Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

Özet

Bu iletişim kuralı hücreleri hücre microenvironment koruma sırasında bir üç boyutlu ortamda göç ve işgal yeteneklerini ölçmek için kullanılabilir bir ters dikey işgali tahlil açıklar. Bu tahlil nadir ve/veya hassas hücreler için uygundur.

Özet

3D işgali deneyleri geliştirilmiştir rağmen onların microenvironment bütünlüğünü etkilemeden hücreleri çalışmaya meydan kalır. Boyden odası gerektiren hücreleri özgün kültür konumdan yerlerinden ve yeni bir ortama taşınmış gibi geleneksel 3D deneyleri. Sadece bu microenvironment için içsel hücresel süreçler bozmak yok, ama bu kez bir hücre kaybolmasına neden. Bu nadir, ya da onların microenvironment için son derece hassas hücreler ile ilgili özellikle zorlu sorunlardır. Burada, her iki endişelerini önler bir 3D işgali tahlil gelişimi açıklayın. Bu tahlil, hücreler de içinde küçük bir kaplama ve bir chemoattractant içeren bir ECM Matris hücreleri koydu. Bu herhangi bir hücre öteleme gerektirir ve hücreleri matrisin yukarı doğru istila sağlar. Bu tahlil, hücre işgali gibi hücre morfolojisi kollajen jel içinde değerlendirilebilir. Bu tahlil kullanarak, nadir ve hassas hücreler invaziv kapasitesini karakterize; füzyon meme kanseri hücreleri MCF7 ve Mezenkimal/multipotent arasında ortaya çıkan melez hücreleri (MSCs) kök/stroma hücreleri.

Giriş

Hücre hareketliliği hücreleri bir normal gelişim ve fizyolojik süreçtir. Ancak, değişiklikleri desen ve üretilen hücre göç ve istila için inflamatuar hastalıkları ve kanser metastaz^1,2,3gibi patolojik koşullarla ilişkilidir. Metastaz tartışmalı Kanserinde en kötü anlaşılır yönüdür. Metastaz için kanser hücrelerinin ekstra hücresel matris (ECM) aşağılamak, yerel doku ve intravasate istila. Bir kez dolaşımda, kanser hücrelerinin uzak siteye yaymak, extravasate ve ikincil tümörler oluşturur. Bu nedenle, yetenek hücreleri ECM aşağılamak için göç ve istila metastatik potansiyellerini ilgilidir. Çözümlemek ve hücrelerin göç ve işgal yeteneklerini ölçmek için farklı yaklaşımlar geliştirilmiştir. En çok kullanılan yaklaşımlar tahlil, hızlandırılmış mikroskobu ve Boyden odası tahlil şifa yara içerir. Yara iyileşme tahlil⁴ ve zaman atlamalı mikroskobu hücre göç içine ön fikir verecek basit ve kolay deneyleri var. Ancak, her iki hücre içinde vivovar 3D çevre yansıtmıyor 2D deneyleri vardır. Hücreleri farklı bir 2D bir^5,-⁶karşılaştırıldığında 3D ortamına yanıt çalışmalar göstermiştir. Ayrıca, yara iyileştirici deneyleri çoğaltmak ve nicel sonuçları^7,8,9verim için zordur. Tahlil şifa yara 3D bir değişiklik olduğunu, hücre dışlama bölgesi tahlil daha fizyolojik ilgili bir tahlil ama hücre içinde sayı hücre füzyon olaylar^{10,11 kaynaklanan hibrit hücreler gibi düşük için uygun değil} .

Boyden odası tahlil için hücresel çalışmalar ilgili microenvironments sağlar 3 boyutlu bir tahlil olduğunu. Ancak, hücrelerin kendi özgün microenvironment kaldırılacak ve geçirmek ve aşağıya doğru chemoattractant içeren orta istila Boyden tahlil sisteminin üst odaya yatırılması için gerekli. Bu 3D yaklaşım onların microenvironment ve/veya sınırlı sayı^10,11,12güvenlik açığı bulunan hücrelerin göç ve işgal yeteneği analiz uygun değildir. Hücre göç ve işgal çözümlemek için yeni bir yaklaşım mikrosıvısal degrade odası tahlil¹³yaşında. Her ne kadar uygun ve güvenilir geçiş ve işgal çalışmaları, bu tahlil daha pahalı ve teknik olarak tipik bir laboratuvar için zor olabilir. Biz burada hücreleri için onların microenvironment duyarlı da dahil olmak üzere birçok hücre tipleri ile uyumlu ve/veya sınırlı sayıda bir basit ters dikey işgali tahlil tanımlamak. Bu tahlil Hooper ve ark. tarafından önerilen iletişim kuralından adapte oldu ¹⁴. bu tahlil, hücreleri kendi özgün microenvironment ve onların geçiş kalır ve işgal chemoattractant¹¹içeren kollajen jel içinde yukarı doğru ilerlerken izlenir. Bu tahlil tekrarlanabilir ve yapılmış en iyi duruma getirilmiş ve 35 mm kültür tabakta doğrulanmış. Farklı hücre kültür boyutları, farklı matrisler veya gücü yapışma ve farklı chemoattractants de dahil olmak üzere farklı tahlil şartlarına adapte. Bu tahlil ilaç bulma işleminin başlangıç tarama için bir vitro platform olarak hizmet verebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Not: Bu protokol McArdle vd. anlatılan ¹¹. bir zaman çizelgesi şekil 1' de verilmiştir.

1. kültür plaka hazırlanması

1. Bir 10 mm cam alt 1 mL 1 M hidroklorik asit (HCl) ile iyi 15dk için cam alt hydrophobicity alt içeren 35-mm kültür bulaşık yıka.
2. Kültür plaka fosfat tampon salin (PBS) tüm HCl kurtulmak için 1 mL ile iki kez yıkayın.
3. Kültür plaka 1 mL % 70 etanol ile iki kez yıkayın.
4. Hücre belirli kültür orta 1 mL ile kültür plaka durulama (burada, kullanım α-MEM % 10 ısı ile desteklenmiş FBS ve % 1 esansiyel olmayan amino asitler inaktive olur).
   Not: Kültür ortamı içeren tedavi kültür plaka CO₂ kuluçka 37 ° C'de bir nemlendirici ile ertesi güne kadar saklanabilir.
5. (MSCs ve MCF-7 ortak kültür) hücreleri tedavi cam-alt içinde de 35 mm kültür çanak % 100 confluency için büyümek. 35.000 MSC hücreleri ve 75.000 MCF7 hücre 24 h için ortak kültür.

2. kollajen jel hazırlanması

1. Kollajen temas üzerine polimerizasyon önlemek için kollajen jel dondurucuya pipetting için kullanılan micropipette ipuçları saklayın.
   Not: Bu en önemli adımdır.
2. Bir birim belirlemek sıçan kuyruk kollajen ben kullanılmak üzere kollajen hisse senedi toplama üzerinde tabanlı. Kollajen jel 100 µL bu tahlil için hazırlayın.
   Not: Ben stok sıçan kuyruk kollajen yüksek yoğunlukta daha iyi çalışır. 10 x kollajen buna göre sulandırmak için kullanılmak üzere Dulbecco'nın modifiye kartal orta hacmi belirlemek.
3. Birleştirmek buz sıçan kuyruk kollajen üzerinde ben (3.8 µg/mL hisse senedi), 10 x Dulbecco'nın modifiye kartal orta ve 1 x hücre kültür % 2 fetal sığır serum ve kollajen 2.4 mg/ml nihai bir konsantrasyon için uygun chemoattractant ile takıma orta boy.
4. Kollajen jel nötralize etmek için sodyum bikarbonat çözüm karışımı %4,5 ekleyin.
   Not: Sodyum bikarbonat çözüm eklendi hacmi diğer reaktifleri tam pH göre değişebilir. Bu karışımı tarafsız çözüm sağlamak veya bir pH göstergesi kültür ortamında kullanmak için pH şeritler ile test etmek en iyisidir.
5. 80 µL kollajen karışımı cam-alt de kültür çanak içindeki hücreleri üzerinde yatıyordu.
6. Kollajen jel 30 dk 37 ° C'de bir nemlendirici ile CO₂ kuluçka için polimerize izin
7. Kollajen jel hücre orta düşük serum (% 2) ile 2 mL ile kapak ve CO₂ kuluçka bir nemlendirici ile 24, 48 veya 72 h 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
   Uyarı: Plaka cam alttan ayırma kollajen jel önlemek için itina ile ele alınmalıdır.

3. hazırlık kollajen örneği jel 3.8 µg /mL bir sıçan kuyruk kollajen stokunun kullanarak

1. Buz üzerinde birleştirmek 114.5 µL sıçan kuyruk kollajen, 10 DMEM x 16,6 µL ve kültür chemoattractant içeren orta 33.1 µL.
2. Kollajen karışımı sodyum bikarbonat 14,0 µL ile etkisiz hale getirin.
3. Adım 2,5 olduğu gibi devam edin.

4. hücreleri görüntüleme

1. Yavaşça medya çanak çıkarın.
2. Yavaşça jel PBS 1 mL ile yıkayın.
3. %4 paraformaldehyde 15dk için 1 mL ile hücreleri tamir.
4. Hücreleri iki kez PBS 1 mL ile yıkayın.
5. DAPI çözüm (100 ng/mL) oda sıcaklığında 20 dk için hücrelerle leke.
6. Hücreleri farklı yerlerde confocal bir mikroskop kullanarak ve 400 µm z-yığın görüntüleri her iki yerde de 16 µm adımları alarak görüntü. Kullanılan mikroskop kullanarak bir beyaz ışık, ark uyarma kaynak confocal görüntüleme sağlar birim tarama bir diski var. 0,75 sayısal diyafram ile kullanılan bir 20 X lens kullanabilirsiniz.
7. Görüntüleri yeniden oluşturma.
   1. Görüntüler için verilen jel (yaklaşık 25 resim) açın ve görüntü → yığınları → görüntüler yığmak için tıklatarak görüntü yığını oluşturun. İlk görüntü jel altına denk (z = 0 µm), z yönde ilk adım için ikinci görüntü denk (z = 16 µm), üçüncü resim z yönünde ikinci adımına tekabül (z 32 µm =). Her çekirdek her görüntü derinlikte değerlendirmek ve hangi keskin odak olarak işgal derinliği belirli hücre için çekirdek yapıldı derinliği belirleyebilirsiniz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Biz-si olmak kullanılmış bir 35 mm kültür yemek bir cam alt ve sıçan kuyruk kollajen ile ben geliştirmek ve vitro 3D istila en iyi duruma getirmek için tahlil protokolü. Bu tahlil, bu meme kanseri hücreleri MCF7 ve MSC gösterdik kullanarak hücreleri kollajen jel 0,04 ± 1.8 µm ve 41,3 ± 76.0 µm ortalama bir mesafe içine sırasıyla 48 saat sonra işgal ne zaman IGF1 (18,6 ng/mL) chemoattractant (Şekil 2) kullanılmıştır. Daha da ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada, nadir ve/veya onların microenvironment bağımlı olan hücreleri de dahil olmak üzere hücre türü için uygun olan bir basit ters dikey işgali tahlil açıklayın. Bu 3D işgali tahlil hücreler içinde onların orijinal microenvironment kalır ve bir chemoattractant içeren kollajen jel tarafından karşılanmaktadır. Hücreler göç ve kollajen istila. Bu tahlil, hücreler lekeli ve kolayca jel içinde izlenir. Basitlik ve tekrarlanabilirlik Bu testin bir 3D sisteminde kanser hücre göç ve işgali içi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
MatTek P35G-1.5-10C	MatTek Corporation, Ashland, MA	P35G-1.5-10-C	mattek glass bottom dishes
Rat tail collagen I	Corning, Corning, NY, USA	354236	Collagen gel
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA	H1758	HCl
Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA	10010023	PBS
10X Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA	D2429	10X DMEM
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178 USA	S5761	NaHCO3
Confocal Fluorescent microscope	Olympus America, Center Valley, PA, USA	Olympus IX81	Confocal  microscope
Defined Fetal Bovine Serum	GE Healthcare Life Sciences HyClone Laboratories, Utah, USA	SH30070.03	FBS
Ti:Sapphire multi-photon laser scanning microscope	Prarie Technologies, Sioux Falls, SD, USA	40x NA 0.8 objective	MPLSM
Imaris software	Bitplane Inc. Zurich, CH	Imaris 7.5.2	Imaris software
DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA	D9542	DAPI
Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific Inc., Whaltham, MA, USA	50980487	PFA
α-minimum essential medium	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63178, USA	M0894
MDA-MB-231	ATCC; Manassas, VA, USA	HBT-22
MSC	Trivedi and Hematti, 2007
20X lens UPLAPO	Olympus America, Center Valley, PA, USA	36-064	Olympus UPLSAPO 20X Objective