Vivo EPR pH, pO2, Redox durumu ve fosfat konsantrasyonları ve glutatyon tümör Microenvironment olarak değerlendirilmesi

Özet

Fizyolojik açıdan önemli tümör microenvironment meme kanserinin fare modellerinde parametrelerinde değerlendirilmesi için düşük-alan (L-band, 1.2 GHz) elektron paramagnetic rezonans çözünür nitroxyl ve trityl sonda kullanarak gösterilmiştir.

Özet

Bu iletişim kuralı düşük alan elektron paramagnetic rezonans (EPR) kapasitesini gösterir-kimyasal tümör microenvironment (TME), nicel bilgi sağlamak için fonksiyonel paramagnetic probları ile birlikte teknikleri dayalı dahil olmak üzere p O₂, pH, redoks durum, interstisyel inorganik fosfat (PI) ve hücre içi glutatyon (GSH) konsantrasyonları. Özellikle, son zamanlarda geliştirilen çözünür çok fonksiyonlu trityl sonda bir uygulama eşsiz vivo içinde pH, pO₂ ve Peşzamanlı ölçümler sağlar ben e xtracellular alanı (umut sonda). Üç parametre kullanarak tek bir sonda ölçümleri onların korelasyon analizleri için bağımsız soruşturma dağıtım ve ölçümlerin zaman izin verir.

Giriş

Kanser ilerlemesi ve tedavi TME önemli bir rol giderek takdir¹' dir. TME solid tümör, doku hipoksi², asidoz^3,4, yüksek azalan bakiyeli kapasitesi⁵, hücre içi GSH^6,7yüksek konsantrasyonları önemli fizyolojik parametreler arasında ve interstisyel Pi⁸ iyi belgelenmiş. Noninvaziv içinde vivo pO₂, pH, Pi, GSH ve Redoks Değerlendirmeler TME biyolojik süreçlerinde benzersiz anlayışlar sağlamak ve anti-kanser ilaçlar ve tedavi stratejileri TME hedefli önceden klinik tarama için önceden araçları yardımı. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG) ve düşük alan EPR tabanlı teknikleri dokularda makul Radyofrekans penetrasyon derinliği onları bu TME parametrelerin noninvaziv değerlendirme için en uygun yaklaşımlar yapar. MRI büyük ölçüde görüntüleme su proton dayanır ve klinik ayarlarında anatomik çözümlemesi sağlamak için yaygın olarak kullanılır ama fonksiyonel çözünürlük yoksun. Hücre dışı Pi konsantrasyon ve endojen fosfat bir sinyal dayalı pH fosfor-31 Nükleer manyetik rezonans (³¹P-NMR) ölçümleri TME karakterizasyonu için potansiyel olarak çekici ama normalde tarafından birkaç kez maskeli yüksek hücre içi Pi konsantrasyonları^9,10. Bu, aksine EPR ölçümler spektroskopisinin üzerinde itimat ve görüntüleme, özel olarak tasarlanmış fonksiyonel çözünürlük sağlamak için paramagnetic sondalar. Eksojen EPR probları eksojen üzerinde bir avantaj var Not NMR EPR daha yüksek fazla içsel duyarlılık ve endojen arka plan EPR sinyalleri yokluğu nedeniyle sondalar. Bir çift işlevi pH ve Redoks nitroxyl son gelişmeler sonda¹¹ ve çok fonksiyonlu trityl sonda¹² eşzamanlı ölçümler birkaç TME parametrelerinin vivo içinde eşsiz fırsatlar sunuyor ve onların korelasyon analizleri bağımsız sonda dağıtım ve ölçüm saati. Bizim bilgi için başka yöntem aynı anda vivo içinde Fizyolojik açıdan önemli kimyasal TME parametreleri pO₂, pH_e, Pi, Redoks ve GSH gibi yaşayan bireylerde değerlendirmek için kullanılabilir vardır.

İçin probları Vivo Fonksiyonel ölçüleri:

Şekil 1 paramagnetic sondalar partikül ve çözünür probları dahil TME parametreleri erişmek için kullanılan kimyasal yapıları gösterir. Yüksek fonksiyonel hassasiyet, istikrar canlı dokuya ve en az toksisite partikül probları için in vivo EPR pulsoksimetre çözünür probları üzerinden tercih yapmak birkaç faydaları vardır. Örneğin, partikül probları doku implant bırakmak için doku pO₂ boyuna ölçümü birkaç hafta içinde çözünür probları göre yerinde tutma kez artmıştır. Öte yandan, çözünür probları partikül probları EPR tabanlı teknikleri Imaging yanı sıra birden fazla işlevleri üzerinden eşlik eden analizler izin kullanarak ölçüleri uzamsal çözüldü sağlayarak daha iyi performans (pO₂, faz, Pi, redoks, ve GSH).

Şekil 1. TME değerlendirme tahlil bir araya paramagnetic sondalar kimyasal yapılarının. Bu partikül pO₂ sonda, LiNc BuO içerir (R = - O (CH₂)₃CH₃) ve çözünür sondalar: Çift işlevi pH ve Redoks sonda, NR; GSH-duyarlı sonda, RSSR; ve çok fonksiyonlu pO₂, pH ve hücre dışı microenvironment, umut sonda. probe Pi Bu sonda sentezi sağlanan başvuruları ^11,12' tanımlanmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Protokol

Tüm hayvan iş onaylı WVU IACUC Protokolü uygun olarak gerçekleştirildi.

1. araştırma sentezi ve Kalibrasyon

1. Partikül pO₂-hassas LiNc BuO sonda
   Not: LiNc BuO microcrystals sentezlenen ve başvuru¹³' te açıklandığı gibi hazır. Onlar çok kararlı ve oda sıcaklığında yıllardır tutulabilir. LiNc BuO partikül sonda EPR linewidth pO₂' dir-duyarlı parametre. PO₂ kısmi basıncı¹³yokluğunda içsel linewidth değerleri ile 760 mmHg kadar anoksik koşullarından linewidth oksijen konsantrasyonu aralığı üzerinde ideal lineer bağımlılık LiNc BuO microcrystals göstermek oksijen ve biraz (mG/mmHg ölçülür) oksijen bağımlılık eğimi microcrystal hazırlık farklı toplu işlemleri için farklı. Bu nedenle, kalibrasyon belirli her toplu işlem için gereklidir.
   1. LiNc BuO microcrystals 60 mg tartın.
   2. Oksijen duyarlılık kalibrasyonunun microcrystals Dulbecco'nın modifiye kartal medya (DMEM) ortamda (20 mg/mL konsantrasyonu) 3 ml askıya alma ve buz bir sonda sonicator 5 mL cam yuvarlak alt tüp içinde 7 W güç kullanarak 20 kHz ile 5 min için solüsyon içeren temizleyicide.
   3. Bir cam sonicated microcrystals yer 1 mL L-bandı (1.2 GHz) EPR Spektrometre yüzey bobin rezonatör tüp ve sürekli dalgalar (CW) EPR spectra, 0, 1, 2, 4, 8 37 ° C ve oksijen konsantrasyonları fizyolojik sıcaklığında elde ve %20,9. Bir gaz denetleyicisinden teslim gaz karışımı ile çözüm köpüren tarafından oksijen konsantrasyonu sağlamak ve korumak bir termostat için bağlı bir su banyosu kullanarak sıcaklık. Aşağıdaki EPR Spektrometre edinme parametreleri kullanın: Genlik modülasyonu, 100 mG; modülasyon frekansı, 100 kHz; süpürme genişliği, 5 G; süpürme zaman, 60 s.
   4. Daha iyi bir sinyal / gürültü oranı (SNR) elde etmek için modülasyon genlik değeri linewidth % 60'ı kullanın (örneğin, bir modülasyon genlik 0.6 G kullanmak için 1 G linewidth).
   5. Alternatif kalibrasyon prosedürü Basitleştirilmiş: Hava bubbled ve anoksik çözümleri¹⁴' te EPR spectra kaydetmek. İkinci durumda, kanda oksijen azlığı örneklerde 10 mM glikoz ve 100 U/mL glikoz oksidaz 1 mL sonda çözümlere göre başvuru¹⁴eklenmesi ile sürdürmek.
   6. EPR spectra çizgi genişliği LW bulmak için Lorentzian işlevi ile uygun. Microcrystals pO₂ duyarlılık bağımlılığı LW pO₂, yani (LW_hava−LW_{kanda oksijen azlığı}) değeri olarak eğimli olarak değerlendirmek /pO_2air, nerede LW_hava ve LW_{kanda oksijen azlığı} spectra linewidth hava ve kanda oksijen azlığı koşullarda sırasıyla; p O_2air 152 mmHg =.
2. Çift fonksiyon pH ve Redoks sonda, NR
   Not: NR sonda başvuru¹¹' de açıklandığı gibi sentezlenir. Bir katı olarak ve sulu çözümler içinde oda sıcaklığında stabil. Sentezlenmiş NR sonda 4 ° C'de tutulur Azot hyperfine bölme,_Nve sinyal genlik çürüme hızı NR sonda pH için hassas spektral parametreler şunlardır (pK_bir sonda 6,6 37 ° c, 5.6 pH hassasiyeti 7,6 için aralığı =) ve azalan bakiyeli kapasitesi ile prob microenvironment, anılan sıraya göre.
   1. NR dondurucudan kaldırmak ve oda sıcaklığında (10-15 dk) ısıtmak kapsayıcı sağlar. NR 6.34 mg tartmak, 1 mL serum fizyolojik çözüm geçiyoruz ve pH 7.2 ile HCl veya NaOH pH metre kullanarak küçük aliquots için ayarlayın. Hazırlanan NR çözüm (10 mM) hisse senedi bir çözüm olarak kullanın.
   2. NR sonda pH kalibrasyon aşağıdaki gibi (başvuru¹¹bakınız) yapın. İlk olarak, 2 mM Na-fosfat tampon, 150 mM NaCl 0.9 mL 0.1 mL NR stok çözeltisi ekleyin. Elde edilen 1 mM NR çözüm aliquots için pH metre kullanarak gerekli pH HCl ve NaOH ile titre. Bir termostat için bağlı bir su banyosu kullanarak sıcaklık kontrol.
   3. EPR spectra örneklerin L-bandı EPR Spektrometre kullanılarak 1.5 mL microcentrifuge tüplerde kaydedin. Aşağıdaki EPR Spektrometre edinme parametreleri kullanın: Genlik modülasyonu, 2.5 G; modülasyon frekansı, 100 kHz; süpürme genişliği, 60 G; süpürme zaman, 20 s.
   4. (_N) sabit bölme hyperfine EPR spectra ürününün düşük ve yüksek alanı bileşenleri arasındaki mesafenin yarısı olarak ölçmek ve pH kalibrasyon eğrisi pH L-bandı EPR ölçülerini sağlamak için karşı arsa.
3. GSH-duyarlı RSSR sonda
   Not: RSSR sonda başvuru¹⁵' te açıklandığı gibi sentezlenir. Sentezlenmiş NR sonda 4 ° C'de depolayın Lipofilik RSSR disülfür biradical bileşik ile hücre içi GSH tepki ve GSH vivo içinde EPR^16,17kullanarak belirlemek için güvenilir bir yaklaşım sağlamak için hücre zarı arasında kolayca dağılır. Bu yöntem ile RSSR probe GSH thiols baskın hücre içi havuzu yüksek tepki oranları üzerinde temel alır. RSSR biradical onun disülfür bağ ( düzeni 1bakınız) GSH bölmeleri ile reaksiyon iki radikal parçaları ve biradical spektral bileşenlerin bir düşüş tezahür ve karşılık gelen arasındaki spin Satım iptali sonuçlanan monoradical bileşenleri artırılır. Biradical RSSR sonda için monoradical bileşen genliği artış oranını GSH konsantrasyon ile doğru orantılıdır ve uygun bir GSH-duyarlı EPR spektral parametresi. GSH konsantrasyon vivo içinde EPR ölçümleri üzerinden değerlendirmek için karşılık gelen sıcaklık ve pH GSH ile RSSR reaksiyon oranı önceki kalibrasyonu aşağıdaki gibi yapılması gerekiyor.
   1. RSSR dondurucudan kaldırmak ve oda sıcaklığında (10-15 dk) ısıtmak kapsayıcı sağlar. NR 4,05 mg tartmak ve 1 mL DMSO çözeltisi içinde çözülür. Hazır RSSR çözüm (10 mM) hisse senedi bir çözüm olarak kullanın.
   2. Oranı sabit, k_obs, RSSR arzu edilen sıcaklık ve pH GSH ile tepki değerini aşağıdaki gibi belirler.
   3. İlk olarak, RSSR hisse senedi çözüm (10 mM) 20 µL 0,98 mL 1 mM Na-fosfat tampon ekleyin, pH 7.2, 150 mM NaCl 0.2 mM RSSR elde etmek için yoklama çözüm.
   4. 1, 2 ve 5 mM GSH konsantrasyonları 0.1 M Na-fosfat tampon pH 7.2 çözümleri hazırlayın. Doğru hedef organ dan in vivo ölçümleri GSH konsantrasyonu hücrelerdeki değerlendirmek için vitro kalibrasyon hücre içi pH değerini yakın bir pH yapılması gerekiyor.
   5. 0.2 mM RSSR çözüm ve 1.3.4 adımda hazırlanan GSH çözümlerden birini eşit miktarda karıştırın. bir son konsantrasyon sonda 0.1 mm ve GSH için 0.5, 1 ya da 2.5 mM.
   6. Karıştırma hemen RSSR ve GSH çözüm sonra örnek EPR rezonatör yerleştirin ve EPR spectra 12 saniyede 10 dakika kayıt. Sonra monoradical spektral genlik artış Kinetik hesaplamak. Aşağıdaki EPR Spektrometre edinme parametreleri kullanın: Genlik modülasyonu, 1 G; modülasyon frekansı, 100 kHz; süpürme genişliği, 60 G; süpürme zaman, 10-60 s.
   7. Ölçülen EPR Kinetik monoexponents için uygun ve Üstel Kinetik, τ zaman sabiti hesaplayın. Doğrusal regresyon (1/τ = k_obs × [GSH]) tepki GSH ve RSSR arasında gözlenen oranı sabit değer sağlar (örneğin, 34 ° C ve pH 7.2, k_obs 2.8 ± 0.2 M^-1s^-1=)¹¹.
4. Çok fonksiyonlu umut sonda pO₂, pH ve Pi değerlendirme
   Not: UMUT sonda açıklandığı gibi sentezlenir monophosphonated trityl¹² başvuru ve 4 ° C'de tutulur UMUT CW EPR spectra pH << pK_a (A - asit form) ve pH >> pK_a (B - temel form), bölme, bir_Pfosfor hyperfine nedeniyle birini tarafından temsil edilir. Tipik araç ayarlar şunlardır: Genlik modülasyonu, 37.5 mG; modülasyon frekansı, 100 kHz; süpürme genişliği, 0.9 G; süpürme zamanı, 20-60 s. Ara pH (5 < pH < 8) umut sonda EPR spektrum bir dörtlü tarafından karakterize zaman her iki A ve B Birleşik mevcut. Bireysel EPR linewidth umut bir pO₂ belirtecidir (doğruluk, ≈ 1 mmHg; p O₂ Aralık, 1-100 mmHg). Protonated umut (form) kısmını 8.0 (doğruluk, ± 0,05) ile 6 Aralık içinde bir pH belirtecidir. Proton (mG ifade edilir) kuru spectra simülasyon tarafından çıkarılan Pi ile bir Pi işaretleyici (doğruluk, ± 0,1 mM, aralığı, 0.1-20 mM) değeridir. Kalibrasyon işlemleri fizyolojik sıcaklık (37 ° C), çözüm iyonik gücü (NaCl, 150 mM) ve umut sonda konsantrasyonu 0.2 mM, daha önce açıklanan başvurular^12,18' ve aşağıda ayrıntılı olarak gerçekleştirilir.
   1. UMUT sonda dondurucudan kaldırmak ve oda sıcaklığında (10-15 dk) ısıtmak kapsayıcı sağlar.
   2. UMUT sonda 10.7 mg tartmak, 1 mL serum fizyolojik çözüm geçiyoruz ve pH 7.4 için ayarlayın. Ekle 20 µL 0.2 mM umut elde etmek için umut (10 mM) 0,98 mL serum fizyolojik çözeltisi için hazırlanan hisse senedi çözümün çözüm sonda.
   3. PH probu kalibrasyonu için umut sonda çözüm 0.2 mM küçük hacmi NaOH veya HCl, Örnek % 1'den daha az son seyreltme ile eklenmesiyle titre. Ulusal büro standartları (ABD tarafından) önerilen başvuru çözüm pH değerleri kullanarak 37 ° C'de kalibre bir pH elektrodu ile pH ölçmek. Sirkülatörün için bağlı bir ceketli tepki ölçek dikkatle ısısını başvuru ve titre çözümler pH ölçümleri sırasında korumak için kullanın. 10 mM glukoz eklenmesiyle anoksik koşulların ve 100 U/mL glikoz oksidaz sonda çözümleri için korumak.
   4. EPR spectra pH ≤ 5 ve pH ≥ 8, A ve B formlarının sırasıyla, anoksik şartlarda fosfat, yokluğunda elde etmek.
   5. Karşılık gelen spectra içsel spektral parametrelerini elde etmek için kullanın. Yani, tayf çizgi umut sonda çözümlenmemiş süper hyperfine yapısını yaklasik Gauss fonksiyonu ile Lorentzian işlevinin evrişim olarak benzetimini yapmak. Hesaplanan EPR spectra deneysel spectra için uygun bir_P ve Lorentzian linewidth (ΔL_s), enine gevşeme hızı, 1/T₂ belirlenen değerleri verir (burada 1/T₂ = (√3/2) L_s için CW EPR RF emme satırında ölçülen türevi) ve Gauss dağılımı, G. linewidth
      Not: 1.4.2. adımda belirtilen koşulları ölçü vasıl spectra elde edilen parametreler şunlardır:_P(A) 3.63 G, bir_P= (B) = 3.37 G; 1/T₂(A) = 23,6 mG; 1/T₂(B) = 9 mG; G(A) = 40 mG; G(B) = 45 mG (başvuru⁸bakınız).
   6. EPR spectra umut elde ara pH (5 < pH < 8). Başvuru¹⁹ yukarıda açıklanan¹⁸olarak uyarlanmış sigara birleştiğinde veya gevşek biçimde eşleşmiş sistemlerindeki bazı siteler arasında değişim teorisi kullanarak alınan EPR spectra ürününün yüksek under bileşen simülasyonu. Kullanım iç parametrelerin elde için A ve B Birleşik (bkz. Adım 1.4.5) değişkenlerin sayısını azaltmak için. Hesaplanan spectra kesir bir (p_A) değerleri bulmak için deneysel olanlar için uygun ve p_A değer bağımlılığını pH arsa. P_A bağımlılık daha fazla çalışmalar pH pH kalibrasyon eğrisi kullanın.
      Not: P_A bir standart titrasyon eğrisi ile pH bağımlılığı uygun sağlar ayrılma sürekli, pK_bir (umut) değeri 6,9⁸=. İn vivo çalışmalarda umut inceleyebilirsek tam EPR spectra edinme EPR spektrumunda bölme fosfor hyperfine düşük ve yüksek alan bileşenleri arasındaki boşluğu elde etmek için gerekli ek süre nedeniyle zordur. Bu nedenle, daha fazla örneği çalışmalarda EPR spektrumunun yalnızca yüksek under bileşeni ölçülen analiz ve.
   7. PO₂sonda kalibrasyon EPR spectra umut inceleyebilirsek, çeşitli oksijen konsantrasyonları elde etmek.
   8. Gaz karışımı ile köpüren tarafından Çözümleri Denetim pO₂ değerlerini bir gaz denetleyicisinden teslim. Denetim bir termostat için bağlı bir su banyosu kullanarak çözüm sıcaklık (37 ° C).
   9. EPR spectra taklit ve bunları oksijen kaynaklı gevşeme oranları değerlerini belirlemek için 1.4.6. adımda açıklandığı gibi deneysel olanlar için uygun.
      Not: Oksijen kaynaklı gevşeme oranları değerlerini 0,49 mG/mmHg her iki a vardı ve 37 ° C⁸' de ölçülen B formları umut sonda.
   10. [Pi] sonda kalibrasyon EPR spectra umut inceleyebilirsek çeşitli fosfat konsantrasyonlarda elde etmek. PK_bir yakınındaki bir pH değeri ile umut radikal çözüm kullanın (pK_bir 6,9 37 ° C'de =)¹⁸ ve çeşitli fosfat konsantrasyonları ile titre. Sıcaklık ve gaz kompozisyon adımları açıklandığı gibi korumak.
   11. EPR spectra benzetimini yapmak ve onları döviz kuru Pi kaynaklı değerlerini belirlemek için adım 1.4.6 açıklandığı gibi deneysel olanlar için uygun.
       Not: Pi kaynaklı Döviz Kuru bağımlılığını [Pi] ayarı'nda daha fazla çalışmalar olarak kullanılır.

2. fare modelleri meme kanseri

1. MMTV-PyMT spontan tümör modeli
   1. 4-8 hafta kullanın- vivo içinde EPR Etütler kendiliğinden oluşan meme tümörleri ile yaşlı kadın arkadaş virüs B-tipi duyarlılık/NIH (FVB/H) fare meme tümör virüs organizatörü (MMTV) polyoma orta-T antijen (PyMT +) fareler.
   2. Normal meme dokuları ve tümör doku microenvironments karşılaştırma için yaş eşlemeli littermate kadın PyMT onkogen (PyMT−, "vahşi tür")²⁰dakikaya eksik kullanın.
   3. L-bandı EPR spektroskopisi isoflurane anestezi sırasında dört hafta boyunca haftada bir kez fareler tabi (bkz: sonda teslimi aşağıda).
   4. Fareyi kullanarak bir hava-isoflurane karışımı (% 3 isoflurane) anestezi ve yüzey bobin rezonatör yakın tümör (meme dokuları) ile doğru lateral pozisyonda ayarlanabilir bir tablo üzerinde fareyi getirin.
   5. Sonra fare yerleştirme, sonda intratissual (BT) enjeksiyonu ile yönetmek, EPR Spektrometre ayarlamak ve 5-10dk EPR spectra elde etmek.
   6. 2-3 meme tümörleri ölçmek (--dan MMTV-PyMT + fare) veya sigara-tümörün taşıyan meme dokuları (dan PyMT− fareler) aynı EPR oturumu sırasında.
2. Orthotopic MET-1 tümör modeli
   1. FVB/N arka plan Met-1 fare meme kanseri hücrelerinin 37 ° C, % 5 CO₂ve % 95 bağıl nem % 10 fetal sığır serum (FBS), 10 µg/mL insülin, 5 ng/mL rhEGF ve % 1'i içeren DMEM içinde büyümek için PSA (penisilin G sodyum, streptomisin sülfat ve Amfoterisin B) ~ %80 izdiham içinde bir T175 şişesi.
   2. Medya Aspire edin ve 10 mL PBS ile yapışık hücreleri durulama (1.54 mM KH₂PO₄, 155 mM NaCl ve 2,71 mM Na₂HPO₄-7 H₂O olmadan Kalsiyum klorür veya magnezyum klorür, pH 7.4 =).
   3. Hücreleri ekleme 5 mL % 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ve şişeye sallanan bağlantısını kesin. Hücreler ayrılır, 10 mL % 10 içeren DMEM ekleyin şişeye FBS ve hücreleri toplamak.
   4. Hücre süspansiyon vasıl 132 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve 100 µL başına 1 x 10⁶ hücre için resuspend en az DMEM.
   5. Bir insülin şırınga (29G 1/2 iğne) kullanarak, yavaş yavaş 100 µL tümör hücre süspansiyon, sayı 4 meme yağ yastıkları 8-hafta-yaşlı kadın FVB/N vahşi türü farelerin enjekte.
   6. Palpasyonla tarafından tümör başlatma izlemek (yaklaşık 2-3 hafta sonra görünür), büyüme (visual) ve fare heath (görsel) her geçen gün.
   7. Bir kez haftada Çap pergeli kullanarak tümör boyutlarını ölçün ve denklemi kullanarak tümör birimleri belirleyin:
      

3. sonda teslim Vivo içinde işlevsel ölçümler için

1. Kullanım partikül LiNc BuO sonda (protokol) pO₂ ölçüleri tümör hücreleri ile içselleştirilmiş LiNc-BuO Reproduction tarafından orthotopic tümör modellerinde microcrystals daha önce^14,21 açıklanan ve aşağıda ayrıntılı.
   1. MET-1 hücrelere, LiNc BuO microcrystals içselleştirilmesi için MET-1 tümör model söz konusu olduğunda LiNc BuO microcrystals içinde DMEM 20 mg/mL konsantrasyonu askıya alma ve sonda sonicator 5 mL cam yuvarlak alt tüp içinde 7 W güç kullanarak 20 kHz ile solüsyon içeren temizleyicide buz üzerinde 5 min için.
   2. 100 µL (LiNc BuO 2 mg) süspansiyon T75 şişeye 10 mL kültür MET-1 hücreleri (yaklaşık % 30 birleşmesi) içeren medya ile ekleyin. Tüm yordamları Biyogüvenlik kabini gerçekleşecek ve medya penisilin ve streptomisin olası enfeksiyon en aza indirmek için içerir.
   3. 37 ° C'de 72 h ya da onlar ulaşana kadar hücreleri kuluçkaya ~ %80 confluency.
   4. Medya Aspire edin. Hücreleri beş kez 10 mL PBS ile yıkayın. 5 mL tripsin-EDTA hücrelerle bağlantısını kesin. Hücreleri toplamak. 2.2.4. adımda yukarıda açıklandığı gibi santrifüj. Bir örnek hücre hücre canlılığı ve miktarını belirlemek için dışlama boya lekesi.
   5. 1 x 10 100 µL⁶ bir konsantrasyon hücreleri askıya en az DMEM.
   6. Bir insülin Ģırınga kullanarak, yavaş yavaş sayı 4 meme yağ yastıkları farelerin 8-hafta-yaşlı kadın FVB/N vahşi türü adım 2.2.5 açıklandığı gibi içine içselleştirilmiş LiNc BuO microcrystals içeren hücre süspansiyon, 100 µL enjekte et.
   7. Tümör başlatma ve büyüme 2.2.6 ve 2.2.7 adımlarda açıklandığı gibi izlemek.
2. (İletişim kuralı II)'a sonda kullanımı partikül LiNc BuO spontan veya orthotopic modelleri. LiNc OBu microcrystals ilgi, örneğin, sitesi, normal meme dokuları veya meme tümörleri, bir insülin Ģırınga kullanarak enjekte.
3. Çözünür probları
   1. Fareler tarafından bir hava-isoflurane karışımı (1.0 L/dk dır ve isoflurane 2-%3) inhalasyon anestezi bir anestezi makine ve EPR Spektrometre boşluğu koyun.
   2. Araç ayarlamak, sonra enjekte NR (10-30 µL, 10 mM), umut sonda (10−30 µL, 0,5-2 mM) serum, pH 7.2 veya RSSR sonda DMSO (10 µL, 10 mM) çözümleri (BT).

4. Vivo içinde işlevsel ölçümleri

1. EPR spektroskopik ölçümler, fareler 3.3.1. adımda açıklandığı gibi bir anestezi makinesi kullanarak hava-isoflurane karışımı Solunduğunda anestezi.
2. L-bandı (1.2 GHz) EPR Spektrometre aşağıdaki gibi kullanarak fonksiyonel ölçüleri gerçekleştirin.
   1. Spektrometre ayarlamak ve yüzey bobin rezonatör meme tümör ya da normal bir meme bezi üzerine yerleştirin.
   2. 5−10 min için implante partikül sonda gelen EPR spectra implantasyonu sonrası birkaç hafta boyunca elde etmek. Çözünür probları durumunda EPR spectra hemen sonda enjeksiyon için 5-10 dk sonra elde etmek.
   3. Bölme,_Nve sinyal genlik, I(t) hyperfine bulmak için NR sonda EPR spectra analiz. 1.2.4. adımda elde kalibrasyon eğrisi kullanarak pH değeri için bir_N değeri dönüştürün. Başlangıç genliği göreceli değişiklik olarak sinyal genlik I(t) çürüme oranı analiz I(t = 0), ikinci (s^-1) rasgele birimlerindeki hesaplanmış.
   4. GSH-duyarlı RSSR sonda GSH toplama hesaplamak için üstel Kinetik zaman sabiti elde etmek için monoexponents için EPR spektrumu monoradical bileşeni artış uygun.
   5. Çok fonksiyonlu umut sonda pH, pO₂ ve Pi değerleri verim için deneysel olanlar (Adım 1.4.5) açıklandığı gibi yüksek alanlı bileşeninin EPR spectra uygun.

5. istatistiksel analiz

1. Veri işleme ve istatistiksel çözümlemeler gerçekleştirmek. Bir Pearson r korelasyon testi (için normal dağılım veri kümeleri) ve Spearman'ın sırası sipariş korelasyon (için veri kümeleri veri dağıtım reddedilen normallik ile) korelasyon analizi için kullanın.

Sonuçlar

Doku p O ₂ LiNc BuO kullanarak değerlendirme probları:

1.1. adım açıklanan yordamı kullanarak, taze hazırlanmış LiNc BuO microcrystals süspansiyon kalibrasyonu yapılır. Şekil 2 LiNc BuO sonda yanı sıra arabellek süspansiyon ve meme tümör dokusu kadın C57Bl/6 farelerde tümör b...

Tartışmalar

Sunulan yöntemler yani pO₂, pH, redoks durumu ve interstisyel Pi ve hücre içi GSH konsantrasyonları kimyasal TME kritik parametreleri noninvaziv vivo içinde değerlendirilmesi için olanak sağlar. Manyetik rezonans teknikleri, MRI ve düşük alan EPR, gibi noninvaziv vivo içinde bu TME parametrelerinin profil oluşturma için seçtiğiniz yöntemlerdir. MRI anatomik yapıları görüntüler ama fonksiyonel duyarlılık yoksun. MRI aksine, EPR teknikleri fonksiyonel spin probl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-band EPR spectrometer	Magnettech, Germany		L-band (1.2 GHz) electron paramagnetic resonance (EPR) spectrometer for collection in vitro and in vivo spectra of paramagnetic molecules
Temperature & Gas Controller	Noxygen, Germany		Temperature & Gas Controller designed to control and adjust the temperature and gas composition
Sonicator	Fisher Scientific
GSH (L-Glutathione reduced)	Sigma-Aldrich	G4251
MMTV-PyMT  mice	In house
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
Met-1 murine breast cancer cells	In house
C57Bl/6 wild type mice	Jackson Laboratory
Trypsin	Thermo Fisher Scientific	25200056
Trypan Blue Exclusion Dye	Thermo Fisher Scientific	T10282
Ohmeda Fluotec 3
Isoflurane (IsoFlo)	Abbott Laboratories
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763
Sodium phosphate monobasic	sigma-Aldrich	S07051
Sodium Chloride	sigma-Aldrich	S7653
Hydrochloric acid	sigma-Aldrich	320331
Sodium Hydroxide	sigma-Aldrich	S8045
Glucose	sigma-Aldrich
Glucose oxydase	sigma-Aldrich
Lauda Circulator E100	Lauda-Brikmann
pH meter Orion	Thermo Scientific
LiNc-BuO probe	In house		The Octa-n-Butoxy-Naphthalocyanine probe was synthesizided according to ref 13
NR probe	In house		The Nitroxide probe was synthesizided according to ref 11
RSSR probe	In house		The di-Nitroxide probe was synthesizided according to ref 15
HOPE probe	In house		The monophoshonated Triarylmethyl probe was synthesizided according to ref 12