Ambulation kas distrofisi, fare modellerinde ölçmek için basit ve düşük maliyetli bir tahlil

Özet

Bu iletişim kuralı fare ambulation bir açık alan faaliyet tahlil ölçmek için esnek, düşük maliyetli bir sistem açıklar. Biz bu sistemine dayalı bir 6 dakika ambulation tahlil gönüllü hareketi bir düşüş mdx farelerde algılar ve doğru bir şekilde ayıran bir kas özel kurtarma düzelme bu hayvanların gösteriyor.

Özet

Kas distrofisi tedavisinde fonksiyonel sonuçları ölçme preklinik test temel bir yönüdür. Fare modellerinde gönüllü ambulation değerlendirilmesi hasta ambulation 6 dakika yürüme testi gibi önlemler doğrudan benzerdir ve hareketlilik puanları ile ilgili bir non-invaziv ve tekrarlanabilir etkinliği tahlil olduğunu. Fare ambulation hız ve mesafe test etmek için pek çok ortak yöntem nerede bir hayvanın serbest dolaşımı bir arena içinde zaman içinde ölçülen açık alan testinin temel alır. Bu yaklaşımın bir büyük dezavantajı bu ticari yazılım ve donanımları, yüksek çözünürlüklü hareket takibi için pahalı ve test etmek için Özel İmkanlar fareler aktarılması gerektirebilir. Burada, özgür ve açık kaynak yazılım kullanan fare ambulation ölçmek için bir düşük maliyetli, video tabanlı sistemi açıklanmaktadır. Duchenne kas distrofisi (DMD) vahşi tipi fare aktivite göre azalır için bu iletişim kuralını kullanan, biz dystrophin boş mdx fare modeli gönüllü bu ambulation göstermektedir. Mdx içinde fare utrophin transgene ifade, bu etkinlik açıkları değil gözlenir ve toplam mesafe vahşi tipi fareler ayırt edilemez. Bu yöntem gönüllü ambulation distrofik patoloji ile ilişkili değişiklikleri ölçmek için etkilidir ve farklı araştırma ayarlarına kolayca adapte edilebilir çok yönlü bir platform sağlar.

Giriş

Güvenilir ve tekrarlanabilir ölçümler kas işlevinin DMD için potansiyel tedavilerin etkinliğini değerlendirmek için kritik öneme sahiptir. DMD Progresif kas güçsüzlüğü, kaybetme-in ambulation ve nihai solunum yetmezliği için önde gelen dystrophin gen mutasyonlar neden bir genetik bozukluk var. En çok kullanılan hayvan modeli DMD dystrophin boş mdx faredir. Fonksiyonel testi mdx fare de olduğu gibi diğer dystrophies ve myopathies benzer hayvan modelleri hastalığın ilerlemesinde değerlendirmek için rutin deneyleri olarak ortaya çıktı. Yaygın olarak kullanılan vivo içinde deneyleri forelimb kavrama gücü, yorgunluktan treadmill çalışan ve motor aktivite izleme sırasında saat, rotarod maksimum, saat asılı tel ölçümleri içerir. Alanında preklinik çalışmalar arasında değişkenlik azaltılması ve fareler^1,2' test therapeutics translasyonel potansiyelini artırmak amacı ile bu testler standartlaştırmak için önemli bir çaba olmuştur.

Preklinik test bir önemli kategori gönüllü hareketi, kas distrofisi fare modellerinde sık değiştirilen parametre ölçümdür. Bu genellikle açık alan etkinliğini izleme tabanlı deneyleri tarafından test ve (yürüyüş) yatay veya dikey (yetiştirme) hareketleri^2,3,4dakika veya saat boyunca değerlendirmek. Çalışmalar bir dizi mdx farelerde özellikle egzersiz sonrası, değiştirilmesi için gönüllü hareketi göstermiştir ve bu ölçümler uyuşturucu tedavi ve hastalık ilerleme hassas olduğu gösterilmiştir. Bu deneyleri yerine bir büyük sınırlama özel, yüksek maliyetli ekipman için ihtiyaç vardır. Burada, kolayca kullanılabilir kaynakları kullanarak fare ambulation izleyen bir düşük maliyetli yöntem sunulmaktadır.

Duchenne kas distrofisi^5,6ile bireylerde bir klinik değerlendirme aracı olarak yaygın olarak kullanılan bir ölçü 6 dakikalık yürüme mesafesindedir. Bu ölçü değişiklikleri Duchenne, mdx fareler⁷ ve altın geri almak kas distrofisi (GRMD) köpekler⁸de dahil olmak üzere hayvan modellerinde sonuçları değerlendirmek için kullanılmaktadır. Bu çalışmada, hemen ardından bir hafif egzersiz challenge 6 dakika içinde gönüllü açık alan hareket kaydederiz. Ambulation mesafe sonra yatay hareketi zamanla ölçmek için özgür açık kaynak bilgisayar yazılımı kullanılarak hesaplanır.

Bu yöntem büyük avantajı özel ekipman veya yüksek maliyetli ticari yazılım analiz için gerek kalmadan hayvanlar çeşitli ayarları test olduğunu. Bir önemli yönü bu analiz taşıma veya bir özel çekirdek tesisine fareler vivaryum dışarı aktarma gerek kalmadan bir temel laboratuvar ortamında yapılabilir olmasıdır. Burada açıklanan video izleme Protokolü nispeten kısa süre-sürelerle ambulation değerlendirilmesi için uygundur ve vahşi-türü ve mdx fareler arasında faaliyet farklılıkları algılamak, yanı yapabilirsiniz bir kurtarma fonksiyonel iyileşme ortaya DMD modeli.

Protokol

Yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles kullanım Komitesi tarafından kabul edildi. Vahşi-türü (C57BL/6J) ve mdx fareler (C57Bl/10ScSn arka plan) ticari bir kaynaktan satın alındı. MDX: utrophin-Tg fare izniyle Kay Davies, James Ervasti, bir hediye edildi ve mdx arka plan üzerinde muhafaza. Ambulation deneyleri erkek fareler üzerinde 6 aylıkken yapıldı. Fareler Terasaki Yaşam Bilimleri kurumsal hayvan bakım tarafından kurulan yönergeleri izleyerek Vivarium içinde muhafaza ve University of California, Los Angeles (onay 2000-029-43) ve onay bu çalışmalar için kullanım Komitesi tarafından verildi UCLA hayvan refah güvence (onay #A3196-01).

1. Hazırlık odası

1. Veri toplama sessiz, bir sıcaklık kontrollü odada gün⁹tutarlı bir anda gerçekleştirin. Genotip ve test edilen fare tedavisinde kör sınamaları gerçekleştirin.
2. Bu çözümleme için herhangi bir açık alan odası sistemi adapte.
   Not: Bu çalışmada, biz büyük çöp Kutusu'ndan inşa bir ucuz ve kolay taşınabilir kayıt odası kullanın. Açık alan arena bir kafes veya benzer yükseltilmiş platform ayarlamak bir tepsi var.
3. Kamera bir tel ağ tam arena kaydetmek için odası yukarıda yerleştirin.
4. Dezenfektan her davadan önce ile kayıt odası temiz.

2. iletişim kuralı ve veri toplama önceden egzersiz

1. İsteğe bağlı olarak, hemen etkinlik kayıt önce her fare bir kas etkinleştirme protokol ile meydan.
   Not: Bu isteğe bağlıdır, ancak önerilen mdx fareler ilgili deneylerde olduğunu.
   1. Çekme çubuğu bir dijital güç ölçüm kavrama ve geri çekme çubuğu serbest bırakılıncaya kadar yavaşça çekin fare izin. Deneme başına beş kez bu yordamı yineleyin.
   2. Her deneme için kayıt en yüksek gerilim (N).
      Not: ambulation tahlil için bir egzersiz sorun olarak görev ek olarak, bu kavrama gücü tahlil sırasında hayvan tarafından sarf kuvvet bir ek işlev sonuç ölçü^2,10kullanılabilir.
   3. Beş toplam denemeler her fare her deneme arasında kalan 1 dk ile gerçekleştirir.
2. Hemen kavrama gücü tahlil veya diğer egzersiz protokol, aşağıdaki etkinlik odasında fare yerleştirin.
3. Fare hareket video kayıt odası arenada başlatın. Fare özgürce 6 min için keşfetmek için izin.
4. 6 dk kaydı durdurmak ve fare için ev onun kafes dönmek.

3. video analizi

1. İsteğe bağlı olarak, video kare hızını azaltarak analiz için hazır olun. İzleme çözümlemesi için kare hızı azaltmak için video kare hızını 2 kat büyük kısmını yok için bir video düzenleme yazılımı (örneğin, iMovie veya benzer bir program) aşağıdaki protokolünü kullanır.
   Not: video uzunluğu ve kare hızına bağlı olarak, önce analiz video kare hızını azaltmak yararlı olabilir. Bu çalışmada, video 30 kare/s (6 kayıt, min yaklaşık 10800 çerçeveler toplam) kaydedildi.
   1. Video belgili tanımlık bilgisayar yazılımı yükleyin.
   2. 'Speed' menü altında ' hız: hızlı ' ve 2 x hız ayarla.
   3. Decimated Videosu izleme çözümlemesi için .mp4 dosyası formatında dışa aktarabilir.
2. Video analiz için yazılım programında açılmasını. Video Çizgi aracını kullanarak kayıt için kalibrasyon ayarlayın. Odası bir kenarı boyunca bir çizgi çizin. Hatta doğru tıkırtı ve seçme "Ayarla'ya ölçü..." Odası yan gerçek boyutunu santimetre olarak girin.
3. Fare pozisyonun yarı otomatik izleme başlatmak için 'hareket' imleci tıklatın.
   Video ilk kareden başlayarak, sağ izlenmesi gereken noktasında tıklatın; izleme noktası mavi bir daire ile işaretlenir.
   Not: Bu da çalışmanın, kuyruk Bankası izini sürerek her hayvan konumunu takip edildi.
4. Çerçeve klavyedeki sağ ok tuşunu tıklatarak ilerle; izleme noktası otomatik olarak tabanlı kuyruk Bankası konumuna taşımanız gerekir.
   1. İzleme konumu ile belirli bir çerçeve içinde ilgi noktası değil hizalanmışsa, el ile kuyruk tabanına mavi daire hizalayın.
      Not: video kalitesini ve fare hızına bağlı olarak, izleme ilgi noktası ile uyum sağlamak için kullanıcı girişi çeşitli düzeyleri gerektirebilir. Fare yolunu video ders ilerlemek.
5. Tam video izleme tamamlandığında, video ve izleme bindirme kaydedin. Konumsal veri izleme "Dışa aktarmak için elektronik tablo" seçerek verin.

4. veri analizi

1. Konumsal veri bir elektronik yazılım programında açılmasını. X, Y farenin konumunu her çerçevede koordine hareketi analiz yazılımı bildirir.
2. Çerçeve tarafından kat edilen mesafeyi hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın (çerçeve bir konumda nerede x₁, y₁ ve çerçeve iki olan x₂, y₂):
   
   Not: Zaman içinde toplu mesafe mesafe arasındaki her karenin ekleyerek hesaplanır.

Sonuçlar

Açık alan tahlil varyasyonları hastalık ilerleme kas distrofisi modellerinde test etmek için etkili bir yöntem olduğu gösterilmiştir. Burada, çok yönlü bir video izleme yöntemini hazır kayıt cihazları ve açık kaynak yazılım (şekil 1A-B) kullanarak iki boyutlu fare hareket analizi için göstermektedir. Tutarlı sonuçlar ile bildirilen benzer deneyleri hemen test göstermeden önce önemli ölçüde daha ...

Tartışmalar

Açık alan tahlil motor işlevi kas hastalığı fare modellerinde sınamak için etkili ve non-invaziv bir yol sağlar ve bu tahlil varyasyonları önceden klinik çalışmalar için bir bitiş noktası değerli ölçü olarak hizmet verebilir. Bir büyük ile bu tür bir tahlil faaliyet izleme sistemleri, yüksek maliyetli ve sınırlı erişilebilirlik kısıtlamadır. Bu çalışmada, varolan ticari yazılım ve donanım için benzer sonuçlar üretebilir açık alan etkinlik analizi için bir düşük maliyetli sis...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Video camera	Apple Inc.	ME553LL/A	For recording ambulation video, iPhone 5S Plus (or equivalent)
Kinovea software (version 0.8.15)	Kinovea Association		Open source video analysis software. Free download, PC compatible (Version 0.8.15, www.kinovea.org)
iMovie (version 10.0.6)	Apple Inc.		Any similar software can be used to reduce video frame rate (optional)
Roughneck 32 Gallon Black Round Trash Bin (Open field chamber)	Rubbermaid	# 1778013	Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin.
Avant White Plastic Tray 15"W x 10"D x 1.45"H (Open field chamber)	US Acrylic, LLC		Any open field chamber system can be adapted for recording. This study uses a recording chamber constructed out of a tray on a platform, at the bottom of a large trash bin.
C57BL/6J	Jackson Laboratory	#000664	Male 6 month mice
C57BL/10ScSn-Dmd/J (mdx)	Jackson Laboratory	#001801	Male 6 month mice
mdx: utrophin-Tg (fiona)	Gift from from James Ervasti, with permission from Kay Davies		Male 6 month mice