Transcriptionally düzenlenmiş uyku güzellik sistem entegrasyon arızalı Lentiviral vektör paketlenmiş bir verimli Vitro transpozisyonu yöntemle

Özet

Bu iletişim kuralı tarafından transcriptionally düzenlenmiş Uyuyan güzel sistem istikrarlı bir gen ilgi entegrasyonu insan genomu ulaşmak için bir yöntem açıklanır. Arızalı lentiviral Vektörler, vitro iletim insan hücre ve moleküler tahlil transduced hücrelerde entegrasyonu hazırlanması rapor edilmektedir.

Özet

Uyuyan güzel (SB) transposon gen transferi ve fonksiyonel genomik için kanıtlanmış etkinliği ile viral entegre bir sistemdir. SB transposon makine en iyi duruma getirmek için bir transcriptionally düzenlenmiş hiperaktif transposase (SB100X) ve T2 tabanlı transposon istihdam edilmektedir. Genellikle, transposase ve transposon geçici plazmid transfection tarafından sağlanır ve SB100X ifade bir bünye düzenleyici tarafından tahrik edilmektedir. Burada, SB100X ifade denetlemek ve stabil bir gen ilgi (GOI) "kes ve Yapıştır" SB ile tümleştirmek için çeşitli fiziksel ve kimyasal transfection yöntemler dayanıklıdır insan hücreleri SB bileşenleri sunmak için verimli bir yöntem tarif mekanizma. Hiperaktif transposase ifade sıkı gen ekspresyonu 1992'den beri denetlemek için yaygın olarak kullanılan Tet-ON sistem tarafından kontrol edilir. Gen ilgi ters yineler (IR) T2 transposon tarafından çevrili olduğunu. Her iki SB bileşenleri arızalı lentiviral vektörler geçici HEK293T hücrelerinde üretilen entegre olarak paketlenir. İnsan hücreleri, hücre hatları veya Primer hücre insan dokusundan vitro geçici viral Vektörler ile transduced vardır. Doksisiklin (dox, tetrasiklin analog) ek kültür orta içine, üzerine bir transposase ifade ince ayar ölçülür ve gen tedavi hücre genomu ilgi uzun ömürlü entegrasyonunu sonuçları. Bu yöntem etkili ve uygulanabilir hücre kültürünü (örneğin, HeLa hücreleri) ve Primer hücre (örneğin, insan birincil lenfositi) ve böylece genetik mühendisliği ve tedavi gen transferi için değerli bir araç temsil eder.

Giriş

T2-esaslı transposon birleştiğinde hiperaktif SB100X transposase preklinik gen terapisi uygulamaları^1,2,3' te, genom değişiklikler^4,5, zaten kullanılmış ve İndüklenmiş pluripotent kök hücre (IPSC)^6,7yeniden programlama. Genellikle, SB bileşenleri geçici plazmid transfection tarafından sağlanır ve güçlü bir bünye organizatörü transposase ifade ediyor. Ancak, transfection gelişmiş yeni yöntemler rağmen birçok uygulama için bir meydan okuma iki bileşenli sistemi teslimini kalır. Böylece, yeni bir teslim iletişim kuralı geliştirilmesi artan ilgi vardır. Plazmid⁸ ve mRNA⁹transfection yöntemlerinin yanı sıra, viral teslim dayalı adenoviral^10,11, adeno ilişkili viral (AAV)¹², Baculovirus¹³, gammaretroviral¹⁴ ve lentiviral vektörler¹⁵ geçmişte önerdi. Özellikle, seçim sistemi viral vektör entegrasyonunu olmadan SB bileşenlerinin geçici bir teslimatlar garantilemelidir. Yine de, transposase kurucu ifade güvenlik kaygıları nedeniyle kontrol edilemeyen transposon rehopping riskini yükseltir.

Bu nedenle, bir rafine Tet-ON sistem tarafından transkripsiyon düzenleme SB100X, ilk mücadeledir. Herpes simpleks virüs-1 (HSV-1)¹⁶, Timidine kinaz (TK) gen en az organizatörü (-81) ile orijinal gelişmiş en az Sitomegalovirüs (CMV) düzenleyici yerine kullanarak elde edilen bir değiştirilmiş Tet-duyarlı organizatörü klonlanmış, ters yönde SB100X cDNA (pTetOTKSB100X). Mutasyona uğramış ters-tetrasiklin-transactivator rtTA2^s-M2¹⁷ farklı bir plazmid klonlanmış güçlü kurucu organizatörü (phosphoglycerate organizatörü, PGK) kontrolü altında ifade edilir (pCCL-PGKrtTA2^S-M2). Kültür ortamına eklendiğinde rtTA2^sdox bağlar-M2 modülatör ve karmaşık veya SB100X ifade¹⁸sıkıca düzenlenmiş indüksiyon sonuçlanan Tet organizatörü tethers.

İkinci büyük sorun insan Primer hücre verimsiz transfection çeşitli fiziksel ve kimyasal yöntemlerle ortaya çıkar. Transposase transfection, SB100X ve rtTA2^sdayanıklı insan hücrelerinde verimli bir şekilde teslim etmek-M2 ifade kaset iki Tümleştirme arızalı lentiviral vektörler (IDLVs)¹⁹paketlenir: IDLVTKSB ve IDLVrtTA2^s- M2. Viral vektörler geçici olarak üçüncü nesil vektörel çizimler HEK293T hücreleri²⁰ ve pseudotyped Vescicular Stomatit virüs (VSV-G), hangi enfeksiyon geniş bir yelpazede confers glikoprotein G ile üretilmektedir. Vektör parçacıklar tarafından ultrasantrifüj konsantre ve HIV-1 Gag p24 immunocapture tarafından titre. Hücre satırları ve Primer hücre transduce için vektör parçacıklar polybrene ile complexed ve hedef hücreleri ile dox içinde inkübe. SB100X ifade transduced hücrelerin aktivasyonu uyuşturucu bağımlı kantitatif RT-PCR (qRT-PCR)¹⁸tarafından ölçülür.

Tet düzenlenir SB100X ifadesi gösterdi sonra GOI (örneğin, yeşil flüoresan protein, GFP) transpozisyonu hedef hücre genomu içine Bak ve Mikkelsen²¹tarafından açıkça kapsamlıdır moleküler olayları izler. Üçüncü bir IDLV vektör taşıyan bir ifade kaset T2-transposon IRS (IDLVT2) arasında klonlanmış GOI için inşa ve yukarıda da belirtildiği gibi paketlenmiş vardır. Son olarak, üç IDLV vektörler verimli bir şekilde insan hücreleri (örneğin, birincil lenfositi) vitro transduce ve Doksisiklin¹⁸huzurunda GOI tümleştirmek için kullanılabilir.

Protokol

1. plazmid istihdam

Not: Plazmid pCCL-PGKrtTA2^S-M2 lütfen Prof. Zappavigna (üniversite, Modena ve Reggio Emilia, Modena, İtalya) tarafından sağlanan. Hiperaktif transposase kodlama dizisi taşıyan pCMVSB100X Plazmid ve pT2/BH transposon plazmid nazikçe Prof Z. Ivics (Paul Ehrlich Enstitüsü, Langen, Almanya) ve Prof. Dr. Z. Izvak (Max Delbruck Merkezi moleküler tıp, Berlin, tarafından verilmiştir Almanya).

1. Tüm klonlama için Escherichia Coli içinde (E. coli), klonlama strateji seçimi ve restriksiyon enzimi yordam veya PCR güçlendirme parçasının klonlanmış için izleyin.
   Not: Tablo 1 tüm bu protokol için istihdam plazmid özetler. Bir açıklama ve her plazmid için başvurular sağlanır.

2. viral vektör üretim

Not: Viral vektörler biohazard başlıklı bir düzeyde BSL2 Biyogüvenlik çevreleme, kurumsal kurallara ve düzenlemelere göre üretilmektedir.

1. Kültür yapisan HEK293T hücrelerde Dulbecco'nın modifiye kartal orta % 10 HyClone serum, 100 U/mL penisilin-streptomisin ve 2 mM glutamin ile desteklenmiştir.
2. 0. gün: beş 15 cm tabak/viral hazırlık ve tohum 5.5x10⁶ hücreler orta 30 ml hazırlayın.
3. 1. gün: Transfection
   1. Transfection başlamadan önce 2 x HEPES arabellek salin (HBS) 100 mL hazırlayın:
      NaCl (5 M) 5,6 mL
      HEPES (1 M) 10.0 mL
      Na₂HPO₄ (0, 5 M) 0.3 mL
      Steril su 84,1 mL
      PH %7.1 37 ile uyum HCl.
      Not: 2 x HBS 4 ° C'de saklanabilir Tam bir pH verimli transfection için son derece önemlidir. 7.10-7.12 optimum pH aralıktır.
   2. Orta kaldırın ve 22,5 mL/tabak taze orta 4 h transfection önce ekleyin.
   3. HEK293T hücreleri transferi plazmid, pMD.Lg/pRRE.D64VInt ambalaj plazmid, zarf kodlama pMD2.G Plazmid ve pRSV-Rev (Tablo 1) aşağıdaki miktar/plaka göre transfect:
      Plazmid 25,00 µg transfer
      pMD.Lg/pRRE.D64VInt 16.25 µg
      pMD2.G 8,75 µg
      pRSV-Rev 6,25 µg
      Not: Plazmid DNA'lar Maniatis²² veya bir plazmid endotoksin ücretsiz arıtma seti kullanarak açıklanan CsCl protokolüne göre hazırlanır.
      1. DNA (4 plazmid karışımı) 56.25 µg 1,125 ml steril su resuspend ve 125 µL 2.5 M CaCl₂ (a çözüm) ekleyin.
      2. 2 x HBS 1.250 mL steril 15 mL konik santrifüj tüpü (çözüm B) ekleyin.
      3. Çözüm (1.250 mL) B (1.250 mL) dropwise köpüren yaparken 1 veya 2 mL pipet ile eklemek (transfection çözüm, Toplam hacim 2.500 mL).
      4. (RT) oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya.
      5. P1000 micropipette kullanarak, tüm hücre monolayer transfection çözümü (2.500 mL) dropwise dağıtın.
   4. Gecede bir hücre kültür kuluçka 37 ° c, % 5 CO₂kuluçkaya.
4. 2. gün: Orta kaldırın ve taze orta 15 mL ekleyin (bkz. Adım 2.1).
5. 3. gün: Toplamak ve lentiviral partikül içeren süpernatant konsantre.
   1. Tüm (~ 70 mL) süpernatant toplamak (n = 5) transfected hücre Kaplamalar, filtre PESS filtre ve 2 polyallomer tüpler (1 inç x 3,5 inç) doldurun 0,45 µm ile / viral hazırlık.
   2. Vektör parçacıklar tarafından ultrasantrifüj fren ile 15 ° C'de 2,5 h için 106,000 x g, konsantre ol.
   3. Hemen (Pelet tüp resuspension önlemek için) ultrasantrifüj, yavaşça durdurduktan sonra süpernatant % 10 çamaşır suyu içeren bir konteyner içine dökün ve 2 görünür zor granül 1 x PBS 100 µL içinde askıya alma (+ %1 BSA). Bu açık ve çok küçük Pelet olduğu gibi normaldir. Taze hazırlanmış veya aliquot konsantre vektör kullanın ve viral hazırlıklar-80 ° C'de depolayın
      Dikkat: Süpernatant iyice biohazard atık atılmadan önce ağartılmış gerekir lentiviral parçacıklar içerir.
6. Viral vektör hazırlık titre için üreticinin protokolüne göre HIV-1 Gag p24 immunocapture seti kullanın.
   Not: lipozomlar tabanlı reaktifler viral vektör üretim standartlaştırmak için istihdam olabilir. Yine de, viral vektör titresi yüksek transfection verimliliği ve plazmid DNA saflığı bağlıdır.

3. iletim insan hücre hatları (örneğin, HeLa hücreleri)

Not: HeLa hücreleri % 10 fetal buzağı serum, 100 U/mL penisilin-streptomisin ve 2 mM glutamin ile Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal ortamda kültürlenir. Tablo 1 tüm bu protokol için istihdam vektörel çizimler özetler. Her vektör için bir açıklama sağlanmıştır. HeLa hücreleri iletim iki IDLV vektörler iyi doz kombinasyonu SB transposase transkripsiyon Yönetmeliği doğrulanmasına izin verir. IDLV doz varyasyonu vektör parçacık titrasyon ve hedef hücre türü için ilgili olabilir.

1. 0. gün: 2 x 10⁵ için her şey bir 6-şey plaka orta 3 mL hücrelerde tohum. 4 kuyu hazırlayın.
2. 1. gün: İletim HeLa hücre.
   1. Her koşul için bir son hacim 1 mL orta lentiviral vektörlerinin seyreltik (yukarıdaki nota bakın), polybrene (son konsantrasyon 8 μg/mL) 10 μL huzurunda:
      Seyreltme de #1 için: transduced hücreleri (negatif kontrol) alay.
      Seyreltme için de #2: IDLVTKSB vektör (2.600 p24 ng).
      Seyreltme kuyuları #3 #4 için: IDLVTKSB vektör (2.600 p24 ng) + IDLVrtTA2^s-M2 vektör (9600 p24 ng).
   2. Nerede HeLa hücreleri gün 0 kaplama her kuyudan orta kaldırın ve lentiviral vektör dilutions için karşılık gelen de ekleyin.
   3. Spinoculate 6-şey plaka vasıl 754 x g 20-25 ° C ve sonra aktarmak 6-şey plaka bir hücre kültür kuluçka 37 ° C ve % 5 CO₂, 45 dk için.
   4. 6 h sonra bütün Wells taze orta orta içeren vektörel çizimler yerine ve Doksisiklin de 4 # 1 mikron ekleyin. Bir hücre kültür kuluçka 37 ° C'de 48 h için içine plaka koymak.
3. 3. gün: Hücre Pelet hazırlanması RNA çıkarılması için.
   1. Hücreleri ayırma önce tripsin çalışan bir çözüm (1 x) hazırlayın:
      % 2.5 tripsin (10 x) 5.0 mL
      500 mM EDTA (son konsantrasyonu 5 mM =) 0.5 mL
      PBS 44.5 mL x 1
   2. Sıcak tripsin çalışma çözüm kullanmadan önce 37 ° C'de. Tripsin çalışma çözüm 4 ° C'de depolayın
   3. Orta kaldırmak ve hücreleri 1 x PBS ile yıkayın. Her şey için 0.5 mL Önceden ısıtılmış 37 ° C tripsin çalışma çözeltisi ekleyin ve 7 dakika (içinde bir hücre kültür kuluçka) 37 ° C'de kuluçkaya.
   4. Kuluçka sonra 0.5 mL serum içeren ekleyin orta tripsin ve toplamak bir santrifüj tüpü hücrelerde devre dışı bırakabilirsiniz için her şey için. Her şey bir kez 3 mL 1 x PBS ile durulayın ve hücre süspansiyon için 240 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi.
   5. 5 mL 1 x PBS, santrifüj 240 x g de 5 min için de hücrelerle yıkayın ve süpernatant atın. Taze toplanan hücre topakları kullanın veya-80 ° C'de depolayın Toplam RNA yarı kantitatif RT-PCR gerçekleştirmek için çökeltilerini ayıklamak (bkz. Adım 6).

4. insan Primer hücre (örneğin, lenfositi) iletim

Not: İnsan birincil lenfositi öğrenirim radyasyonlu 3T3-J2 hücreleri (besleyici katman)²³, Yan Barrandon (EPFL, Lozan, İsviçre) bir tür hediye üzerine tohumlari.

1. Dulbecco'nın modifiye kartal % 10 donör sığır serum, 50 U/mL penisilin-streptomisin ve 4 mM glutamin (3T3 orta) ile desteklenmiş Orta İsviçre fare 3T3-J2 hücrelerinde büyür.
2. Öğrenirim radyasyonlu 3T3-J2 hücreleri cFAD orta, bir Dulbecco'nın modifiye kartal orta ve Ham'ın F12 medya karışımı (3:1) içeren fetal sığır serum (% 10), penisilin-streptomisin (% 1), glutamin (% 2), insülin (5 µg/mL), adenin (kaplama lenfositi büyümek 0,18 mM), hidrokortizon (0.4 µg/mL), kolera toksin (0,1 nM) ve triiyodotironin (2 nM).
3. 0. gün: Tohum 3 x 10⁵ öğrenirim 3T3-J2 hücreleri, daha önce her iyi 6-şey plaka 1 X 10⁵ hücre/mL, son bir konsantrasyon 3T3 orta içine seyreltilmiş ışınlanmış. 9 kuyu hazırlayın.
4. 1. gün: İletim birincil keratinositler
   Not: Lenfositi iletim miktar SB transposase transkripsiyon Yönetmeliğin iki IDLV vektörler iyi doz kombinasyonu (tarafından qRT-PCR) sağlar ve entegrasyon, GOI (GFP) hedef hücrelerdeki (cytofluorimetric tarafından doğrulamak için analizi).
   1. Hücreleri ayırma önce tripsin çalışma çözüm hazırlayın:
      %0.5 tripsin-EDTA (10 x) 5.0 mL
      500mM EDTA (son konsantrasyonu 5 mM =) 0.5 mL
      PBS 44.5 mL x 1
   2. Sıcak tripsin çalışma çözüm kullanmadan önce 37 ° C'de. Tripsin çalışma çözüm 4 ° C'de depolayın
   3. Kültür subconfluent keratinositler ayırmak için orta kaldırın, 1 x PBS hücrelerle yıkayın ve her şey için 1 mL Önceden ısıtılmış tripsin çalışma çözeltisi ekleyin. Hücre kültür kuluçka 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya.
   4. Kuluçka sonra bir de hücrelerin resuspend iyice ve hücre süspansiyon 2 mL serum içeren içeren bir santrifüj tüpü transfer orta (37 ° C'de ek bir min için hücrelerin çoğu hala iliştirilmişse, kuluçkaya). Her biri de bir kez 3 mL 1 x PBS veya taze orta durulama ve hücre süspansiyon ile santrifüj tüpü durulama çözüm ekleyin.
   5. 580 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
   6. 5 mL 1 x PBS, santrifüj 580 x g de 5 min için de hücrelerle yıkayın ve süpernatant atın.
   7. Polipropilen 15 mL tüp içinde 1.6x10⁵ lenfositi cFAD orta, her koşul için bir seyreltme 1 ml seyreltik.
   8. Lentiviral vektörler cFAD orta polybrene (8 µg/mL 2 mL son hacmi, son konsantrasyonu) 20 μL huzurunda 1 ml seyreltik:
      Dilutions kuyu #1, #2, #3 için: transduced hücreleri (negatif kontrol vektörel çizimler olmadan) alay.
      Dilutions kuyu #4, #5 için: IDLVTKSB vektör (13.000 p24 ng) + IDLVrtTA2^s-M2 vektör (48.000 p24 ng).
      Dilutions için kuyu #6, #7, #8, #9: IDLVTKSB vektör (13.000 p24 ng) + IDLVrtTA2^s-M2 vektör (48.000 p24 ng) + IDLVT2 vektör (9,160 p24 ng).
   9. Süspansiyon hücrelerde her lentiviral vektör seyreltme (1 mL) ekleyerek ilgili keratinosit süspansiyon (1 ml 1.6x10⁵ lenfositi) transduce.
   10. Orta gün 0 ve transduced plaka keratinositler (1.6x10⁵ lenfositi 2 ml) onları üzerine numaralı seribaşı öğrenirim radyasyonlu 3T3-J2 hücreleri kaldırın. Transducing sonra bir de diğeri ile devam edin.
   11. 25 ° c 30 dk için kuluçkaya ve sonra 37 ° c 6 h hücre kültür kuluçka hücreleri aktarın.
       Not: canlılık ve nükleer silahların yayılmasına karşı şiddetle etkilenir değil spinoculate birincil keratinositler, yap.
   12. 6 h sonra her şey için cFAD orta 1 mL ekleyin. 1 mikron Doksisiklin (son konsantrasyonu) kuyu #5, #8 ve #9 ekleyin. Dönüş hücreleri ile 37 ° c
5. 2. gün: 3 mL 10 ng/mL EGF ile KC orta cFAD orta yerine.
6. 3. gün: Trypsinize ve hücreleri (bkz: 4.4.1-4.4.6) daha önce açıklandığı gibi #5 #1 ve #4 kuyulardan yıkayın. Hücre topakları qRT-PCR analiz için toplam RNA ayıklamak için-80 ° C'de dondurmak (bkz. adım 7).
7. 4.4.1-4.4.5 adımlarda açıklandığı gibi hücreleri de #2, #6 ve #8 trypsinize ve cytofluorimetric çözümlemesi GFP ifade için (bkz. Adım 5).
8. En az 3-4 doublings, un tümleşik IDLVT2 vektör (5 gündür besleyici katman üzerinde kaplama insan birincil lenfositi) sulandırmak için yeterli için #3 ve #7 #9 kuyulardan kültür tutun.
9. 6. gün: Yaklaşık 5 gün iletim sonrası, kuyu #3 ve #7 #9 GFP ifade için cytofluorimetric analiz yapmak (bkz: adımları 4.4.1-4.4.5) hücrelerden trypsinize (bkz. Adım 5).
   Not: Deney zamanlama ve iletim verimliliği son derece etkiledi birincil hücre türüne göre ve toplanan örnekleri değişkenliği tarafından.

5. Cytofluorimetric analiz transduced birincil lenfositi üzerinde

Not: mavi lazer ile yapılandırılmış bir Akış Sitometresi (488 nm), kırmızı bir lazer (633 nm) ve GFP ve APC Floresans tespiti istihdam için filtreler ( Malzeme tabloyabakın).

1. Etiket transduced keratinositler 3 gün ve gün (bkz. Adım 4.7 ve 4,9) 6 ile müstakil fare monoklonal APC lenfositi 3T3-J2 besleyici katmandan ayırımcılık için-konjüge Anti-besleyici antikor.
   1. Her örnek için tampon boyama 4 mL hazırlayın:
      %5 FBS 200 μL
      500 mM EDTA (son konsantrasyonu 2.5 mM =) 20 μL
      PBS 1 x 3780 μL
   2. Müstakil hücreleri arabellek boyama 1 mL ile yıkayın. 580 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
   3. Akış Sitometresi Alım için bir tüp, 5 x 10⁴ boyama arabelleği 100 μL hücrelerde resuspend ve anti-besleyici antikor (1:50) 2 μL ekleyin. Mix iyi ve karanlıkta buzda 30 dk için kuluçkaya.
   4. 30 dakika sonra arabellek boyama 2 mL ile yıkayın. 580 x g de 5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. 200 μL arabellek boyama resuspend.
   5. APC ve GFP sinyalleri cytofluorimetric analiz¹⁸tarafından elde. APC^- hücre nüfusun GFP⁺ hücre kısmı transduced keratinositler gösterir.
      Not: arzu edilirse, lekeli örnek Akış Sitometresi önce PBS 1 %2 paraformaldehyde ile düzeltmek x ve mağaza koşmak kadar karanlıkta 4 ° C'de.
2. GFP⁺yüzdesi arasındaki oran komplo tarafından Akış Sitometresi verileri analizhücreleri (5 gün) bitiş noktası ve GFP⁺yüzdesihücreleri 2 gün sonrası IDLVT2 transduced kalan seviyesine normalleştirilmiş iletim, hücreleri.

6. yarı kantitatif RT-PCR

Not: bir PCR termal cycler kullanın.

1. RNA üzerinden transduced veya üreticinin protokole göre bir RNA arıtma seti kullanarak hücreleri kontrol toplam ayıklayın.
   Not: Toplam RNA-80 ° C'de saklanabilir
2. CDNA 100 kullanarak bir 20 µL tepki olarak sentez ng toplam RNA ve üreticinin protokolüne göre bir ters transkriptaz kit.
   Not:-20 ° C'de cDNA saklanabilir
3. Tasarım astar SB100X için rtTA2^sbelirli-M2 ve GAPDH (bir temizlik gen).
   Önerilen Tasarımlar:
   SB ileri astar: 5'-GCCACTCAGCAAGGAAGAAG-3'
   SB ters astar: 5'-GTGTTGGAAGACCCATTTGC-3'
   rtTAM2 ileri astar: 5'- GACGACAAGGAAACTCGCTC-3'
   rtTAM2 ters astar: 5'-TTACCCGGGAGCATGTCAA-3'
   GAPDH ileri astar: 5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3'
   GAPDH ters astar: 5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'
4. PCR 50 µL son tepki hacmindeki gerçekleştirin. Özellikle, aşağıdaki reaksiyon her PCR tüpün montajı:
   cDNA (1:5 seyreltme) (Kimden adım 6.2) 1,00 µL
   İleri astar (10 µM hisse senedi) 1,00 µL
   Astar (10 µM hisse senedi) ters 1.00 µL
   dNTPs (10 µM hisse senedi) 1,00 µL
   Tampon (+ MgCl₂) (10 x hisse senedi) 5,00 µL
   Taq polimeraz (5 U/µL hisse senedi) 0,25 µL
   Steril su 40.75 µL
5. Termal cycler aşağıdaki programı kullanın: 1 döngüsü 95 ° C'de 5 dakika sonra devam etmek için 30 95 ° C ile s, 30 58 ° C s ve 30 72 ° C s SB100X için 34 döngü için 32 döngüleri için rtTA2^s-M2 ve GAPDH 25 devredir.
6. % 1'özel jel hazırlayın. Özel TBE 1 100 ml (steril suda seyreltilmiş 10 x hisse senedi), x 1 g bir kabı veya cep şişesi geçiyoruz. Özel tamamen eriyene kadar her dakika dönen bir mikrodalga fırında kavrulur. Yaklaşık 50 ° C ulaşıncaya kadar eritilmiş özel serin ve etidyum bromür (10 mg/mL stok) 5 µL ekleyin. Erimiş özel jel döküm için bir tarak monte jel tepsiye dökün.
7. Örnekleri (10 µL her) özel jel üzerinde yük ve Elektroforez gerçekleştirin.
8. İstenirse, jel resmi alacak ve PCR bantları üzerinde densitometric çözümlemesi gerçekleştirin.

7. kantitatif RT-PCR (qRT-PCR)

Not: Ticari bir sıra algılama sistemi istihdam edilmektedir. PCR astar ve 6-carboxyfluorescein (FAM) prob gliseraldehit 3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) için ticari olarak satın alınır.

1. Retro-transkripsiyon için bkz: adım 6.2.
2. Astar tasarım ve SB100X için özel yoklama için yazılımı kullanın.
   Önerilen tasarım:
   SB.2 ileri astar: 5'-GAAGAAGCCACTGCTCCAAAA-3',
   SB.2 ters astar: 5'-CCCCATGTGCAGTTGCAA-3'
   SB FAM yoklama: 5'-CATAAGAAAGCCAGACTACGG-3'
3. Gerçek zamanlı PCR 96-şey pilakalar ve PCR Master Mix gerçekleştirmek ve astar + sonda karıştırın, 25 µL son tepki hacminde. Özellikle, aşağıdaki reaksiyon için her şey göz önünde bulundurun:
   cDNA (1:10 seyreltme steril su) 1,00 µL
   2 x Master Mix 12,50 µL
   Astar + 20 x sonda 1,25 µL mix
   Steril su 10.25 µL
   Not: Bütün tepkiler nüsha gerçekleştirin. Pipetting hataları önlemek için en az n + 3 reaksiyonlar (olmadan cDNA) için bir karışım hazırlayın. Bir çok kanallı pipet kullanarak aliquot.
4. Aşağıdaki programı kullanarak gerçek zamanlı PCR çalıştırın: 1 döngüsü 10 dk sonra 95 ° C 40 döngüleri için 95 ° C'de 15 s ve 60 ° C için 1 dk ve 4 ° C'de tutun
5. SB100X GAPDH aynı cDNA örnek düzeyi için göreli ifade (RQ değer) tipik veri analiz yazılımı kullanarak 2^-ΔΔCT miktar tarafından normalleştirme tarafından qRT-PCR veri analiz.

Sonuçlar

Yordamı kullanarak sunulan burada, üç IDLV vektörler düzenlenmiş SB bileşenleri taşıma (SB100X, rtTA2^S-M2 ve T2-GFP transposon) paketlenmiş ve verimli bir şekilde teslim ve sıkıca SB sistem insan hücrelerinde düzenlenmesi için kullanılır. Şekil 1A ( Tablo 2' de bildirilen) iki IDLV vektörler iyi doz kombinasyonu ile SB transposase transkripsiyon Yönetmeliği değerlendirmek için yapılan vitro iletim ...

Tartışmalar

Burada, stabil bir GOI genom Uyuyan güzeltarafından hedef hücrelerin içine entegre etmek için yaygın olarak erişilebilir bir metodoloji açıklayan-hukuka aracılı. SB sistem genom düzenlemek için nonviral bir yöntem sağlamak için geliştirilmiştir, verimli bir şekilde teslim (transposase ve T2 transposon) tümleştirme makinelerin zorunlu olsa da. Bu nedenle, SB sistem pek transfectable Primer hücre üzerinde kullanmak için viral SB bileşenlerinin teslimatlar son yıllarda^10<...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine	Lonza	BE12-614F	Cell culture medium.
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03	Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production.
Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml	Lonza	DE17-602E	Reagents for cell culture medium.
L-Glutamine 200mM	Lonza	BE17-605E	Reagent for cell culture medium.
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Reagent for HBS 2X preparation.
HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline	Lonza	BE17-737E	Reagent for HBS 2X preparation.
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5%	Merck	106580	Reagent for HBS 2X preparation.
Hydrochloric acid - ACS reagent 37% (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Reagent for HBS 2X preparation.
Sterile water for injection	Fresenius Kabi	-	Reagent for HBS 2X preparation.
0.45 µm PESS filter	Whatman	10462100	Filters used to remove cell debris from viral supernatant.
Polyallomer Beckman tubes	Beckman Coulter	326823	Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation.
PBS-1X w/o Ca, Mg	Lonza	BE17-516F	Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	(Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension.
HIV-1 Gag p24 immunocapture kit	Perkin Elmer	NEK50001KT	Kit for IDLV particle titration.
Polybrene	Sigma-Aldrich	107689	Reagent to enhance transduction efficiency.
Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg	GIBCO	BE17-160E	Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted).
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)	100938B	AnalaR BDH	Reagent for trypsin working solution preparation.
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X)	GIBCO	15400-054	Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted).
Donor Bovine Serum, New Zealand Origin	GIBCO	16030-074	Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer).
Ham’s F12 media	GIBCO	21765	Medium for keratinocytes.
Fetal bovine serum	Lonza	DE14-801F	Serum for HeLa cell culture medium.
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin	GIBCO	10099-141	Serum for human primary keratinocyte culture medium.
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I5500	Reagents for keratinocyte growth.
Adenine	VWR	1152-25	Reagents for keratinocyte growth.
Hydrocortisone	VWR	3867-1	Reagents for keratinocyte growth.
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	Reagents for keratinocyte growth.
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T5516	Reagents for keratinocyte growth.
Human EGF	Austral Biological	GF-010-9	Reagents for keratinocyte growth.
Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody	Miltenyi Biotech	130-096-099	To label feeder layer.
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	RNA purification kit.
SuperScript III Reverse Transcriptase	Life Technologies	18080051	Reverse transcriptase kit.
Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP)	Sigma-Aldrich	D7295	Reagent for semi-quantitative PCR.
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	(any)	-	Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR.
GoTaq G2 Hot Start Polymerase	Promega	M740B	Taq polymerase.
Agarose, for molecular biology	Sigma-Aldrich	A9539	Reagent for agarose gel electrophoresis.
UltraPure TBE Buffer, 10X	Invitrogen	15581028	Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510	Reagent for agarose gel electrophoresis.
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D-9891	drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystem	4304437	TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe.
15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile	Falcon Corning	352096	Tubes for cell collection and vector dilution preparation.
150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile	Falcon Corning	353025	Cell culture dish for viral production.
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile	Falcon Corning	353046	Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086	Tubes for dilution preparation.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL	Eppendorf	0030 120.094	Tubes for dilution preparation.
0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free	(any)	-	Tubes for semi-quantitative PCR.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL	Applied Biosystem	4346906	96-well for qRT-PCR.
5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap	BD Falcon	352052	Tubes for flow cytometry acquisition.
Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes)	(any)	-	Pipettes for sterile tissue culture applications.
Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes)	(any)	-	Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications.
pH meter	(any)	-	Equipment for measurement of HBS 2X pH.
PCR Thermal cycler	(any)	-	Equipment for semi-quantitative PCR.
Agarose gel electrophoresis equipment	(any)	-	Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2	BD	-	Flow cytometer.
7900HT Fast Real-Time PCR system	Applied Biosystem	7900HT	Equipment for qRT-PCR.
Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets.	(any)	-	Centrifuge for cell culture processing and spinoculation.
Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor	Beckman Coulter	-	Ultracentrifuge for lentiviral particle production.
Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 °C, -20 °C, -80 °C), micropipettes and pipet-aid).
Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction.