N-metil-D-Aspartat (NMDA) reseptör karşı antikor kanında tespit etmek için basit hücre tabanlı ayirt tahlil

Özet

NR1 alt birim NMDA reseptör karşı otoantikorlar ile otoimmün ensefalit şüphesi hastaların kan algılamak için antijen olarak insan embriyonik hücreleri (HEK293) yeşil flüoresan protein tagged NMDA reseptör ectopically dile getirdi. Bu basit yöntem klinik ayarları, amacıyla filtreleme için uygun olabilir.

Özet

Anti-NMDA reseptör antikor varlığı çeşitli nöropsikiyatrik belirtiler etkilenen hastalarda anti-NMDA reseptör otoimmün ensefalit olarak adlandırdığı, neden olabilir. NMDA reseptör kan veya beyin-omurilik sıvısı (bos) karşı belirli antikor tespiti bu durumun doğru tanı için önemlidir. NMDA reseptör iki zorunlu NMDA reseptör alt birim 1 (NR1) ve bir ya da iki NMDA reseptör dahil olmak üzere dört alt birimleri içeren bir iyon kanal karmaşık proteindir alt birim 2A (NR2A), NMDA reseptör alt birim 2B (NR2B), NMDA reseptör alt birim 2C (NR2C), veya NMDA reseptör alt birim 2D (NR2D). Anti-NMDA reseptör antikor epitope bir NMDA reseptör NR1 alt birimi hücre dışı N-terminal etki mevcut olduğu bildirildi. Bu çalışmanın amacı bir tarama testi klinik ve temel araştırma kolaylaştırmak için kanda NR1 alt birim NMDA reseptör karşı otoantikorlar olup olmadığını belirlemek için kullanılan bir basit hücre tabanlı ayirt tahlil geliştirmektir Anti-NMDA reseptör otoimmün ensefalit.

Giriş

Anti-NMDA reseptör otoimmün ensefalit her yaştaki hastalarda gelişebilir ve ağırlıklı olarak kadın hasta^1,2etkiler bir yeni tanınan hastalığı varlıktır. Ensefalit³ilk bilinmeyen etiyolojisi olan hastalarda en sık tanı konmuş ensefalit biridir. Hastalar genellikle Anti-NMDA reseptör ensefalit ile etkilenen bir baş ağrısı ya da ateş, bilinç düzeyini değiştirmek ve ajitasyon, sinirlilik gibi akut nöropsikiyatrik belirtiler çeşitli hızlı geliştirme tarafından takip prodromal belirtiler var , anksiyete, uykusuzluk, Varsanılar, sanrılar, saldırganlık, tuhaf davranışlar, hareketi anormallikleri, otonomik bozukluk ve nöbet saldırıları^4,5. Bu koşul ve immünoterapi ile zamanında tedavi erken tanınması daha iyi sonuç ve etkilenen hastalar⁶bile tam kurtarma için önemlidir. Bu nedenle, bu anti-NMDA reseptör otoimmün beyin iltihabı akut veya yeni başlangıçlı psikotik özellikler^7,8ile başvuran hastaların önemli bir ayırıcı tanı olarak düşünülmesi gereken önerilmektedir.

Klinik özelliklerin yanında hafiye-in kan veya CSF NMDA reseptör karşı antikor anti-NMDA reseptör otoimmün ensefalit⁹doğru tanı için önemlidir. Anti-NMDA reseptör antikor algılamaya immünolojik testler çoğu birkaç araştırma laboratuvarları^10,11' kullanılabilir ve tek bir piyasada bulunan hücre tabanlı ayirt tahlil için tarama olduğunu Anti-NMDA reseptör otoantikorlar¹². Bu çalışmanın amacı uygun laboratuvar olarak anti-NMDA reseptör klinik araştırma kolaylaştırmak için anti-NMDA reseptör otoantikorlar varlığı ekran için kullanılan basit içi hücre tabanlı ayirt tahlil geliştirmektir Otoimmün ensefalit. NMDA reseptör özellikle beyin ve ifade bir heterotetramer iyon kanal protein kompleksi var. Bu iki zorunlu NR1 alt birimleri ve NR2A, NR2B, NR2C veya NR2D¹³bir ya da iki alt birimleri ile birlikte yapılır. Bir önceki çalışma antikorlar tarafından hedef ana epitope NR1 alt birim⁵ekstraselüler N-terminal etki olduğunu bildirdi. Bu nedenle, bu iletişim kuralı, biz insan rekombinant NR1 alt birim proteini insan embriyonik böbrek epitel hücre satırı (HEK293) yeşil flüoresan protein (GFP) tagged NMDA reseptör hızlı ve algılamak için bir hücre tabanlı ayirt testi geliştirmek anti-NMDA reseptör otoantikorlar kan IgG sınıf.

Protokol

Çalışma kurumsal inceleme kurulu, Chang Gung Memorial hastanede Linkuo, Taoyuan, Tayvan (102-2577A3) tarafından kabul edildi.

1. NR1-GFP ifade plazmid hazırlanması

1. NR1-GFP plazmid Mix 10 ng ile 100 µL Escherichia coli yetkili hücreleri zorlanma DH5α steril bir 1,5 ml tüp, damlalıklı karışımı yavaşça kadar santrifüj kapasitesi ve aşağı 4 - 6 kez ve buz için 20 dk metroyla kuluçkaya.
2. Tüp bir su banyosunda 1 dk 42 ° C'de kuluçkaya, su banyosundan tüpü çıkarması, 1 mL lysogeny suyu (LB) orta tüpün içine ekleyin ve tüp 37 ° c için 1 h sallayarak ile bir kuluçka kuluçkaya.
3. 50 µL Ampisilin (0.1 mg/mL) içeren bir LB agar plaka üzerine karışımı spread ve LB agar plaka bir kuluçka 37 ° C'de gecede kuluçkaya.
4. Bir koloni steril ucu kullanarak gecede LB agar plaka almak ve belgili tanımlık uç girdap bir 5 mL LB orta ve Ampisilin (0.1 mg/mL) de içeren bir bakteri kültürü tüp. Gecede sallayarak ile bir kuluçka 37 ° C'de tüp kuluçkaya.
5. Aliquot 3 mL 250 mL steril LB orta ve Ampisilin (0.1 mg/mL) içeren bir 500 mL şişe içine gecede bakteri kültürü. Şişeye 37 ° C'de sallayarak ile kuluçkaya. Dalga boyu 600 adlı bakteri kültürü optik yoğunluk (OD) düzenli olarak kontrol OD600 0,6-1.0 ulaşıncaya kadar bir Spektrometre kullanılarak nm.
   Not: gece bakteriyel kültürünün de 800 µL gliserol hisse senedi hazırlamak ve gliserol hisse senedi altında-80 ° C ileride kullanmak üzere saklamak için 200 µL gliserol ile karıştırın.
6. Nr1-GFP ifade plazmid ile 250 mL bakteriyel kültür hazırlamak
   1. Santrifüjü 6.000 x g 4 ° C'de 15 dakika de tarafından hücreleri toplamak
   2. Bakteri Pelet RNase A içeren 10 mL resuspension arabellekte resuspend; hiçbir yığın iyice görmüş kadar girdap.
   3. 10 mL lizis arabellek bakteriyel süspansiyon eklemek, hafifçe karışım 4 - 6 kez ters ve lysate, oda sıcaklığında (RT) 5 min için kuluçkaya.
   4. 10 mL önceden soğutulmuş yağış arabellek için lysate ekleyin, 4 - 6 kez karışımı yavaşça tersine çevirin.
   5. Lysate kapaklı bir filtre kartuşu varil içine dökün; RT, 10 dk bekleyin
   6. Kartuş çıkış meme kapağını çıkarın, bir dalgıç kartuşu takın ve pistonu hafifçe bastırın. Filtre uygulanmış toplamak bir 50 mL tüp içine lysate.
   7. Tüpü yaklaşık 10 kat ters çevirme tarafından karışımı karıştırın ve karışımı 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya 2.5 mL özel arabelleğe üretici süzülmüş lysate ekleyin.
   8. Filtre uygulanmış lysate karışımı ile 10 mL denge tampon ön dengelenmiş bir filtre sütun uygulanır. Yerçekimi tarafından boşaltmak sütun izin.
   9. Sütun 30 mL yıkama arabellek ile iki kez yıkayın, sonra 15 mL elüsyon tampon kullanarak sütundan DNA elute.
   10. 10.5 mL (0.7 birimler) isopropanol eluted DNA arabelleğe ekleyin, karıştırın ve 20.000 x g 4 ° C'de 30 dk için karisimin santrifüj kapasitesi
   11. Süpernatant özenle dikkatle boşaltmak, DNA Pelet 5 mL endotoksin-Alerjik % 70 etanol ile bir kez yıkama ve 20.000 x g 10 dk de santrifüj kapasitesi.
   12. Süpernatant dikkatle boşaltmak, 5-10 dk bir kimyasal başlıklı Pelet Makinası ve 300-500 µL endotoksin-Alerjik arabelleği Pelet geçiyoruz.
   13. Belgili tanımlık eriyik vasıl bir Spektrofotometre kullanarak UV 260/280 nm emilimini ölçerek plazmid konsantrasyonu belirlemek.
       Not: ifade plazmid aynı iletişim kuralını kullanarak GFP hazırlık.

2. transfection HEK293 hücre NR1-GFP ifade plazmid ile

1. Aliquot 200 µL % 2 jelatin çözüm her bir 48-şey kültür tabak iyi ve plaka için en az 30 dk. 37 ° C'de kuluçkaya.
2. 200 µL % 10 fetal sığır serum (FBS) her iyi içeren hücre kültür ortamının iyi ve tohum 5 x 10⁴ HEK293 hücrelerinde jelatin çözümden Aspire edin. Gecede %5 CO₂ ile sağlanan bir oksijen kuluçka 37 ° C'de plaka kuluçkaya.
   Not: Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayıldı.
3. Ertesi gün, taze kültür orta % 10 içeren 200 µL ile harcanan kültür orta yerine FBS iyi başına.
4. Her, tek şey, hazırlamak çözüm A 100 karıştırılarak NR1-tGFP plazmid 20 µL kültür orta ve 0.8 µL transfection reaktif 20 µL kültür orta ile karıştırma tarafından çözüm B ng. Toplam hacim her deneme için hazırlamak için gerekli olan kuyu sayısını çarpın.
5. Çözüm C çözüm A ve çözüm B karıştırarak hazırlayın ve RT karisimin 20-30 dk için kuluçkaya.
6. Her şey HEK293 hücreleri içeren için çözüm C aliquot 40 µL plaka yavaşça girdap ve plaka gecede %5 CO₂ ile sağlanan bir oksijen kuluçka 37 ° C'de kuluçkaya.
7. Ifade NR1-GFP rekombinant protein 40 X-200 X büyütme ile floresan mikroskop altında ana bilgisayar hücrelerdeki kontrol (uyarma/emisyon: 482/502 nm) ve hücre tabanlı ayirt tahlil için devam edin.
   Not: aynı iletişim kuralını kullanarak HEK293 hücre içine ifade plazmid GFP Transfect.

3. hücre tabanlı ayirt tahlil

1. Kuyulardan harcanan orta Aspire edin, sonra yıkama her şey ile fosfat 200 µL serum fizyolojik (PBS) üç kez arabelleğe alınmış.
2. Her şey için 200 µL % 4 paraformaldehyde çözüm ekleyin; RT plaka 15dk için kuluçkaya.
3. Paraformaldehyde çözüm kuyulardan Aspire edin ve her yıkama PBS 200 µL ile üç kez iyi.
4. PBST içinde 200 µL % 10 yağsız süt ekleyin (% 0,1 ara-20 PBS) her şey ve RT plaka nazik sallayarak ile 1 h için kuluçkaya çözüm.
5. % 10 yağsız süt kuyudan PBST çözümünde Aspire edin, sonra 200 µL PBST Wells'le bir kez yıkayın.
6. Nazik RT için 1 h sallayarak ile birincil antikor olarak seyreltilmiş plazma (1: 100 PBST içinde) Wells'le kuluçkaya.
   Not: Otoimmün beyin iltihabı için şüpheli hastaların kan plazma elde edilir.
7. Kuyulardan seyreltilmiş plazma Aspire edin ve her yıkama PBST 200 µL ile üç kez iyi.
8. Keçi Anti-insan IgG Alexa Fluor 594 (1:1, 000 seyreltme PBST) ile her şey için Birleşik 200 µL ekleyin ve nazik için 1 h sallayarak ile kültür plaka RT, kuluçkaya.
9. IgG Birleşik Alexa Fluor 594 Çözümle keçi Anti-insan Aspire edin ve her yıkama PBST 200 µL ile üç kez iyi.
10. 100 µL gliserol çözüm (PBS ve 1:100,000, 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) % 50 gliserol) her şey için ekleyin.
11. Gözlemlemek ve hücreleri kullanarak bir 10 X mercek ve 4 X, 10 X ve 20 X hedefleri floresan mikroskop altında görüntü.
    Not: her boya için doğru filtre kullanın: NR1-GFP için (uyarma/emisyon 482/502 = nm), Alexa Fluor 594 için (uyarma/emisyon 561/594 = nm), DAPI için (uyarma/emisyon 358/461 = nm). GFP aynı şekilde ifade HEK hücreleri kullanarak negatif kontrol kuralları.

Sonuçlar

Ortalama olarak, biz 200-300 µg endotoksin ücretsiz ifade plazmid NR1-GFP ve GFP 250 mL bakteriyel kültüründen Protokolü'nün 1 bölümünde açıklanan yordamı edinebilir. Bir miktar 100 ng/iyi ifade plazmid 48-şey plaka protokol 2 bölümde açıklandığı gibi kültürlü HEK293 hücre transfection için kullanıldı. 24-30 h transfection sonra hücreleri NR1 GFP ifade ve GFP rekombinant proteinler floresan mikroskop altında tespit edilemedi. Şekil 1A

Tartışmalar

Orada canlı hücre tabanlı ayirt tahlil¹¹hücre tabanlı ayirt tahlil^{9 sabit, dahil olmak üzere literatürde bildirilen NMDA reseptör karşı otoantikorlar varlığı ekran için çeşitli hücre tabanlı immünolojik deneyleri} , ve Akış Sitometresi tabanlı tahlil¹⁴. Canlı hücre tabanlı ayirt tahlil Akış Sitometresi tabanlı tahlil eğitimli personel ve özel ekipman gerekirken NR1 protein ectopically ifade hücreleri hazırlık kısa bir...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
GRIN1 (GFP-tagged) - Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1	Origene (Rockville, MD, USA)	RG219368	NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences
pCMV6-AC-GFP	Origene (Rockville, MD, USA)	PS100010	mammalian vector with C-terminal tGFP tag
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen (Hilden Germany)	12362
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)	11668-019
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher	31985-070
DMEM, High Glucose, Pyruvate	Thermo Fisher	11995-065
Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.01
Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	Thermo Fisher	A-11014
Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA)	Euroimmun AG, Lübeck, Germany	CA 112d-0101
Euroimmun Assay Kit