Farelerde frenik Motor nöronların retrograd nöroanatomik izleme

Özet

Burada, sonra intrapleural teslim fluorophore kolera toksini alt birim beta Birleşik frenik motor nöronlar farelerde belirlenmesi için bir protokol açıklayın. İki teknik plevral boşluğu enjekte etmek için karşılaştırılır: Transtorasik yaklaşımlar karşı transdiaphragmatic.

Özet

Frenik motor nöronlar servikal motor nöronlar en memeli türlerinde C6 düzeylere C3 kaynaklanan vardır. Aksonal projeksiyonlar solunum diyafram innerve frenik sinir gidiyor. Spinal kord dilimler halinde frenik motor nöronlar diğer motor nöronlar üzerinde morfolojik veya biyokimyasal ölçüt üzerinden tanımlanamıyor. Biz fare, bir fluorophore Birleşik kolera toksini alt birim beta (CTB) aşağıdaki intrapleural enjeksiyonu frenik motor nöron hücre gövdelerinde görüntülenmesi için yordamlar açıklamasını sağlar. Bu floresan nöroanatomik izleyici diyafram nöromüsküler kavşak yakalanmış, retrogradely frenik akson yapılacak ve frenik hücre cesetleri ulaşmak için yeteneği vardır. İntrapleural CTB teslimat iki metodolojik yaklaşım karşılaştırılır: Transtorasik iğne karşı transdiaphragmatic. Her iki yaklaşımın başarılı ve frenik motor nöronlar CTB etiketli benzer sayıda neden. Sonuç olarak, bu tekniklerin görselleştirmek veya bu diyafram frenik devre üzerinde duruldu gibi çeşitli deneysel çalışmalar frenik motor nöronlarda ölçmek için uygulanır.

Giriş

Çalışmanın amacı frenik motor nöronlar (PhMN) fare omurilik bölümlerinde tanımlamak için güvenilir bir yöntem sunmaktır. Bir floresan nöroanatomik izleyici plevral boşluğunda enjeksiyon frenik akson boyunca retrograd taşıma frenik hücre organları etiketlemek için kullanın ve frenik nöromüsküler projeksiyonlar üzerine diyafram ulaşmak için Teslimat yöntemi olarak seçildi. İntrapleural teslimat iki teknikleri açıklanmıştır: Transtorasik karşı transdiaphragmatic.

Frenik motor nöronlar olan akson sonuçta diyafram innervate frenik sinir yakınsama spinal geçiş hücrelerdir. Bu alt motor nöronlar inspiratory sürücü dan bulber solunum merkezlerinin alma ve diyafram sinir-kas kavşak (NMJ) geçişi vardır. PhMN içine iki motor sütun, bir Servikal Omurga çalışan her hemicord için yapılandırılmış. Memeli tür insanlar dahil çoğunda, frenik motor sütunları C3 düzeylerinden C6^1,2,3' e yaymak. Biz ve diğerleri PhMN C3-C5 düzeylerinde fare ve fare omurilik^4,5,6,7,8yoğunlaşmıştır doğruladı. Topografik dağıtım frenik hücre değil rastgele; motor nöronlar krural bölümü innerve daha Kaudal (C5)⁹ise motor nöronlar diyafram göğüs parçası innerve daha yoğun frenik tamirhanede (C3), kafatası parçası olarak dağıtılır. Ayrıca, PhMN kümelenmiş değişik ventral boynuz bu gri konuda. C3 düzeyinde frenik hücre kümeleri yanal yalan, daha sonra ventrolateral bir yönde kayması ve en Kaudal düzeyleri¹⁰,^,11ventromedially bulunur.

Kendi hayati rol ilham sırasında göz önüne alındığında, bu doğru bir şekilde PhMN sağlıklı omurilik tanımlamak ama Ayrıca dejeneratif hastalıklar veya omurilik travmatik yaralanmalar gibi patolojik koşulları sırasında kendi kaderini takip için son derece önemlidir. Beri morfolojik servikal diğer motorlu neurons PhMN farklı değildir, PhMN tanımlaması nöroanatomik izleyicileri ya düzeyinde birincil solunum merkezleri⁸, ya da diyafram NMJ⁷ ya da hedeflenen teslimini kullanır frenik sinir⁴. İzleyici sinir lifleri tarafından alınan ve Servikal Omurga frenik hücre gövdelerinde kadar yapılan doğrudan veya dolaylı tespit sistemleri kullanarak görüntülenmeyecektir nerede. Retrograd veya anterograd izleyiciler ticari geniş conjugates bir ile mevcuttur. Önemli, her izleyici no ile donatılmış olan trans sinaptik izleme için düşük veya yüksek yetenekleri.

Mevcut çalışmada, Alexa Fluor (bundan böyle CTB-fluorophore da adlandırılır) 555 ile functionalized kolera toksini (CTB) beta altünitesi floresan bir etiket olarak PhMN donmuş omurilik bölümlerinde doğrudan bir görselleştirme izin seçtik. Deneysel verilerin bir transneuronal geçit¹²göstermek eğiliminde olmasına rağmen CTB genellikle monosynaptic bir izleyici tanımlanır. CTB GM1 gangliosid sinir biten plazma zarı bağlamak için yeteneğine sahiptir. CTB clathrin bağımlı - bağımsız mekanizmaları ve trans-Golgi ağ üzerinden trafik üzerinden bir retrograd moda^13,14endoplazmik retikulum içine içselleştirilmiş. İçselleştirilmesi ve retrograd taşıma bağımlı aktin sitoiskeleti^15,16 yanı sıra Mikrotubul ağ¹⁷gibi görünüyor.

CTB kullanışlılığı diyafram-PhMN devresi etiketleme retrograd nöroanatomik izleme aygıtı olarak göstermek CTB-fluorophore intrapleurally teslim edildi. CTB yönetilen iki teknikleri kullanarak: İlki dahil laparatomi ve birden çok transdiaphragmatic iğneleri; İkincisi, daha az invazif bir benzersiz Transtorasik iğne kullanılır. Dört gün sonra fluorescently etiketli PhMNs servikal spinal kord her iki sağlıklı ve spinally yaralı (C4) hayvanlardan sayılabilir.

Protokol

Deneysel protokol Avrupa Toplulukları Konsey direktifleri ile uyumlu hayvan için (2010/63/AB, 86/609/EEC ve 87-848/EEC) yapılan ve hayvan Etik Komitesi, üniversite Namur tarafından (etik proje n ° 17-284 kabul edildi ). Şekil 1 gösterir iki ilgili yaklaşımlar: transdiaphragmatic veya Transtorasik iğne. Erkek C57bl/6J fareler kullanın (n = 18), 4 ay çalışma 3 yaşında.

1. CTB çözüm hazırlanması

1. Transdiaphragmatic enjeksiyon için:
   1. %0,2 (w/v) konsantrasyonu için steril su CTB iktidarda geçiyoruz.
   2. CTB çözüm (% 0,2 w/v) 7.5 µL bir steril 10-µL-microsyringe içinde her fare için ekli bir 33'lik iğne (künt veya kısa konik) yükleyin.
2. Transtorasik enjeksiyon için:
   1. Steril su konsantrasyonu % 0.1 (w/v) CTB iktidarda geçiyoruz.
   2. CTB çözüm (% 0,1 w/v) steril bir 500-µl-insülin şırınga 20 µL eğimli 27 lik bir iğne her fare için yükleyin.
      Not: distile ve steril su kullanmaya dikkat edin ve düzgün CTB toz geçiyoruz. Çözüm 4 ° C'de bir ay tutulabilir (değil dondurma). Birkaç gün sonra bir çökelti şeklinde. Çözüm oda sıcaklığına getirmek ve iyi bir pipet kullanmadan önce kullanarak karıştırın.

2. Intrapleural enjeksiyonu öncesinde hazırlık

1. Otoklav veya cam boncuk Sterilizatör kullanarak ameliyat öncesi cerrahi .aletleri sterilize. Bir temiz tezgah kat ameliyatı yapmak ve cerrahi araçlar imha etmek hazırlamak.
   Not: cerrahi işlem sırasında kullanılan herhangi bir malzeme steril olmalıdır. Microsyringe bir dezenfektan (klorheksidin) silmiş ya da olması gerektiği gibi sterilize cant araçlar tek sadece kullanımı. Cerrah ameliyat başlamadan önce bir dezenfektan (klorheksidin bodur) ile onu/onun ellerini yıkamalısın. Cerrah steril eldiven, bir sağlamlılık ve temiz bir elbise giymek gerekir.
2. Hayvan tartmak ve anestezi uygun bir doz: anestezi kokteyl mayi enjeksiyon (örneğin ketamin 100 mg/kg ve xylazine 5 mg/kg).
3. Ayak çimdik ve/veya fare düzgün anestezi olup olmadığını belirlemek için palpebral refleks kaybı için kontrol edin. Kornea korumak için bir veteriner merhem uygulamak.
4. Dikkatle ventral cilt (için transdiaphragmatic yordam) veya elektrikli saç kesme makineleri kullanarak sağ taraflı göğüs cilde (Transtorasik yordam), tıraş. İyi ve yeterince geniş saç cerrahisi alanına alma önlemek için tıraş.
5. Aseptik koşullar traş alan üzerinde % 10 iyot çözümün topikal uygulama tarafından emin olun. Cerrahi sitesi çevre doğru sitesinin Merkezi'nden fırçalayın için dikkatli olmak iyot solüsyonu ile fırçalayın.
6. Hayvanın vücut ısısını korumak için ameliyat homeothermic takımını kullanın.

3. Intrapleural Transdiaphragmatic yaklaşımı kullanarak enjeksiyonları

1. Bir Isıtma yastığı sırtüstü pozisyonda imzalat fare yatırmak. Hayvan boyun altında bir haddelenmiş gazlı bez yastık yerleştirin. Yetişkin bir fare için bir haddelenmiş gazlı bez takımını 0,5 inç kalınlığında kullanın. Hareket varsa önlemek için ameliyat yönetim kurulu bu yastık teyp.
2. Bir neşter bıçak kullanarak deşmek orta çizgi boyunca ventral Cilt: deri gerin için yanal diğer el ile cilt germe sırasında xiphoid işleminden göbek bölgesine bir kesi yapmak. Çok fazla baskı üzerinde bıçak temel organlara zarar görmesini önlemek için geçerli değildir.
3. Küçük makas kullanırken, dikkatle cilt kesi çevresinde karın kasları bağlantısını kesin. Bu yordam, kasları ve ameliyat sonunda ayrı deri dikiş yardımcı olur.
4. Laparotomi küçük makas kullanarak gerçekleştirin. Karın boşluğu bir ilik kesi abdomenden düzeyde gerçekleştirerek açın. Beyaz hattı boyunca karın kasları deşmek ("linea alba") xiphoid süreci kadar.
5. Diyafram karın yüzeyine görselleştirmek için karın kasları ticari veya ev yapımı traktör kullanarak geri çek.
   Not: Bu makaralara MIDI-boyut ataç L-kanca¹⁹şeklinde yapılabilir.
6. Laparotomi ve bantlar makaralara tezgah kat için aşağı her iki uzatmayayeltenmişti. Görüş alanı aydınlatma diyafram karın yüzeyine penumbra içinde daha fazla en iyi duruma. Bu amaçla en güçlü aydınlatma aygıtının yönlendirilebilir bir ışık demeti ile LED Lamba vardır.
7. Yumuşak cımbız bir elinde kullanarak, xyphoid ek kaldırın ve karaciğer (şekil 2A) yan lobları çekin. Diğer elinde küçük makas kullanırken dikkatle kesin suspensory bağ safra kesesi veya diyafram (şekil 2B) zarar vermeden.
8. Yumuşak cımbız bir elinde kullanarak, xyphoid ek kaldır. Öte yandan Hamilton şırıngada kavramak. Üç siteleri değil hemidiyafram sırasıyla sternal, kapsayacak şekilde yerleştirmeye medial ve krural bölgeler (şekil 3A,) şekil 3B' iç metin hedef.
9. Diyafram kalınlığı 0.37 mm fareler⁷civarında, iğne en fazla 1 veya 2 mm ötesinde sırasında nefes akciğer zararları önlemek için diyafram sayfası eklemek. 2.5 µL CTB çözüm (% 0,2 w/v), her sitede (şekil 4B) doğru diyafram aracılığıyla teslim. Diyafram istikrar gerekli değildir.
10. Üç Ipsilateral siteleri enjeksiyon (şekil 1A) ve contralaterally bir ikili PhMN havuzu etiketleme için bu yordamı yineleyin.
11. Laparotomi sitesini kapatmak için 4-0 dikiş karın kasları ile tekrar Emilebilen dikiş. Kesintiye uğramış dikiş 3 mm. tarafından elyaf cilt aralıklı kullanım 9.0 mm yara klipleri ile kapalı. Zımba zımba çekerek hayvan önlemek için sıkın. Alanı yaklaşık 5 mm ayrı zımba. Bu Engelli şifa için açabilir gibi yara klipler, aşırı sıkın değil.
12. Temiz mikro şırınga tıkanma distile su ile. Yavaş yavaş çizme ve sınırdışı 2 - 3 kez. Hava şırınga çekiyor mu.

4. Intrapleural Transtorasik yaklaşımı kullanarak enjeksiyon

Not: Bu yöntem fareler⁴ ' te açıklanan yordamı gelen ilham ve fare için uyarlanmıştır.

1. İmzalat fareyi sol yanal dekübitus getirin, bir Isıtma yastığı (şekil 4A) yatırmak.
2. Altıncı ve yedinci kaburga dirsek bölgesi altında el ile palpasyonla (şekil 4B) tanımlayın.
3. Asistan sağ ön ve arka bacaklarda (şekil 5A) genişletir iken, şırınga cranially odaklı ve yüzeysel altıncı veya yedinci kaburga, 3 mm derin (şekil 1B ve şekil 5B) aşağı eğim ile deri altında yerleştirin.
4. Yavaşça, kaburgaları kaldırarak bu iyi göğüs boşluğuna (şekil 5C, insets içinde şekil 1B) içine konumlandırılmış onaylamak için iğne yükseltmek.
5. Göğüs duvarı üzerinde iki parmak ile hafif basınç uygulayarak göğüs hareketleri nefes stabilize etmek.
6. Şırınga diğer elinde tutarak, tek bir enjeksiyon CTB çözüm (% 0,1 w/v) 20 µL teslim.

5. ameliyat sonrası bakım

1. İşlemden sonra hemen, fareyi sağ yanal dekübitus pozisyonda kurtarma için homeothermic bir yastık üzerinde yatıyordu. Bu plevral boşluğu sağ tarafta yayıldı izleme sağlar ve hayvanın nefes izlenmesi için izin verir.
2. 1 mL steril serum fizyolojik çözüm ı.p. subkutan yönetmek. Hayvan susuz ve/veya ilgisiz görüntülenirse takip enjeksiyon sağlar.
3. Subkutan 0.1 mg/kg buprenorfin, yönetmek herhangi bir potansiyel ağrı en aza indirmek için ilk iki gün sonrası ameliyat sırasında günde iki kez.
   Not: Birçok kurum multimodal analjezi burada tasvir laparotomi gibi invaziv prosedürler için tavsiye ederim. Bu bir non-steroid anti-enflamatuar (NSAİİ) ilaç ve/veya lokal anestezik Ajan kesi yerinde kullanımı içerebilir. Bu ilaçlar genellikle kurmalı ağrı en aza indirmek için belgili tanımlık ilk kesme önce teslim edilir.
4. Hayvanlar her gün ötenazi kadar izlemek.

Sonuçlar

Erkek C57bl/6J fareler (n = 18), 4 ay 3 yaşlı çalışmaya dahil edildi. Denemenin gün 0, 8 fareler yayımlanmış protokolü^7,18göre bir tek taraflı C4 kontüzyonu, sağ taraflı uygulandı. Sham prosedür olarak C4 üzerine bir laminektomi kontüzyonu olmadan 10 fareler uygulandı. Gün 3, fareler CTB-fluorophore intrapleural enjeksiyonu için yukarıda açıklanan iki farklı yordamlara göre hazırlanmıştır. Gün 7, t?...

Tartışmalar

Burada açıklanan protokol yetişkin fareler herhangi bir zorlanma veya diyafram-PhMN devresi bütünlüğünü değerlendirilmelidir deneysel herhangi bir paradigma için uygulanabilir. Örneğin, amyotrofik lateral skleroz (ALS) ve servikal Medulla Spinalis Yaralanmalarında (CSCI) PhMN kaybı, frenik akson ve sonraki solunum uzlaşma anterograd dejenerasyonu ile ilişkilendirilmiş koşullardır. ALS veya CSCI hayvan modelleri insan hastalıkları gözlenen histopatolojik ve fonksiyonel solunum açıkları taklit. Bu...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass-bead sterilizer Steri 250	Keller	31-101
Small scissors	F.S.T.	14058-00
Soft tweezers	F.S.T.	11042-08
Scalpel blades	Swann Morton	No.11 or 15
Cholera toxin subunit beta conjugated to Alexa Fluor 555	Life Technologies	C22843	Bring at room temperature before use
10ul Hamilton syringue, removable needle	Sigma-Aldrich	701RN
33-gauge needle for Hamilton syringue, 20mm length, point style 4	Filter Service	7803-05
500ul insulin syringue MyJector, 27-gauge	Terumo	BS05M2713
Orientable LED lamp	V.W.R.	631-0995
Resorbable 4/0 sutures	S.M.I. AG	15151519
Needle holder	F.S.T.	12002-14
9mm autoclips	Bioseb	205016
Autoclip 9mm applier	Bioseb	MikRon 9mm