Endotel hedefleme için Functionalized 10-nm polimer kaplı altın parçacıkları ve ilaç dağıtım sentezi

Özet

Poli etilen glikol kaplama yüzeyine tarafından functionalized Biyouyumlu 10 nm altın nano tanecikleri, sentezleme yöntemi açıklanmaktadır. Bu parçacıklar kullanılan vitro olabilir ve tedavi için Nano hücresel ve hücre dışı alanlarda teslim etmek için in vivo geleneksel nanopartikül boyutları ile erişim için zor.

Özet

Altın nano tanecikleri (AuNPs) kapsamlı tıbbi araştırma boyutu, Biyouyumluluk ve değiştirilebilir yüzey nedeniyle kullanılmaktadır. Özel hedefleme ve ilaç teslim bu AuNPs ama endotel hücre dışı matrisler savunma özellikleri çamaşır sepetinden parçacık alımını uygulamaları bazılarıdır. Bu sorunu gidermek için özelleştirilebilir fonksiyonel gruplar ve daha fazla ayarlamalar için polimer uzunlukları ile vasküler teslim geliştirmek ultrasmall altın nano tanecikleri için bir sentez yöntemi açıklanmaktadır. İletişim kuralı verimleri 2.5 nm tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium klorür (THPC) ile şapkalı AuNPs. THPC yerine heteroseksüel fonksiyonel polietilen glikol (PEG) AuNP yüzeyi ile 10.5 için hidrodinamik yarıçapı artar yüzeyinde çeşitli Fonksiyonel grupların sağlarken nm. Protokol son bölümünü nanopartikül alımını izlemek için Floresans altında görüntülenmeyecektir AuNPs izin vermek için bir fluorophore isteğe bağlı bir ek içerir. Diyaliz ve lyophilization arındırmak ve AuNPs izole etmek için kullanılmıştır. Bu floresan nano tanecikleri görüntülenir içinde in vitro ve in vivo deneyler Biyouyumlu nedeniyle içinde PEG kaplama ve floresan sondalar. Ayrıca, bu nano tanecikleri boyutu aralığını render onları ideal bir aday gelişmiş teslimi ve tedavi neden olabilir normal damarlara işlevi aksatmadan glycocalyx problama için.

Giriş

Nano tanecikleri uygulanan ilaç dağıtım ve görüntüleme yeteneğini faiz^1,2alanları hedef ulaşmak için vücuda gezinmek. Parçacıklar tümörler sızan damarlara üzerinden içinde birikir veya hedef ligand nerede overexpressed ve maruz için yerelleştirmeniz. Altın, özellikle ulaşım ve tedavi³sürümü etkileyen benzersiz kimyasal ve fiziksel özellikleri nedeniyle bir sık kullanılan nanopartikül malzeme haline gelmiştir. Altın yüzeyi için thiols bağlamak için değiştirilebilir çünkü bir etkili nanopartikül malzeme ve düşük toksisite⁴nedeniyle yüksek Biyouyumluluk vardır. AuNPs büyük biyomoleküler uyuşturucu taşıyıcılarının olma yeteneğine sahip ve^2,4hedefleme için olumlu olmak AuNPs izin peptidler, nükleik asitler ve protein, teslim başarılı olmuştur.

Ne yazık ki, nanopartikül ilaç teslim etkinliğini en memeli hücre membran üzerinde ekstraselüler ceket ve gözenek boyutları 7 nm^5,6olduğu olumsuz ücret glycocalyx tarafından engel olmuştur. Bu gözenek boyutu tipik çapı 50-200 nm arasında değişen var en nanopartikül uyuşturucu taşıyıcıları küçüktür. Hastalık koşullar altında bu glycocalyx gözenekleri endotel hücrelere aracılığıyla geçirgenliği artan bozulma nedeniyle daha büyük hale. Ancak, çoğu nano tanecikleri hala glycocalyx bu yapısal değişim yararlanmak için fazla büyüktür. Bu boyutu uyuşmazlığı bir dolaylı geleneksel ölçekli parçacıklar olumlu kan damarları satır endotel hücreleri ile etkileşim değil ki bu. Bu intravenöz yönetilen parçacıklar teslim endotel içine etkiler ve parçacık taşıma ile kan beyin bariyerini^7,8,9,10da söylenebilir.

Bu konu ile mücadele için bir yaklaşım glycocalyx küçük gözenekleri geçmesine daha küçük parçacıklar kullanmaktır. Burada, hangi normalde olduğu gibi sağlıklı glycocalyx tarafından deterred bir 10.5 nm ultrasmall altın nanopartikül, sentez. Nanopartikül güvenliğinin aşılmasına glycocalyx başladıktan sonra artan gözenek boyutu ile hücreleri kolayca nüfuz. Bu kağıt protokolünde ultrasmall altın çekirdek Biyouyumluluk arttıran ve sistemik izni⁴azaltır PEG ile kaplı bir sentezi ayrıntıları. PEG konjugasyon ligandlar, fluorophores ve tedavi hedefleme için yollar açma fonksiyonel gruplar, çeşitli türleri de içerebilir. Daha önce yayımlanmış sonuçları ultrasmall bu nano tanecikleri kesintiye endotel glycocalyx işlevi bölgelerde bile herhangi bir aktif^4,11hedefleme daha olumlu alınması eğilimi gösterir. Bu fizibilite ve teslimat uygulamaları için doğru boyutu parçacıkların kullanan önemi gösterir. Aşağıdaki iletişim kuralı, arıtma malzemelerin ve PEG kaplı AuNPs (PEG-AuNP), Fonksiyonel grupların ve diğer uygulamalar için conjugations dikme için tartışma sunar.

Protokol

1. hazırlık veya edinim hisse senedi Çözümleri (oda sıcaklığında saklanması için veya kullanım kadar dondurulmuş)

1. 1 M sodyum hidroksit (NaOH) hisse senedi çözüm 400 mg 10 mL ultrasaf su oda sıcaklığında NaOH eriterek ve iyi malzeme karıştırma hazırlayın.
   Not: Ultrasaf su tanecikleri, bakteri, enzimler, iyonlar veya organik izleri gibi yabancı maddelerin susuz olarak tanımlanır. Arıtma sistemi kadar 18,2 mΩ·cm, düşük bir iyonik kirlenme gösteren onun direnci içinde kaynaklanan ultrasaf su elde etmek için kullanılır. Piyasada bulunan şişe ultrasaf su kullanımı önerilmez. Şu andan itibaren bu ultrasaf su su, aksi belirtilmedikçe sevk edilecek.
2. 6 M NaOH hisse senedi çözüm 10 mL su 2.4 g NaOH çözülerek hazırlamak ve çözüm oda sıcaklığında saklayın.
3. Chloroauric asitin esterleri (HAuCl₄) 250 mM hisse senedi çözüm kurutulmuş HAuCl₄ ' te 10,16 mL su 1 g çözülerek hazırlayın. 250 mm HAuCl₄ 25 mM HAuCl₄çalışma konsantrasyonu elde etmek için 9 mL su ile 1 mL seyreltik. HAuCl₄ çözüm oda sıcaklığında saklayın.
4. 0.1 M karbonat tampon pH 8.8, 84 mg sodyum bikarbonat 10 mL suda eriyen ve 1.2 adımından 6 M NaOH ekleyerek 8.8 için pH ayarlama hazırlayın. Karbonat arabellek oda sıcaklığında saklayın.
5. 20 mL tetrazolium bileşik, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium tuz (MTS), teskin Aracısı ile phenazine ethosulfate (PES) mix ( Tablo malzemelerigörmek). Aliquots (için en fazla 10 donma-çözülme döngüsü) MTS/PES karışımı karanlıkta-20 ° C'de depolayın.

2. altın nanopartikül çekirdek sentezi

1. 12 µL % 80 ekleyerek seyreltilmiş bir THPC çözüm hazırlamak su oda sıcaklığında microcentrifuge tüp içinde 1 ml suda THPC.
2. 100 mL yuvarlak alt şişesi bir manyetik heyecan tabak Merkezi güvenli. 45 mL su şişesi dökün ve su 300 yumurta şekilli küçük manyetik heyecan çubuğunu kullanarak devir / dakikada ilave edin. 0.5 mL 1 M NaOH ve 1 mL sulandırılmış THPC çözeltisi ekleyin. 5 min için şiddetle tepki karışımı heyecan devam ediyor.
3. Devam karışımı karıştırma ve 2 mL 25 mM HAuCl₄ çözüm ekleyin. Karışım rengi sarıdan koyu kahverengi THPC oluşumu ile negatif bir yük AuNPs şapkalı belirten saniye içinde değişecektir. Tam altın çekirdek oluşumu için izin vermek ek bir 15 dakika karışımı ilave edin.

3. altın nano tanecikleri çevresinde polimer Corona eklenmesi

1. 2.3. adımda açıklanan 15 dk, PEG çözümler her aşağıdaki 4 mL cam şişe 1 mL suda çözülerek hazırlık yapabilmek: 30 mg NH₂-PEG-SH; 7.5 mg m-PEG-SH; 7.5 mg COOH-PEG-SH.
   Not: Elde edilen konsantrasyonlarda 8.8 M NH₂olmalıdır-PEG-SH, 3,75 M m-PEG-SH ve 3,75 M COOH-PEG-SH.
2. PEG eklemek 100 rpm, yuvarlak alt şişeye çözümde karıştırma hızını azaltarak sonra çözüm THPC çözüm dropwise AuNPs şapkalı. Karışımı yavaşça gecede, oda sıcaklığında THPC verimli kaldırılması ve yerine Peg emin olmak için heyecan devam ediyor.
3. Önümüzdeki 72 saat için bir 12-14 kDa molekül ağırlığı kesme selüloz membran karşı bir 4 L kova 60 rpm'de karıştırılmış su karıştırılmış karışımı diyaliz için kullanın. Diyaliz klipleri tarafından membranlar uçları kravat ve çözüm pipet ile aktarın.
   Not: Bu diyaliz işlemi 12-14 kDa kesme membran ile sadece unreacted PEG, THPC ve diğer kimyasal Reaktanları tarafından Difüzyon konsantrasyon degrade boyunca kaldırır.
4. Yüksek konsantrasyon gradyanı korumak ve sürekli Difüzyon teşvik için su her 2 için ilk 6 h s ve her 6-12 h kalan 66 h için değiştirin.
   Not: Erken doğum, örnek içinde başlangıçta yüksek konsantrasyon nedeniyle oluşan hızlı Difüzyon karşılamak için bu su zamanlamasını değiştirme amacı budur. Nano tanecikleri, precipitates, toplamları ve diğer büyük boy kirleri 12-14 kDa kesme membran gözenekleri geçirilemez çünkü diyaliz işlemi nanopartikül çözüm yarı arıtılmış, yaprakları açıklanmıştır.
5. Yarı arıtılmış nanopartikül çözüm bir 50 mL konik tüp kalan precipitates, toplamları ve diğer büyük boy kirleri çıkarmak için 0.2 µm şırınga filtre kullanarak filtre.
6. Konik tüp-80 ° C dondurucuya yerleştirin ve yaklaşık 5 h için dondurmak saflaştırılmış pegile AuNP (PEG-AuNP) çözüm sağlar.
7. Arıtılmış PEG-AuNP lyophilize için bir donma kurutma makinesi kullanın.
8. Kuru, saflaştırılmış PEG-AuNP 4 ° C'de kullanmak kadar saklamak.

4. conjugating N-hydroxysuccinimide (NHS) Ester NH₂ gruplar üzerine PEG-AuNP üzerinde kullanarak Fluorophores

1. 50 mL yuvarlak alt şişesi bir manyetik heyecan tabak Merkezi güvenli. Şişeye 18 mL su ile doldurun ve su 100 bir manyetik karıştırın yumurta şeklinde çubuğunu kullanarak devir / dakikada ilave edin.
2. Lyophilized PEG-AuNP 2 mg yüksek hassasiyetli benchtop Skala ile 4 mL konik tüpte, tartın. Bir anti-statik silah statik yük ve boru yüzey için PEG-AuNP toz yapışan ortadan kaldırmak için kullanın. 2 mL su tüp ekleyin. 2 mL PEG-AuNP çözüm daha fazla toplam rekonstitüsyon 20 ml su için yuvarlak alt şişe içine dökün. 100 bir manyetik karıştırın yumurta şeklinde çubuğunu kullanarak devir / dakikada karışımı heyecan devam ediyor.
3. 1 mL 0.1 M ekleyin, pH 8.8 karbonat arabelleğe Sulandırılan AuNP yuvarlak alt şişeye bulunan 20 mL. Karıştırmaya devam.
4. 10 mg/mL floresan NHS ester 5 µL Dimetil sülfoksit ekleyin.
   Not: Bu süreçte herhangi bir floresan boya kullanılabilir. Floresan PEG gecede karıştırın. Oda sıcaklığında tutmak ve folyo kaplı.
5. Önümüzdeki 72 saat için aşırı fluorophores 3.3. adımda anlatılan protokolünü kullanarak kaldırın. Kısaca, bir 4 L kova su ve bir 12-14 kDa molekül ağırlığı kesme selüloz membran kullanarak karıştırılmış karışımı diyaliz. Değişmek belgili tanımlık su her 2 h ilk 6 s ve her 6-12 h kalan 66 h için.
6. 1 mL aşağıda 5 bölümünde açıklanan karakterizasyonu için kullanılacak arıtılmış floresan PEG-AuNP çözeltisi, elde edilir. Donma ve 3.5-3.7 adımlarda açıklandığı gibi 4 ° c, depolama için toz formunda floresan nano tanecikleri elde etmek için kalan çözüm lyophilize.
7. 0.2 µm şırınga filtre sterilize etmek ve bir kez yeniden hücre kültür uygulamaları için herhangi bir potansiyel precipitates kaldırmak için kullanın.

5. floresan pegile altın nano tanecikleri karakterizasyonu

1. Altın nanopartikül çekirdek görselleştirmek ve boyutları ölçmek için iletim elektron mikroskobu (TEM) kullanma
   1. 10 µL arıtılmış floresan PEG-AuNP çözüm bir karbon kaplama mesh TEM ızgara üzerine bırakın.
   2. 5 dk sonra dikkatle PEG-AuNPs geride floresan içeren bir film kadar TEM kılavuz kenarından uzak aşırı sıvı fitil için filtre kağıt kullanın.
   3. Floresan PEG-AuNPs 80 görüntülemek kV ve büyütmede 50.000-150, 000. Dijital fotoğraf çekmek.
      Not: PEG elektron TEM üzerinde yoğun olmadığı için sadece altın çekirdek görünür.
   4. Bir ölçüm yazılımı kullanarak, ölçek çubuğu için ilişki içinde ölçü ölçeği ayarlamak. Çapları yaklaşık 20 altın çekirdek hesaplamak ve ortalama altın göbek çapı belirleyin.
      Not: TEM görüntüleme sistemi otomatik olarak dijital fotoğraf üzerinde bir ölçek çubuğu yerleştirir.
2. Hidrodinamik nanopartikül boyutu dinamik ışık saçılma (DL) kullanarak ölçülmesi
   1. 4.2. adımda açıklanan yaklaşım kullanarak bir microcentrifuge tüp içine 1 mg liyofilize THPC kaplı AuNPs transfer. 1 mg liyofilize PEG-AuNP ayrı bir tüp aktarın. Her tüp için 1 mL su ekleyin ve her AuNP çözüm şeffaf plastik bir 1 mL transfer.
   2. Bir küvet bir DLS aleti yerleştirin ve küresel hidrodinamik çapları DLS sisteminde bulunan parçacık analyzer yazılımı kullanarak ölçün.
   3. Bir çubuk grafik biçimi kullanarak ölçülen hidrodinamik çapları arsa.
      Not: Histogram nano tanecikleri boyutuna göre gruplandırır. Nano tanecikleri en büyük grup bu protokol için sentezlenmiş AuNPs boyutunu en iyi tanımlayan çapı açıklığa kavuşacaktır.
3. Fluorometrik Floresans onay
   Not: Aynı örnek ve küvet adım 5.2 floresan sinyal ölçmek için kullanılabilir.
   1. Küvet DLS çıkarıp bir spectrofluorometer yerleştirin. 650-800 nm dalga boyu aralığı uyarma dalga boyu 633 nm ve okunur verilmiş floresan sinyallerini küme.
   2. Zirve yaklaşık 665 olduğunu doğrulayın emisyon zirveye NHS için ilişkili olan nm.
      Not: uyarma ve emisyon dalga boylarında sürecinde kullanılan fluorophore göre ayarlayın.
4. MTS Biyouyumluluk değerlendirmek için¹¹ tahlil
   1. Bir 96-şey açık alt steril doku kültürü tedavi plaka, Dulbecco'nın modifiye kartal orta 100 µL pipet (DMEM; % 10 fetal sığır serum ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş) ve 3.2 x 10³ hücreleri her kuyuya.
      Not: Bu çalışmada, sıçan yağ yastığı endotel hücreleri kullanılır. Toplam 21 Wells için 3 çoğaltır her biri (bkz. Adım 5.4.3 ilgi belirli konsantrasyonları için) 7 farklı nanopartikül konsantrasyonu için izin vermek için kullanılır.
   2. Hücreleri confluency nem ve % 5 CO₂ kontrollü İnkübatörler 37 ° C¹¹içinde büyümeye izin.
   3. Bireysel microcentrifuge tüpler, her DMEM 300 µL çeşitli konsantrasyonları nano tanecikleri ile içeren hazır olun. Bu çalışmada DMEM 7 farklı tüpleri aşağıdaki PEG-AuNP konsantrasyonları ile gerektirir: 0 µg/mL, 10 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 250 µg/mL, 500 µg/mL ve 1000 µg/mL.
   4. Tüp DMEM Aspire edin. Nüsha wells 0, 10, 50, 100, 250, 500 ve 1000 µg/mL AuNP içeren DMEM medya 100 µL ile doldurun.
   5. Hücreleri ve önceden belirlenmiş bir süre boyunca, burada 16 h için ortak kuluçkaya nano tanecikleri sağlar.
   6. Kuluçka dönemi sona yakın, adım 1.5 MTS/PES karışım çözülme.
   7. Kuluçka sonra DMEM ve kuyulardan askıya alınmış, gevşek ekli nano tanecikleri Aspire edin. Taze DMEM ile birlikte 20 µL MTS/PES çözüm 1:5 MTS/PES üreticinin protokolüne göre DMEM oranı elde etmek için 100 µL ekleyin. MTS/PES hücrelerle 37 ° c 2 h için kuluçkaya.
      Not: Bu 2 h kuluçka zaman endotel hücreleri metabolik aktivite tarafından belirlenir ve en fazla 4 saat için diğer hücre tipleri için arttı. 2 h dönem içindeki MTS DMEM ile karışımları renkli formazan içine endotel hücreleri tarafından metabolize. PEG-AuNP Biyouyumluluk ve hücre canlılığı olasılığı daha renkli formazan ile gösterilecektir. PEG-AuNP ve hücrelerin ölüyor şans toksisitesi daha az yoğun rengiyle gösterilecek.
   8. 492 Absorbans okuyarak her şey Renkölçer analizini gerçekleştirmek nm ile uyumlu plaka okuyucu.
   9. Her nanopartikül konsantrasyonu için onaylatılacak Absorbans değerleri üzerinden ortalama Absorbans hesaplayın. Ortalama Absorbans Absorbans 0 µg/mL nano tanecikleri içeren Wells ortalama üzerinden alınan değeri bölün.
      Not: denetimleri yüzde hücre canlılığı diğer wells yönetilen nanopartikül tedaviye yanıt olarak hesaplamak için hiçbir AuNPs içeren bu kuyuları görevi.
5. Floresan confocal mikroskobu nanopartikül anlamazdın yapisan endotel hücreleri sağlam ya da işlevsel olmayan glycocalyx¹¹ ile değerlendirilmesi
   1. Tohum 1.0 x 10⁴ hücreleri/cm² sıçan yağ steril 12 mm cam coverslips üzerine endotel hücreleri yastık ve hücrelerin % 10 fetal sığır serum ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş DMEM ile beslemek. Hücreleri yaklaşık 3 gün boyunca tam confluency nem ve CO₂ kontrollü İnkübatörler 37 ° C'de büyümeye izin.
   2. Glycocalyx değiştirmek için Tedaviler varsa ekleyin. Örneğin, 2. 5 x 10^-6 IU heparinase III enzim ile kültürlü endotel hücrelerinin 2 s tedavi özellikle kendi heparan sülfat bileşeni fizyon tarafından glycocalyx alçaltır.
      Not: Sağlıklı glycocalyx endotel hücre yıkımı enzimler ek olmadan 5.5.1 adımda açıklandığı gibi büyüyerek modellenebilir.
   3. Sol bozulmamış veya işlevsiz hale endotel glycocalyx ile endotel hücreleri floresan AuNPs 16 h için 550 µg/mL veya istenen diğer zamanı ile kuluçkaya.
   4. 37 ° C % 1 sığır serum albümin fosfat tamponlu tuz (PBS; 100 mg/L kalsiyum ve 100 mg/L magnezyum içeren) içinde 2 mL içeren hücreleri nazikçe yıkayın. % 2 paraformaldehyde 2 mL hücrelerde ve PBS %0,1 oxazolidin daldırın ve hücreleri saptamak için oda sıcaklığında 30 dakika bekleyin.
   5. Aldehid sabitleme çözümü kaldırmak ve oda sıcaklığında PBS hücrelerle üç dakika 5 devredir yıkayın.
   6. Birincil antikor uygulama öncesinde, PBS içinde % 2 keçi serum spesifik olmayan bağlayıcı siteleri engellemek için oda sıcaklığında 30 dakika için endotel hücreleri göstermek. Hücreleri tamamen engelleme çözüm ile kaplı olmalıdır.
   7. Gecede %1 anti-heparan sülfat birincil antikor Serumda % 2 keçi PBS içinde glycocalyx heparan sülfat bileşeni etiketlemek için 4 ° c ile endotel hücreleri kuluçkaya. Sabit hücreleri antikor çözüm ile temas halinde tam olduğundan emin olun.
   8. Ertesi gün, oda sıcaklığında PBS ile antikor dışarı üç 10 dk devredir yıkayın.
   9. Karanlık veya alüminyum folyo kaplı oda sıcaklığında 30 dk için uygun floresan ikincil antikor 1:1,000 seyreltme ile endotel hücreleri kuluçkaya.
   10. Oda sıcaklığında PBS ile ikincil antikor dışarı üç 10 dk devredir yıkayın.
   11. Coverslip 4', 6-diamidino-2-phenylindole, içeren bir anti-fade montaj orta dihydrochloride (DAPI) Boyama çekirdekler için kullanma mikroskop slayta bağlayın. Tırnak cilası kullanarak coverslip kenarlarını kapatın.
   12. Görüntü floresan immunostained endotel hücre çekirdekleri, heparan sülfat glycocalyx ve nano tanecikleri, sırasıyla görselleştirmek için mavi, yeşil ve çok kırmızı kanalı kullanılarak confocal mikroskobu ile örnekler.

Sonuçlar

THPC veya PEG ile kaplı sentezlenmiş AuNPs (şekil 1A ve şekil 1B, sırasıyla), TEM ve boyutları ölçülen uygun nanopartikül boyutu dağıtım sağlamak için TEM ve DLS kullanarak parçacıkları ile görüntüsü. Şekil 2 80 THPC-AuNP örnek TEM görüntüsünü gösterir kV ve 150.000 x büyütme. Çapları arasında 2-3 nm, TEM görüntüleri kalibrasyon barda göre THPC-AuNP parçacıklar değişir. Bu THPC-AuNP boyutu da açıktır DLS boyutu ölçüm Şekil 2' de gösterilen çubuk grafik, hangi THPC kaplı AuNP 2.5 bir zirve için gösterilir nm. Polimerler elektron yoğun değildir olarak PEGylation TEM altında görünür değil. TEM görüntüleme PEG-AuNP örnekleri sadece PEG polimer corona nano tanecikleri çevresinde yardım çünkü toplama önlenmesinde hangi beklenen bireysel dağınık parçacıklar, varlığını doğruluyor. Bu PEG-AuNP örnekler için yaklaşık 10.5 için en yüksek bir kayma DLS boyutu ölçüm çubuk grafik gösterir nm DLS üzerinde. Ekleri daha fazla ligandlar veya uyuşturucu Fonksiyonel grupların üzerine de nanopartikül boyutunu etkiler ve çapı ölçerken göz önüne alınmalıdır.

Fluorophore ek (şekil 1 c) floresan sinyal nano tanecikleri, örneği şekil 3' te gösterilen ölçmek için bir yer kullanılarak doğrulanır. 633 bir dalga boyu ile heyecanlı zaman nm, emisyon üreticinin ürün bilgileri, 665 maksimum emisyon eşleşen 660 ve 672 nm arasında en için ölçülen nm. Diğer floresan problar ek floresan yanıt sağlamak için benzer bir şekilde kontrol edilmelidir.

Parçacıklar ve ilgili hücre canlılığı Biyouyumluluk değerlendirildi MTS tahlil MTS nano tanecikleri çeşitli konsantrasyonları ile göreli hücre metabolizması 16 h kuluçka sonra kontrol etmek için kullanarak. Fluorophore 1 mg/mL (4A rakam) kadar tüm konsantrasyonlarda hücre canlılığı benzer düzeyde gösterildiği gibi önemli zehirlenmesi, konjuge pegile AuNPs gösterir. Bu Biyouyumluluk tedavi edici veya daha fazla parçacıkları özelleştirmek için kalan fonksiyonel gruplara bağlı ligand bağlı olarak değişebilir. Uyuşturucu ekleri toksisite artış eğilimi, ancak çalışma konsantrasyonu bağlı olarak bu canlılığı önemli şekilde etkileyebilir değil.

Floresan, pegile AuNPs (şekil 1 c) yapışık hücreleri tarafından alımını kültürlü sıçan yağ yastığı endotel hücreleri ile sağlam ya da işlevsel olmayan glycocalyx (şekil 4B) kullanarak değerlendirilir. İşlevsel olmayan glycocalyx koşulları için kültür heparinase III enzim ekleme, heparan sülfat glycocalyx bileşeni bir bozulma sonucu ve matris¹²ödün elde edilir. Şekil 4B temsilcisi endotel hücrelerinin kesitsel görüntüsü üzerinde kırmızı noktalar olarak PEG-AuNPs, alımını farklı düzeylerde gösterir. Sağlıklı bir glycocalyx bu altın nano tanecikleri alımını engeller ama enzim istihdam¹¹ne zaman önemli bir artış görülmektedir. Bu sonuç glycocalyx sağlık üzerinde temel alan farklı etkileşimler tarafından kontrollü bir şekilde endotel hücreleri tedavi sunmak için bu ultrasmall nano tanecikleri potansiyeli vurgulamaktadır.

Şekil 1: altın nanopartikül şemaları. (A)THPC AuNP nanosphere PEG yedek önce kaplı. (B) pegile AuNP PEG antenler, COOH, NH₂ve CH₃de dahil olmak üzere 3 tip ile. Mavi Dalgalar polimer temsil eder. (C) nano tanecikleri Floresans görüntüleme için Birleşik. Kırmızı yıldızlar NH₂ fonksiyonel gruplar için Birleşik fluorophores göster. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: Boyut ölçümleri altın nano tanecikleri. Sol: TEM PEG ilavesi 80, önce altın nano tanecikleri ve kV ve gösterilen ölçek çubuğu ile 150.000 X büyütme. Sağ: Histogram nanopartikül boyutunun ölçülen DLS önce (AuNP) tarafından ve PEG ile (PEG-AuNP) THPC replasmanı sonrası. THPC kaplı AuNP DLS sonuçları ölçmek ne TEM tarafından görüntülenmiştir. DLS PEG kaplı AuNP sonuçlar PEG tarafından TEM polimerler elektron yoğun değil varlık nedeniyle görselleştirmek için yetersizlik meydan üstesinden gelmek. Bir TEM, PEG-AuNP sadece çekirdek altın nano tanecikleri gösterir ve aynı THPC şapkalı AuNP bakacağız. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: floresan veri türlerini floresan PEG-AuNP. Fluorophore emisyon PEG-AuNP için Birleşik 667 nm maçlar Floresans zirvesinde. Yapıyordum: rasgele birimleri.

Şekil 4: hücre etkileşimleri ile floresan PEG-AuNP. (A)hücre canlılığı (MTS metabolizma) arsa sıçan yağ için yastık endotel hücreleri floresan PEG-AuNP ile 16 h eş kuluçka sonra. (B) Confocal kesitsel görüntü sabit fare yağ endotel hücre çekirdeği (mavi) ve heparan sülfat, bir glycocalyx bileşeni (yeşil) karşı antikor için DAPI ile lekeli yastık. En iyi görüntü sağlıklı bir glycocalyx ve alt bozulmuş glycocalyx katman; nano tanecikleri ile bozulmuş glycocalyx örnek'dan önemli ölçüde daha fazla kırmızı Floresans vardır. Ölçek çubuğu var. 10 µm Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Bu teknik sentezleme için etkili bir yöntem ultrasmall PEG AuNPs kaplı özelleştirilebilir olur. Bu yordamı önemli bir parçası biridir THPC ilk oluşumu altın HAuCl4 yuvarlak alt şişeye (iletişim kuralı adım 2.3) içeriği için eklendikten sonra bu kahverengi sarı renk değişikliğinden tarafından onaylandıktan nano tanecikleri ortaya çıkar. Hiçbir renk değişikliği kurulan hiçbir nano tanecikleri vardır ve ilk adımları kontrol ve devam etmeden önce tekrar olduğunu gösterir. Elde edilen parçacıklar hedef 2.5 nm büyük olasılıkla olmayacak ve şarap kırmızı veya gri gibi kahverengi dışında bir renk değiştirir durumda, yeni bir toplu işlemi de yapılmalıdır.

Altın çekirdek oluşumu sonra THPC Satım PEG ve arıtma işlemleri için protokol başarıyla tamamlanması için birkaç önemli adımlar içerir. Gecede karıştırma tamamlanması gitmek değiştirme reaksiyon için izin verir. Başarısız olan arıtma diyaliz su ile öngörülen frekans değiştirilirse oluşabilir. Parçacıklar diyaliz daha 72 h için içinde kalması durumunda toplama ve yağış parçacıkların da oluşabilir. Olası diğer konuları Donma kurutma sırasında gözlenen. Ultrasmall PEG AuNP çözüm değil tamamen donmuştu kaplı ya da lyophilizer doğru ayarlanmamış, örnekleri kaybolabilir. Bazı malzemeler farklı örnek hazırlıklar gerektirebilir gibi lyophilizer el kitabına başvurun.

Sentez kolaylığı ve Biyouyumluluk ortaya çıkan parçacıkların bu PEG AuNPs kullanma avantajları temsil eder. Buna ek olarak, bu nano tanecikleri bu nano tanecikleri alımını tarafından bozulmuş glycocalyx tanımlama yeteneği tarafından gösterildiği gibi Nano Hücresel yapıları ile etkileşim mümkün olmanın avantajı var. Bu avantaj yeni ateroskleroz terapiler ve önleyici tedbirler geliştirilmesi amacıyla. Biz burada, bu iletişim kuralı bir diğer avantajı mevcut ötesinde bu parçacıklar kapsamlı özelleştirme için sağlar yanı sıra artan istikrar ve depolama yetenekleri altın nano tanecikleri⁴PEG içeren thiol ekleyerek olduğunu. PEG zinciri diğer ucunu herhangi bir işlevsel grubuna içerebilir ve sayısız moleküllerin bu gruplara Birleşik. Bu protokol için üç ortak fonksiyonel grup eklenir (metil, karboksil ve amino). PEG floresan algılama ilk öncelik vermek için seçilmiş, sonra karboksilik asit grubunu kullanarak bir ikincil hedefleme yan dahil yeteneği oranıdır. Bu grupların oranları uygulama dayalı tweaked olabilir ve uzunlukları ve polimerler şekilleri de ayarlanabilir.

Parçacık alımını ölçmek için fonksiyonel grupların birine floresan bir sonda Birleşik. Bu ne biz anlatmıştık ötesinde herhangi bir fiil nanopartikül yüzey özelliklerini bir değişiklik neden olacaktır unutulmamalıdır. Nano tanecikleri ile ilgili ek bileşenleri ve konjugasyon reaksiyonları her yineleme için istenen özellikleri test edilmelidir.

Bu yöntem ultrasmall altın nano tanecikleri geleneksel boyutlu nano tanecikleri alımını engellemektedir endotel hücre dışı glycocalyx savunma özelliklerini üstesinden gelmek için amaçlanan üretir. Ancak, küçük boyutlu görüntüleme ve uyuşturucu boy yükleme zorluk oldukça rahat. Bu parçacıklar tipik nanopartikül boyutu aralığı önemli ölçüde küçüktür ve sonuç olarak tedavi ve moieties hedefleme ekler için mevcut yüzey alanı büyük ölçüde azalır. Bu parçacıkların kümeleri hala kolayca tespit rağmen görüntüleme uygulamalarında, içinde bireysel sinyalleri confocal Albümdeki gösterildiği gibi tespit zorluk neden olabilir. Düşük yüzey ligandlar ve tedavi hedefleme ekler için hedef doz gereksinimleri ulaşmak için yönetilecek daha fazla parçacıklar gerektirebilir. Ancak, zaman glycocalyx göz önüne alarak daha küçük parçacıklar dağıtımında daha verimli olacaktır.

Bu roman ultrasmall parçacıklar teslim içine zor yapabileceklerini microenvironment en az kesinti ile vücut içinde Nano alanlarına ulaşmak için. PEG eklenmesi için artan Biyouyumluluk sağlar ve Fonksiyonel grupların çeşitli uygulamalar için parçacıkların ağır özelleştirme için sunmaktadır. İçin tipik nano tanecikleri kıyasla daha küçük boyut bazı eksiklikler ile gelir, ama stratejik olarak geliştirilen ultrasmall parçacık zor nüfuz, karmaşık ve kırılgan glycocalyx damar içinde konaklama için umut verici bir yaklaşım ise hedefleme ve ilaç teslim.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma Aldrich	795429
Gold (III) Chloride trihydrate (HAuCl4.3H2O)	Sigma Aldrich	520918
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Tetrakis (hydroxymethyl) phosphnium chloride	Sigma Aldrich	404861
Mono-functional mPEG-thiol	Layson Bio Inc.	MPEG-SH-2000-1g	Mw: 2,000 Da
hetero bi-functional anime-PEG-thiol	Layson Bio Inc.	NH2-PEG-SH-3400-1g	Mw: 3,400 Da
Carboxymethyl-PEG-thiol	Layson Bio Inc.	CM-PEG-SH-2000-1g	Mw: 2,000 Da
Cellulose dialysis membrane (12-14 kDa)	Sigma Aldrich	D9777
Zerostat anti-static instrument	Sigma Aldrich	Z108812
Alexa Fluor 647 (AF647) carboxylic acid succinimidyl ester	Fisher	A20006	Fluorophore
Fisherbrand Qualitative Grade Plain Filter Paper Circles - P5 grade	Thermo Fisher Scientific	09-801-B
Transmission electron microscopy	JEOL USA	JEOL JEM-1000	TEM
Dynamic Light Scattering	Brookhaven Instruments Corporation	Brookhaven 90 Plus Particle Size Analyzer	DLS
Fluorometer	Horiba Scientific	Jobin Yvon Fluromax 4	Fluorometer
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)	Promega	G3582	MTS
Plate reader	Molecular Devices	SpectraMax M4	Plate reader
10E4 epitope HS mouse monoclonal IgM antibody (primary antibody)	Amsbio	370255	Primary antibody
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (secondary antibody)	Thermo Fisher Scientific	R37120	Secondary antibody
VECTASHIELD mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1000	With DAPI
Confocal Microscope	Carl Zeiss Meditex AG	Zeiss LSM 700	Confocol microscopy