirmek.
   Not: Güven, Z-score ve sonuçları yorumlama için yararlı olabilir analiz çoğaltır gibi çok sayıda parametre sonuçları tablo içerir.

Sonuçlar

Toplam cfDNA konsantrasyonu ölçülebilir spectrophotometry için tüm örneklerini analiz, 6,12 ng/µL sayılarının gösterilen tarafından (aralığı: 2,00-23.71 ng/µL) serum örnekleri ve 3.21 ng/µL ortancası (aralığı: 2.31 8,49 ng/µL) plazma numuneleri için. Gerçek zamanlı PCR deneyler tarafından Toplam 115 örnekleri analiz ettik.

Test duyarlılık ARve DNA için yüksek veya düşük kazancı da Kal...

Tartışmalar

AR Serum ve plazma örnek analizde CN stratifikasyon kastrasyon dayanıklı prostat kanseri (CRPC) hastaların için yeni, non-invaziv bir yaklaşım temsil eder. Son zamanlarda AR CN abiraterone ve enzalutamide, tedavi öncesi ve sonrası kemoterapi^7,8,9,10CRPC hastalarda sonuçlar tahmin etmek mümkün olduğunu kanıtlanmıştır.

Bizim yaklaşı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Vacutainer Serum Tubes	Becton Dickinson	367814	whole blood tube for serum
BD Vacutainer EDTA Tubes	Becton Dickinson	366643	whole blood tube for plasma
Ethanol absolute	VWR		the user could use also other companies
TaqMan Copy Number assay	Thermo Fisher Scientific	4400291	Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283
TaqMan Copy Number assay (modified)	Thermo Fisher Scientific	4467084	Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn
TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P	Thermo Fisher Scientific	4403326
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4326708	Master mix for Real Time PCR
QIAamp DNA Mini Kit (50)	Qiagen	51304	DNA extraction kit
MicroAmp 96-Well Plates	Thermo Fisher Scientific	N8010560	plates for realt time PCR
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	-	the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA
7500 Fast Real-Time PCR System	Applied Biosystem	-	the user could use also other real time instrument
CopyCaller Software	Applied Biosystem	-	Software for copy number analysis