JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu el yazması bir iletişim kuralı tarafından γH2AX ve 53BP1 ayirt mikroskobu DNA çift iplikli kırılmalara analiz için sağlar.

Özet

DNA çift iplikli kırılmalara (DSB) ciddi DNA lezyonlardir. Oluşumu ve DSB tamiri analizi araştırma alanlarına genom bütünlük, genotoxicity, radyasyon biyolojisi, yaşlanma, kanser ve ilaç geliştirme de dahil olmak üzere geniş bir yelpazede uygun olur. DSB yanıt olarak, Histon H2AX serin 139 ayrı nükleer foci tespit şekillendirme birkaç megabase çiftleri bir bölgede, ayirt mikroskobu tarafından fosforile. Buna ek olarak, 53BP1 (p53 bağlayıcı protein 1) başka bir önemli DSB-duyarlı protein DSB tamiri katılarak nonhomologous sonu-homolog rekombinasyon önlenmesi ise teşvik olduğunu. ΓH2AX ve 53BP1 belirli fonksiyonları göre γH2AX ve 53BP1 ayirt mikroskobu ile kombine analizi DSB ayrıntılı bir analiz için makul bir yaklaşım olabilir. Bu el yazması teknik gerçekleştirmek için metodik notları ile desteklenmiş bir adım adım iletişim kuralı sağlar. Özellikle, hücre döngüsünün etkisi γH2AX foci örgülerine hücre kültürünü NHDF normal fibroblastlar içinde gösterilmiştir. Ayrıca, γH2AX resimde değeri bir biyomarker olarak sağlıklı bir bireyin ışınlanmış x-ray lenfosit tasvir edilir. Son olarak, genetik istikrarsızlık tarafından γH2AX ve 53BP1 ayirt mikroskobu hücrelerdeki CD34 + olan bir hastanın akut myeloid lösemi soruşturma.

Giriş

DNA sürekli zarar görmüş endojen tarafından (örneğin, çoğaltma stres, Reaktif oksijen türleri, DNA'ın iç istikrarsızlık) ve eksojen (örneğin, kimyasal radikaller, ışınlama) (Resim 1)1,2 kaynakları ,3,4. DNA hasarı arasında DNA çift iplikli kırılmalara (DSB) özellikle ciddi lezyonlardir ve hücre ölümü veya karsinojenezis neden olabilir. Yaklaşık 50 DSB hücre ve hücre döngüsü5başına ortaya çıkabilir. Memeli hücrelerinde homolog rekombinasyon (İK) ve nonhomologous sonu-katılma (NHEJ) DSB (Şekil 2) tamiri için büyük yollar olarak geliştirilmiştir. Saat geç S/G2 aşamasında oluşur ve sağlam bir kız kardeşi kullanır Kromatit potansiyel olarak hatasız onarım için bir şablon olarak. Baz çifti eklendiğinde veya kırık uçları ligasyonu önce rezeke karşılık, hücre döngüsü boyunca aktif ve potansiyel olarak mutajenik NHEJ. Buna ek olarak, alternatif son katılma NHEJ eksikliği6,7durumunda yavaş mutajenik yedekleme onarım mekanizması olarak meşgul olabilir.

DSB fosforilasyon Histon H2AX serin 139 birkaç megabase çiftleri her DSB çevresinde bir bölgede, bir neden. Şekillendirme nükleer resimde γH2AX foci adlı ve ayirt mikroskobu8tarafından algılanabilir. ΓH2AX daha fazla DSB-duyarlı protein alımı teşvik ve Kromatin remodeling, DNA tamiri ve sinyal iletim9ilgilenmektedir. Her γH2AX odak tek bir DSB temsil etmek için kabul edilir gibi DSB miktar ayirt mikroskobu tarafından hangi kanser hücre satırları ve hasta örnekleri10,11, göstermiş olduğu, mümkün 12 , 13 , 14. 53BP1 (p53 bağlayıcı protein 1) DSB onarım arabuluculuk içinde başka bir anahtar protein olduğunu. DSB-duyarlı proteinler, denetim noktası sinyal ve DSB biter15synapsis istihdamı ilgilenmektedir. Buna ek olarak, 53BP1 DSB onarım yolu seçiminde kritik bir rol oynamaktadır. İK EngellediBRÜKSEL16iken NHEJ doğru DSB tamiri tetikler. ΓH2AX ve 53BP1 DSB tamir hakiki fonksiyonları göz önüne alındığında, γH2AX ve 53BP1 ayirt mikroskobu tarafından eş zamanlı analiz oluşumu ve DSB tamiri kesin çözümleme için yararlı bir yöntem olabilir.

Bu el yazması ayirt mikroskobu, γH2AX ve 53BP1 hücre çekirdeği içinde gerçekleştirmek için adım adım bir protokol sağlar. Özellikle, teknik hücre kültürünü NHDF, x-ışını ışınlanmış lenfositler sağlıklı bir bireyin ve CD34 + bir hastada akut myeloid lösemi hücrelerinin normal fibroblastlar uygulanır. Yöntem ayrıntıları sunulan sonuçları bağlamında dikkat çekti.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada Heidelberg Üniversitesi Tıp Fakültesi Mannheim Etik Komitesi II tarafından onaylanmıştır. Aydınlatılmış onam tüm bireyler elde edilen yazılı.

1. hazırlık malzemeleri

  1. antikoagülan hisse senedi çözüm: mL % 0,9 Sodyum Klorür başına 200 IU heparin bir antikoagülan hisse senedi çözüm hazırlamak. Her koleksiyon tüpleri doldurun (birim çizmek 9 mL) 2 mL kan veya kemik iliği örnekleri geri çekilmesi önce antikoagülan stok çözeltisi ile.
  2. Lizis çözüm kırmızı hücreleri için: hazırla 10 x kırmızı hücreleri 82.91 g amonyum klorür, 7,91 g amonyum bikarbonat ve 2 mL ajanları eriterek tarafından 8,0 pH için 0, 5 M ethylenediaminetetraacetic asit çözeltisi ile lizis çözüm Çift distile su için toplam hacmi 1 L.
  3. Fiksasyon çözüm: ekleyin 8.3 µL 360 mg paraformaldehyde (PFA) bir microtiter tüp bir 1 M potasyum hidroksit çözüm. Tüp, tüp ve ısı Isıtma blok 95 ° C'de 1 mL % 36 PFA çözeltisi almak için tüpe 1 mL işaretine fosfat tamponlu tuz (PBS) ile doldurun. 1 mL % 36 PFA çözüm 15 mL kapasiteli bir tüp aktarın. 8 mL PBS 9 mL % 4 İngiltere'de yılın stok çözeltisi almak için 1 mL % 36 PFA, ekleyin. Aliquot % 4 İngiltere'de yılın hisse senedi çözüm ve mağaza-18 ° c kadar kullanmak için hücrelerin fiksasyon.
    Dikkat: 1) potasyum hidroksit aşındırıcı bir çözümdür. Göz ve deri korunması unutmayın. 2) İngiltere'de yılın kanserojen. Ciltle temas ve inhalasyon kaçının. Bir başlık altında fiksasyon çözüm hazırlayın.
  4. Permeabilization çözüm: ekleyin 50 µL Octoxinol 9-50 mL PBS yaklaşık % 0.1 bir çözüm elde etmek için Octoxinol 9.
  5. Çözüm engelleme: hazırlamak % 5 ve 6'protein engelleme aracı PBS ve mağaza ile karıştırılarak çözümleri engelleme % 2 – 8 ° C.

2. Örnekleri hazırlanması

  1. fibroblast hücre kültüründe: insan fibroblast hücre satırının NHDF oksijen %5 yetiştirmek CO 2 atmosfer RPMI 1640 orta % 10 fetal buzağı serum, 4 mM ile desteklenmiş olarak 37 ° C'de glutamin ve % 1 penisilin/streptomisin.
    1. Bir mikroskop slayt hazırlanması ile yapışık fibroblastlar
      1. Orta NHDF fibroblastlar katlanarak büyüyen ile şişeye (75 cm 2 büyüme alanı) kaldırın. 10 mL PBS şişesi için ekleyin. Yapisan fibroblastlar hafifçe el ile 1 dk. şişeye sallayarak yıkama
      2. PBS kaldırın ve 1 mL tripsin balonun ekleyin. Yavaşça tüm yapışık hücreleri tripsin tarafından karşılanmaktadır sağlamak için balonun sallamak. Tripsin balonun kaldırın. 37 5 min için kuluçka şişeye koyun ° C.
      3. Kuluçka makinesi dışında şişesi alıp 10 mL RPMI 1640 orta balonun ekleyin. Yukarı ve aşağı fibroblastlar dağıtmak için birkaç kez orta pipette.
      4. Her iki alanın mikroskop slaydın üzerine dağınık fibroblastlar 0.3 mL pipet ve böylece fibroblastlar slayt için uygun kuluçka makinesi 24 h için slayt koymak. Adıma 3.1 için immunostaining γH2AX ve 53BP1 fibroblastlar çekirdekleri içinde geçin.
  2. Hasta numuneleri
    1. kan örnekleri: 2 mL antikoagülan stok çözeltisi ile doluydu koleksiyonu tüpler kullanıp 7 mL kan tüpler içine ekleyebilirsiniz. Örnekleri gecede oda sıcaklığında (Yani, 18-20 ° C) depolar. Ertesi gün, mononükleer hücreler tarafından yoğunluk gradient Santrifüjü (Adım 2.2.3) dinlenme G0/G1 evresi yalıtmak.
    2. Kemik iliği örnekleri: 2 mL antikoagülan stok çözeltisi (Adım 1.1) ile doluydu koleksiyonu tüpler kullanıp 7 mL kemik iliği tüpler içine ekleyebilirsiniz. Örnekleri gecede oda sıcaklığında (Yani, 18-20 ° C) depolar. Ertesi gün, mononükleer hücreler tarafından yoğunluk gradient Santrifüjü (Adım 2.2.3) dinlenme G0/G1 evresi yalıtmak. CD34 lastikteki kullanma ve ayırma sütunlar için yalıtım CD34 + hücre hücre.
    3. Yalıtım mononükleer hücre yoğunluğu degrade Santrifüjü tarafından
      Not: Mononükleer hücreler kemik iliği örnekleri ve kan yoğunluk gradient Santrifüjü 17 , 18 , 19 tarafından izole edilmiştir.
      1. Dilute PBS ile 1:1 oranında heparinized kan örneğinde ve oranı 1:3 PBS ile heparinized kemik iliği örneği. Hücreleri nazikçe onları iki kez girip pipet çizerek askıya alma.
      2. Yoğunluğu degrade orta hacmi için taze bir tüp ekleyin. Yavaşça seyreltilmiş kan veya kemik iliği üzerine yoğunluk gradient orta katman. İki kat karıştırmak için değil dikkat.
      3. Tüp, oda sıcaklığında 30 dakika santrifüj kapasitesi ve 400 x g. uzaklaştırmak üst plazma katmanın pipet ile. O zaman dikkatle üzerinde yoğunluk gradient orta katman mononükleer hücrelerde hasat. Mononükleer hücreler taze bir tüpün içine transfer.
      4. Tüp mononükleer hücrelerde en az üç PBS hacimleri ekleyin. Hücreleri nazikçe onları iki kez girip pipet çizerek askıya alma. Tüp için oda sıcaklığında ve 400 x g. 10 dk santrifüj kapasitesi
      5. Sonra spin süpernatant kaldırmak ve 4 ° C, 1 kırmızı hücreleri için lizis çözüm x 10 mL ekleyin. Hücreleri nazikçe onları iki kez girip pipet çizerek resuspend ve 5 min için buz tüpü yerleştirin. Daha sonra 4 ° C'de 30 mL PBS ekleyin ve 10 dakika oda sıcaklığında ve 400 x g. tüp santrifüj kapasitesi
    4. Cytospins hazırlanması
      1. (Yani, γH2AX ayirt boyama için bir cytospin ve γH2AX ve 53BP1 için bir cytospin hasta örnekleri mononükleer hücreler ile iki cytospins hazırlamak ayirt boyama kombine) tarafından Santrifüjü (300 x g, 10 dk) 1.0 x 10 5 hücreler için her hazırlık ( şekil 3 ve 4).

3. γH2AX ve 53BP1 ayirt boyama

  1. fiksasyon ve permeabilization: %4 200 µL ile hücreleri tamir PFA 10 dk için. Fiksasyon sonra hücreleri nazikçe üç kez PBS 30 mL bir laboratuvar shaker üzerinde her 5 min için yıkayın. Hücreleri permeabilize %0,1 200 µL ile Octoxinol 9 10 dakika süreyle yıkayın hücreleri nazikçe bir laboratuvar shaker üzerinde her 5 min için 30 mL % 5 engelleme çözeltisi ile üç kez. 30 mL taze %5 1 h. için çözüm engelleme hücrelerde blok
  2. Kuluçka antikorlar ile
    1. kuluçkaya bir fare monoklonal anti-γH2AX antikor (1:500) içeren hücrelerin bir hazırlık ve hücreleri bir fare monoklonal anti-γH2AX antikor (1:500) ile diğer hazırlanması ve bir poliklonal tavşan anti-53BP1 antikor (1:500) bir gecede, 4 ° C.
    2. Kuluçka yıkadıktan sonra hücreleri nazikçe bir laboratuvar shaker üzerinde her 5 min için 30 mL % 2 engelleme çözeltisi ile 3 kez.
    3. Engelleme çözümü kaldırmak ve bir Alexa488 Birleşik keçi Anti-fare ikincil antikor (1:500) içeren hücrelerin ilk hazırlık ve bir Alexa488 Birleşik keçi Anti-fare ikincil antikor (hücrelerle ikinci hazırlanması kuluçkaya 1:500) ve bir eşek Alexa555 Birleşik Anti-tavşan ikincil antikor (1:500) oda sıcaklığında 1 h için.
  3. Montaj orta: hücreleri içeren bir kaseye ve hücreleri nazikçe bir laboratuvar shaker üzerinde her 5 min için PBS 30 mL ile üç kez yıkayın. PBS kaldırmak ve montaj orta 4,6-diamidino-2-phenylindole içeren hücrelerin bağlayabilirsiniz. Böylece hiçbir hava kabarcıkları dikkatli bir coverslip montaj orta üstüne koymak gömülü. Hücreleri floresan mikroskopi tarafından analiz önce montaj orta sertliği için en az 3 saat bekleyin.

4. ΓH2AX ve 53BP1 analizi Foci

  1. Floresans mikroskobu: hücre çekirdeği içinde γH2AX ve 53BP1 resimde DAPI, Alexa 488 ve Cy3 için düşsel vasıl 100 X amaç sırasında filtreleri ile donatılmış bir floresan mikroskop ile analiz büyütme. Bir kamera ile görüntüleri kaydetmek ve uygun görüntüleme yazılımlarıyla görüntüleri işlemek.

Sonuçlar

ΓH2AX foci hücrelerdeki G0/G1 evresi ve ne zaman γH2AX foci farklı floresan noktalar (5A rakam) görünür G2 faz en doğru analizidir. Buna ek olarak, γH2AX foci S aşamasında hücrelerdeki analizi (şekil 5B) çoğaltma işlemi tarafından neden dağınık pan-nükleer γH2AX speckles tarafından karmaşıktır.

Hücreleri fiksasyonu %4 ile gerçekleştirilen PF...

Tartışmalar

ΓH2AX ve 53BP1 ayirt mikroskobu oluşumu ve DSB tamiri araştırma konuları geniş bir yelpazede yapılan analiz etmek için kullanışlı bir yöntemdir. Deneyler sonucu etkileyen kritik hücre döngüsünün fiksasyon ve permeabilization hücrelerinin antikor ve donanım seçimi ve floresan mikroskop bilgisayar yazılımı için kullanılan ajanlar aşamasında parametreleridir.

Hücre döngüsünün etkisi γH2AX foci örgülerine katlanarak büyüyen hücre kültürünü NHDF normal fibr...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Proje Alman Jose Carreras lösemi Vakfı (DJCLS 14 R/2017) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI mediumSigma-AldrichR0883Medium for cell culture
Heparin sodiumratiopharmPZN 3029843 Heparin 5,000 I.U. / mL
Sodium chloride solution 0.9%B. BraunPZN 1957154Component of the anticoagulant stock solution
Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-02Medium for isolation of mononuclear cells
Trypsin solution 10XSigma-Aldrich59427CEnzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture
CD34 MicroBead KitMiltenyi Biotec130-046-702Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells
Diagnostic microscope slidesThermo ScientificER-203B-CE24Microscope slides
Megafuge 1.0 RHeraeus75003060 Tabletop centrifuge 
Cytospin device
LidHeraeus76003422Lid for working without micro-tubes
Cyto containerHeraeus75003416Cyto container with 2 conical bores
Clip carrierHeraeus75003414Carrier for holding a cyto container and a slide
Support insertHeraeus75003417Support insert for holding a clip carrier
Triton X-100 (Octoxinol 9)Thermo Scientific85112Detergent for permeabilization of cell membranes
Potassium hydroxide solution 1MMerck Millipore109107Necessary for preparing the paraformaldehyde solution
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148Fixation agent
Phosphate buffered salineSigma-AldrichD8537Balanced salt solution
ChemiblockerMerck Millipore2170Blocking agent
Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301)Merck Millipore05-636Primary antibody for detection of γH2AX
Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304)Novus BiologicalsNB100-304Primary antibody for detection of 53BP1
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibodyInvitrogenA-11001Secondary antibody
Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibodyInvitrogenA-31572Secondary antibody
Vectashield mounting mediumVector LaboratoriesH-1200Contains DAPI for staining of DNA
Axio Scope.A1Zeiss490035Fluorescence microscope
Cool Cube 1 CCD cameraMetasystemsH-0310-010-MSCamera system for digital recording
Isis softwareMetasystemsNot applicableMicroscope software

Referanslar

  1. Hoeijmakers, J. H. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer. Nature. 411 (6835), 366-374 (2001).
  2. Lindahl, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. 362 (6422), 709-715 (1993).
  3. Zeman, M. K., Cimprich, K. A. Causes and consequences of replication stress. Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).
  4. . Biological effects of low doses of ionizing radiation: A fuller picture Available from: https://www.iaea.org/sites/default/files/36405843745.pdf (1994)
  5. Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12871-12876 (2003).
  6. Simsek, D., Jasin, M. Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation. Nat Struct Mol Biol. 17 (4), 410-416 (2010).
  7. Weinstock, D. M., Brunet, E., Jasin, M. Formation of NHEJ-derived reciprocal chromosomal translocations does not require Ku70. Nat Cell Biol. 9 (8), 978-981 (2007).
  8. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  9. Scully, R., Xie, A. Double strand break repair functions of histone H2AX. Mutat Res. 750 (1-2), 5-14 (2013).
  10. Walters, D. K., et al. Evidence for ongoing DNA damage in multiple myeloma cells as revealed by constitutive phosphorylation of H2AX. Leukemia. 25 (8), 1344-1353 (2011).
  11. Yu, T., MacPhail, S. H., Banath, J. P., Klokov, D., Olive, P. L. Endogenous expression of phosphorylated histone H2AX in tumors in relation to DNA double-strand breaks and genomic instability. DNA Repair (Amst). 5 (8), 935-946 (2006).
  12. Sedelnikova, O. A., Bonner, W. M. GammaH2AX in cancer cells: a potential biomarker for cancer diagnostics, prediction and recurrence. Cell Cycle. 5 (24), 2909-2913 (2006).
  13. Chen, E., et al. JAK2V617F promotes replication fork stalling with disease-restricted impairment of the intra-S checkpoint response. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (42), 15190-15195 (2014).
  14. Popp, H. D., et al. Increase of DNA damage and alteration of the DNA damage response in myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemias. Leuk Res. 57, 112-118 (2017).
  15. Panier, S., Boulton, S. J. Double-strand break repair: 53BP1 comes into focus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (1), 7-18 (2014).
  16. Escribano-Diaz, C., et al. A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice. Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
  17. Boyum, A. Separation of White Blood Cells. Nature. 204, 793-794 (1964).
  18. Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).
  19. Bain, B., Pshyk, K. Enhanced reactivity in mixed leukocyte cultures after separation of mononuclear cells on Ficoll-Hypaque. Transplant Proc. 4 (2), 163-164 (1972).
  20. Popp, H. D., et al. Leukocyte DNA damage after reduced and conventional absorbed radiation doses using 3rd generation dual-source CT technology. Eur J Radiol Open. 3, 134-137 (2016).
  21. Rothkamm, K., Balroop, S., Shekhdar, J., Fernie, P., Goh, V. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).
  22. Lobrich, M., et al. In vivo formation and repair of DNA double-strand breaks after computed tomography examinations. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (25), 8984-8989 (2005).
  23. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods Mol Biol. 588, 55-61 (2010).
  24. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods Mol Biol. 588, 63-66 (2010).
  25. Rothkamm, K., Lobrich, M. Evidence for a lack of DNA double-strand break repair in human cells exposed to very low x-ray doses. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (9), 5057-5062 (2003).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

H cresel biyolojisay 129ayirt mikroskobuH2AX53BP1x nlargenetik istikrars zl kDNA ift iplikli k r lmalaraDNA tamiri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır