JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu rapor plazma miRNA, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR ile veya öncesi amplifikasyon olmadan kullanarak mutlak düzeylerini ölçmek için bir protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı plazma miRNAs miktarı daha iyi anlaşılmasını tanıyor ve nitel karşılık gelen verilerden farklı çalışmalar veya laboratuvar değerlendirmesini sağlar.

Özet

RT-qPCR tek tek hedef miRNAs değerlendirmek için en sık kullanılan yöntemlerden biridir. MiRNAs düzeyleri genellikle örneği göre ölçülür. Fizyolojik değişiklikler hedef gen ifade düzeyleri incelenmesi için uygun bir yaklaşımdır. Ancak, mutlak miktar daha iyi istatistiksel analizi kullanılarak gen ifade düzeyleri kapsamlı bir değerlendirme için tercih edilir. Mutlak miktar ortak değil hala kullanın. Bu rapor plazma miRNA, RT-qPCR ile veya öncesi amplifikasyon olmadan kullanarak mutlak düzeylerini ölçmek için bir protokolünü açıklar.

EDTA-plazma sabit birim (200 µL) bilinçli cynomolgus maymunlar femoral ven toplanan kan üzerinden hazırlanan (n = 50). Toplam RNA ticari olarak mevcut sistemi kullanılarak ayıklandı. Plazma miRNAs miRNA özgü ileri/geri PCR astar ve yoklama içeren sonda tabanlı RT-qPCR deneyleri tarafından sayısal. Standart Eğriler mutlak miktar için piyasada bulunan sentetik RNA oligonucleotides kullanarak oluşturulan. Sentetik bir cel-miR-238 normalleştirme ve kalite değerlendirmesi için bir dış denetimi olarak kullanıldı. Miktar döngüsü (Cq) değerleri 35 yukarıda gösterdi miRNAs qPCR adım önce önceden güçlendirilmiş.

MiR-1, miR-206 ve miR-499a öncesi amplifikasyon onların düşük ifade seviyeleri nedeniyle gerekli ise muayene 8 miRNAs arasında miR-122, miR-133a ve miR-192 öncesi amplifikasyon tespit edildi. MiR-208a ve miR-208b sonra bile öncesi amplifikasyon tespit değildi. Örnek işleme verimliliğini çivili cel-miR-238 Cq değerleri tarafından değerlendirilmiştir. Bu tahlil yöntemde teknik değişim az 3 kat olarak tahmin edilmiştir ve miktar (LLOQ) alt sınırı 102 kopya/µL, çoğu muayene miRNAs için yapıldı.

Bu iletişim kuralı plazma miRNAs miktarı daha iyi bir tahmin sağlar ve kalite değerlendirmesi farklı çalışmalar ilgili verileri sağlar. MiRNAs vücut sıvıları, ön amplifikasyon içinde az sayıda kötü tespiti geliştirmek yararlı olduğunu göz önünde bulundurarak miRNAs dile getirdi.

Giriş

Çalışmalar giderek artan sayıda edilmiş mikroRNA (miRNAs) Tanı ve Prognozunda kanserleri, biyolojik olarak keşfetmek veya izleme ve diğer hastalıklar tespit nonclinical ve klinik çalışmalar1,2',3 . Nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR (RT-qPCR) Bu teknik Mikroarray4 ve RNA sıralamanın tabanlı platformlar5daha fazla duyarlı olduğundan tek tek hedef miRNAs, değerlendirmek için kullanılan en yaygın yöntemlerden biridir. Genel olarak, miRNA ifade ΔCq yöntem6kullanarak örneği göre ölçülür. Fizyolojik değişiklikler hedef gen ifade düzeyleri soruşturma için uygun bir yaklaşımdır. Ancak, miRNAs dolaşan göreli miktar yardımcı programı onların küçük miktarlarda nedeniyle sınırlıdır. Buna ek olarak, teknik değişim zor çünkü farklı laboratuvarlar RT-qPCR deneysel protokoller farklı, hangi için tutarsız açar özelleştirebilir veya hatta çelişkili sonuçlar farklı çalışmalar, sonuçlarını karşılaştırmak yapar Farklı çalışmalar7.

Endişeleri yukarıda belirtilen içinde görüş-in mutlak miktar miRNAs vücut sıvıları içinde küçük miktarlarda değerlendirilmesi için daha uygun olabilir. Mutlak miktar yöntem bilinen ilgili hedef miRNA8için sırayla aynı sentetik RNA oligonucleotides konsantrasyonları oluşturulan standart bir eğri kullanır. Sağlık ve Çevre Bilimleri Enstitüsü (HESI) teknik komite genomik üzerinde son zamanlarda birden çok test sitede plazma miRNAs, mutlak ölçümleri sonuçlarını karşılaştırmak için kapsamlı araştırmalar yapılmıştır. Sonuçlar miRNAs mutlak Nefelometri için standart bir protokol kullanarak birden çok test siteleri9arasında karşılaştırılabilir sonuç vermedi gösterdi. Bu da çalışmanın açıklanan RT-qPCR tahlil yöntemi birden çok miRNA hedefleri ve düşük ifade miRNAs tespiti yardım etmek için ön amplifikasyon çoğaltılmış analiz içeren HESI'ın standart iletişim kuralı için hemen hemen aynıdır.

Bu çalışmada, EDTA-plazma kandan hazırlanan bir sabit hacmi (200 µL) toplanan bilinçli cynomolgus maymunlar femoral ven (n = 50) kullanılan10yapıldı. Aşağıdaki iletişim kuralı ayıklama miRNA ve RT-qPCR öncesi amplifikasyon dahil olmak üzere, plazma numuneleri, hazırlanması için yordamı açıklar. Daha da önemlisi, böylece hedef miRNAs örneklerde miktarı nitelikli bir süreç ile birlikte onaylanabildiğini protokolü hakkında ek teknik bilgiler dahil, oldu. İlk olarak, her miRNA standart eğri onun miktar biyolojik örneklerde önce kendi bireysel algılama aralığı için doğrulandı. İkinci olarak, geçerli metodoloji kalitesini kapsamlı bir dış denetim (cel-miR-238) Cq değerlerinin yoluyla değerlendirilmiştir. Bu nedenle, bu platformun farklı çalışmalar veya laboratuar sonuçlarını karşılaştırmak için daha bilgilendirici ve güvenilir veri verir.

Temsilcisi sonuçları olarak 8 miRNAs profilleri bu rapora dahil burada açıklanan tahlil yöntemi. Bu miRNAs (miR-1, miR-208a, miR-208b ve miR-499a) kalp ve iskelet kası (miR-133a ve miR-206) kemirgenler ve insanlar3(miR-122 ve miR-192), karaciğer doku yaralanması ile potansiyel Emanet biyolojik ilişkili olarak önerilmiştir, 11,12,13.

Protokol

Tüm deneyler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Daiichi Sankyo Co., Ltd. tarafından kabul edildi

1. numune hazırlama

  1. Kan (en az 0.5 mL) cynomolgus maymunlar femoral ven EDTA 2 K içeren tüpler içine toplamak.
    Not: Bu antikoagülanlar sonraki PCR14,15inhibe çünkü sitrat ve heparin kabul edilebilir değildir.
  2. Toplanan örnekleri hemen buz ve plazma yalıtım koleksiyonunun 2 saat içinde için süreç üzerine koyun.
  3. 10.000 x g 5 min için 4 ° C'de de örnekler santrifüj kapasitesi.
  4. Süpernatant Santrifüjü 16.000 x g hücre artıkları ve kalan trombosit kaldırmak 5 min için 4 ° C'de, ardından 2 mL microtube içine aktarın.
    Not: MiRNAs miktar önemli ölçüde trombosit kirlenme16tarafından etkilenebilir.
  5. 200 µL aliquots süpernatant, taze 2 mL-mikrotüpler yerleştirin ve-80 ° C'de kullanmak kadar saklamak.
    Not: Her örnek sabit bir hacim RNA çıkarma için kullanılır; Bu nedenle, aliquot hacmi tam olması gerekir.

2. RNA çıkarma

  1. Donmuş numuneler (Kimden adım 1.5) buz çözme.
    1. Örnek buza RNA ayıklama sırasında soğuk tutmak. Lizis reaktif chill ve kullanmadan üzerinde buz önce kloroform.
  2. Lizis reaktif, Sample (200 µL), fenol ve guanidin isothiocyanate monophasic solüsyon içeren 5 cilt (1000 µL) ekleyin ve 1 dk. için vortexing tarafından kuvvetle karıştırın.
  3. 5 nM sentetik 5 µL eklemek Caenorhabditis elegans miRNA (Syn-cel-miR-238-3 p).
  4. Kloroform 1 hacmi (200 µL) ekleyin ve 1 dakika vortexing tarafından kuvvetle karıştırın.
  5. 2-3 dk için buz üzerinde tutun ve 12.000 x g 15dk için 4 ° C'de de örnekler santrifüj kapasitesi.
  6. Sulu faz için yeni bir microtube dikkatli bir şekilde aktarın.
    Not: herhangi bir organik faz (kırmızı) veya Interphase (beyaz) aktarılmaz. Toplanan sulu faz hacmi artan teknik değişim sonucu tutarsızlık işleme önlemek için tek tip olmalıdır. Sulu faz bu protokol için transfer her zamanki miktarı 650 µL oldu.
  7. 1,5 birimleri (975 µL) etanol ve de yukarı ve aşağı pipetting karıştırın.
  8. Örnek bir karşılık gelen sütun ve 3 min vakum manifoldlar kullanarak için vakum kurutma ardından Bağdaştırıcı, içine aktarın. Örnek birim 700'den fazla µL ise, kalan çözüm işlemek için bu adımı yineleyin.
    Not: Sütun tabanlı RNA izolasyon vakum ve Santrifüjü yöntemi ile uyumludur.
  9. Etanol 200 µL vakum kurutma için 1 dk ardından sütun ekleyin.
  10. RWT arabellek 800 µL vakum kurutma için 2 dk ardından sütun ekleyin.
  11. RPE arabelleği 800 µL vakum kurutma için 2 dk ardından sütun ekleyin.
  12. 2.11 arasındaki adımları yineleyin.
  13. Etanol 300 µL vakum kurutma için 1 dk ardından sütun ekleyin.
  14. Sütun yeni bir microtube üzerine yerleştirin ve 12.000 x g 1 dk (15-25 ° C) oda sıcaklığında, santrifüj kapasitesi.
  15. Sütun için yeni bir microtube aktarmak ve 50 µL nükleaz ücretsiz su ekleyin.
  16. Oda sıcaklığında (15-25 ° C) 3 dk ve 1 dk. için 8.000 × g oda sıcaklığında (15-25 ° C), santrifüj taşımaktadır.
  17. Eluate sütun için yeniden uygulayın.
  18. 2.16. adımı yineleyin ve-80 ° C'de eluate kullanmak kadar saklamak.

3. cDNA sentezi

  1. Donmuş numuneler (Kimden adım 2.18) çözülme.
  2. Hedef miRNAs için karşılık gelen sentetik RNA oligonucleotides bilinen konsantrasyonu hazırlayın.
    1. Sentetik RNA Oligonükleotid qPCR içinde standart bir eğri oluşturmak için kullanın. 1 x 108 kopya/µL konsantrasyon hisse senedi çözüm depolama amacı ile hazırlanmıştır.
    2. Hisse senedi çözüm 10 kat 1 x 107 kopya/µL (değil önceden yükseltilmiş örnekleri) veya 1 x 105 kopya/µL (önceden yükseltilmiş örnekleri) çalışma çözüm standart eğri oluşturmak için en yoğun olarak elde etmek için sulandırmak. Genel olarak, standart eğri konsantrasyonları için önerilen Aralık 1 x 107 ' ye 1 x 102 kopya/µL (değil önceden yükseltilmiş örnekleri) veya 1 x 105 ' e 1 x 100 kopya/µL (önceden yükseltilmiş örnekleri) dir.
  3. Multiplex RT astar havuzu 20 x RT astar hedef miRNAs için eşit miktarda karıştırılarak hazır olun.
    Not: Şekil 2' de gösterildiği gibi 4 hedef miRNAs içeren bir havuzu 20 x RT astar her havuzda miRNAs karıştırılarak yapılabilir. Cel-miR-238 (dış denetimi) hedef miRNAs her tüpün içinde biri olarak dahil edilmelidir. Az 4 hedef miRNAs durumunda, 1/10 TE arabellek 20 x RT astar yerine eşit miktarda ekleyin.
  4. RT tepki karışımı hazırlayın: (adımından 3,3), havuz 100 mM dNTPs dTTP ile 0,15 µL, ters transkriptaz (50 U/µL), 1,5 µL 10 x RT arabellek, RNase inhibitörü (20 U/µL) 0,19 µL 1 µL 3 µL RT astar ve su 4,16 µL nükleaz ücretsiz.
  5. Mix 10 µL RT tepki pipetting tarafından RNA örnek (Kimden adım 3.1) veya oligonucleotides (Kimden adım 3.2) 5 µL karıştırın ve 5 min için buz üzerinde kuluçkaya.
  6. Ters transkripsiyon termal cycler cihazları üzerinde çalıştırın: 16 ° C 30 dk, 30 dk, 42 ° C için tarafından takip son ters transkriptaz inactivation adım 5 dk. 85 ° C'de mağaza ters kopya etmek örnekleri-80 ° c kadar kullanmak.

4. preamplification (isteğe bağlı)

Not: Cq değerleri 35 veya daha sonraki qPCR yukarıda göstermek miRNAs önceden güçlendirilmiş.

  1. Donmuş numuneler (Kimden adım 3.6) çözülme.
  2. Sentetik RNA oligonucleotides RT ürün 10 kat seri dilutions olun; 1 x 10-5 1 x 100 kopya/µL standart eğri oluşturmak için.
  3. Multiplex tahlil astar havuzu eşit birimleri (5 µL) karıştırılarak tahlil astar x 20 hedef miRNAs son konsantrasyon 200-fold seyreltilmiş her tahlil astar ile hazırlamak son hacmi 1000 µL'TE arabellek tarafından.
    Not: kimin hedef miRNAs sonraki qPCR öncesi amplifikasyon ve olanlar için cel-miR-238 (dış denetimi) olmadan tespit olabilir tahlil astar astar havuza dahil değildir.
  4. Öncesi amplifikasyon tepki karışımı hazırlayın: 2 x kullanıma hazır preamplification reaktif, tahlil astar Havuzu (Kimden adım 4.3) 3.75 µL ve su nükleaz ücretsiz 6,25 µL 12.5 µL.
  5. Mix 22,5 µL öncesi amplifikasyon tepki pipetting tarafından ters kopya etmek örnek (Kimden adım 4.1) veya oligonucleotides (Kimden adım 4.2) 2.5 µL karıştırın ve 5 min için buz üzerinde kuluçkaya.
  6. Reaksiyon termal cycler cihazları üzerinde çalıştırın: 95 ° C 10 dakika; 15 s ve 60 ° C 4 dakika süreyle-80 ° C'de önceden yükseltilmiş örnekleri kullanmak kadar saklamak için 95 ° C 12 döngüsü tarafından takip ettim.

5. kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR)

  1. Donmuş numuneler (Kimden adım 3.6 veya adım 4.6) çözülme.
  2. Örnekleri 5-fold seyreltik steril su ile.
  3. Sentetik RNA oligonucleotides türetilmiş RT ürünün 10 kat seri dilutions hazırlamak; 1 x 107 ' ye 1 x 102 kopya/µL (değil önceden yükseltilmiş örnekleri) veya 1 x 105 ' e 1 x 100 kopya/standart eğriler oluşturmak için µL (önceden yükseltilmiş örnekleri).
  4. QPCR reaksiyon karışımı hazırlayın: 2 x kullanıma hazır amplifikasyon reaktif, 20 x tahlil reaktif, ileri/geri PCR astar ve hedef miRNA için karşılık gelen yoklama içeren 1 µL ve 7 µL nükleaz ücretsiz su 10 µL.
  5. 18 µL qPCR reaksiyon karışımından hızlı optik 96-iyi tepki tabakaları bana aktarın ve (Kimden adım 5.2 veya adım 5.3) seyreltilmiş örnekleri 2 µL kuyu ekleyin.
    Not: Örnekleri ve qPCR için standartlar çoğaltmaları ayarlanır.
  6. Yapıştırıcı film ile plaka mühür ve kısaca santrifüj kapasitesi.
  7. Tepki gerçek zamanlı bir termal cycler çalıştırın: 20 95 ° C s 95 ° C 45 döngüsü tarafından takip, 1 s ve 60 ° C 20 s.

6. veri analizi

  1. Her örnek ile ilgili gerçek zamanlı termal cycler çalışan veri analiz yazılımı kullanarak ham kopya sayısını hesaplamak için.
    Not: Eşik satırı el ile çalışma, tüm plakaları "1.0" onların Cq vadilerin yasland tekrarlanabilirlik onaylamak için ayarlanır. Cut-off düzeyi Cq ayarla > 40 döngüleri.
  2. Yinelenenleri alınan her örneğin ham kopya sayısı ortalamasını hesaplamak.
  3. Düzeltme faktörü cel-miR-238 karşılık gelen tüp içinde tüm örnekleri kopya sayısı ortalama cel-miR-238 her örnek kopya sayısı bölünerek hesaplayın.
    Not: Şekil 2' de gösterildiği gibi cel-miR-238 (dış denetimi) dahil olmak üzere 4 hedef miRNAs kadar her tüp içerir. Bu nedenle, düzeltme faktörü karşılık gelen cel-miR-238 değerini kullanarak her tüp için hesaplanır.
  4. Düzeltilmiş kopya sayısını her örnek (Kimden adım 6.2) ortalama ham kopya sayısı bölerek her örnek için düzeltme faktörü (Kimden adım 6.3) tarafından hesaplamak.
  5. Tarafından her örnek (Kimden adım 6.4) ayarlanan ham kopya sayısını çarparak mutlak kopya sayısını hesaplamak için her örnek seyreltme faktörü.
    Not: Adım 5.2 türetilmiştir bu iletişim kuralı, "5" seyreltme faktörüdür.
  6. Cq değerler günlük cDNA konsantrasyon karşı her seri seyreltme için arsa PCR güçlendirme yamaç üzerinden verimliliği hesaplayın.
    Not: verimlilik hesaplamak için formül; E = (10(-1/yamaç) -1) x %100.
  7. Cel-miR-238 E formülü kullanarak tüm örnekleri Cq değerleri kullanarak teknik değişim hesaplamak = (2 x amplifikasyon etkinliği)ΔCt(Max(Cq)-Min(Cq)).
    Not: Adımlar 6.5 ve 6.7 yordamı kalite değerlendirmesi için kullanılır.

Sonuçlar

RT-qPCR tarafından miRNA testin iş akışı ve kalite assessment
Şekil 1 qPCR10kullanarak kan örnekleri miRNA tahlil iş akışı gösterir. Deneyler kalitesini cel-miR-238 dış denetimi de dahil olmak üzere tarafından doğrulanabilir. Bu RNA ayıklama teknik farklılığı ortaya çıkaracaktır ve sonraki RT-qPCR işler. Bu çalışmada, Cq değerleri 50 örnekleri hesaplanan ortalama ± SD 21,0 ±...

Tartışmalar

Bizim kapsamlı değerlendirme ölçüde bireysel örnekleri arasında varyasyon büyüklüğü test miRNAs arasında son derece farklı olduğunu açıkça belirtti dinamik aralığının daha titiz bir istatistiksel analize sağlanan. Bu varyasyonlar vücut sıvıları onların küçük miktarlarda atfedilebilecek olabilir, ancak bu veriler sadece biyolojik varyasyonları, aynı zamanda teknik varyasyonlar yansıtmak belirtmek gerekir. Teknik değişim çoğu aracılığıyla diğer tahlil platformlar...

Açıklamalar

Yazar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması vardır.

Teşekkürler

Bu araştırma belirli herhangi bir hibe finansmanı kuruluşları kamu, ticari veya değil, kar amacı gütmeyen sektörlerde üzerinden almadı.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
BD Microtainer tube (K2EDTA)Becton, Dickinson and Company365974For blood collection
Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mLEppendorf0030124359
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  1.5 mLEppendorf0030120086
Eppendorf Safe-Lock micro test tubes  2.0 mLEppendorf0030120094
Synthetic oligonucleotideHokkaido System Science-Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade)
Tris-EDTA Buffer  (pH 8.0)Nippon Gene314-90021TE buffer
Buffer RPEQIAGEN-Contents in miRNeasy mini kit 
Buffer RWTQIAGEN-Contents in miRNeasy mini kit 
miRNeasy Mini KitQIAGEN217004
Nuclease-Free Water QIAGEN129114
QIAzol Lysis ReagentQIAGEN-Contents in miRNeasy mini kit 
Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic QIAGEN219600ID:MSY0000293, 5 nmol
SC AdaptersTAIGEN Bioscience CorporationS0120For RNA extraction
VacEZor 36 Complete SystemTAIGEN Bioscience CorporationM3610For RNA extraction
7900HT Fast Real-Time PCR SystemThermo Fisher Scientific Inc.4351405Fast 96-Well Block
GeneAmp PCR System 9700Thermo Fisher Scientific Inc.9700
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction PlateThermo Fisher Scientific Inc.4346907
MicroAmp Optical Adhesive FilmThermo Fisher Scientific Inc.4311971
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific Inc.4444557
TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000248
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002245
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002246
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002222
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000491
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000510
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 000511
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 002290
TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p)Thermo Fisher Scientific Inc.4427975Assay ID: 001352
TaqMan MicroRNA Reverse
Transcription Kit		Thermo Fisher Scientific Inc.4366597
TaqMan PreAmp Master Mix (2×)Thermo Fisher Scientific Inc.4391128
Chloroform Wako Pure Chemicals035-02616
Ethanol (99.5)Wako Pure Chemicals057-00456

Referanslar

  1. Schöler, N., Langer, C., Döhner, H., Buske, C., Kuchenbauer, F. Serum microRNAs as a novel class of biomarkers: a comprehensive review of the literature. Exp. Hematol. 38, 1126-1130 (2010).
  2. Viereck, J., Thum, T. Circulating Noncoding RNAs as Biomarkers of Cardiovascular Disease and Injury. Circ. Res. 120 (2), 381-399 (2017).
  3. D'Alessandra, Y., et al. Circulating microRNAs are new and sensitive biomarkers of myocardial infarction. Eur Heart J. 31 (22), 2765-2773 (2010).
  4. Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis. BMC Genomics. 10, 407 (2009).
  5. Nassirpour, R., et al. Identification of tubular injury microRNA biomarkers in urine: comparison of next-generation sequencing and qPCR-based profiling platforms. BMC Genomics. 15, 485 (2014).
  6. Derveaux, S., Vandesompele, J., Hellemans, J. How to do successful gene expression analysis using real-time PCR. Methods. 50 (4), 227-230 (2010).
  7. Bustin, S. A. Why the need for qPCR publication guidelines?--The case for MIQE. Methods. 50 (4), 217-226 (2010).
  8. Kroh, E. M., Parkin, R. K., Mitchell, P. S., Tewari, M. Analysis of circulating microRNA biomarkers in plasma and serum using quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR). Methods. 50 (4), 298-301 (2010).
  9. Thompson, K. L., et al. Absolute Measurement of Cardiac Injury-Induced microRNAs in Biofluids across Multiple Test Sites. Toxicol Sci. 154 (1), 115-125 (2016).
  10. Iguchi, T., Niino, N., Tamai, S., Sakurai, K., Mori, K. Comprehensive Analysis of Circulating microRNA Specific to the Liver, Heart, and Skeletal Muscle of Cynomolgus Monkeys. Int. J. Toxicol. 36 (3), 220-228 (2017).
  11. Matsuzaka, Y., et al. Three novel serum biomarkers, miR-1, miR-133a, and miR-206 for Limb-girdle muscular dystrophy, Facioscapulohumeral muscular dystrophy, and Becker muscular dystrophy. Environ. Health. Prev. Med. 19 (6), 452-458 (2014).
  12. Starkey Lewis, P. J., et al. Circulating microRNAs as potential markers of human drug-induced liver injury. Hepatology. 54 (5), 1767-1776 (2011).
  13. Wang, K., et al. Circulating microRNAs, potential biomarkers for drug-induced liver injury. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (11), 4402-4407 (2009).
  14. Moldovan, L., Batte, K., Wang, Y., Wisler, J., Piper, M. Analyzing the Circulating MicroRNAs in Exosomes/Extracellular Vesicles from Serum or Plasma by qRT-PCR. Methods Mol. Biol. 1024, 129-145 (2013).
  15. Li, S., Chen, H., Song, J., Lee, C., Geng, Q. Avoiding heparin inhibition in circulating MicroRNAs amplification. Int. J. Cardiol. 207, 92-93 (2016).
  16. Cheng, H. H., et al. Plasma processing conditions substantially influence circulating microRNA biomarker levels. PLoS One. 8 (6), e64795 (2013).
  17. Serafin, A., et al. Identification of a set of endogenous reference genes for miRNA expression studies in Parkinson's disease blood samples. BMC Res. Notes. 7, 715 (2014).
  18. Akiyama, H., et al. A set of external reference controls/probes that enable quality assurance between different microarray platforms. Anal. Biochem. 472, 75-83 (2015).
  19. Kirschner, M. B., van Zandwijk, N., Reid, G. Cell-free microRNAs: potential biomarkers in need of standardized reporting. Front Genet. 4, 56 (2013).
  20. Malentacchi, F., et al. SPIDIA-RNA: second external quality assessment for the pre-analytical phase of blood samples used for RNA based analyses. PLoS One. 9 (11), e112293 (2014).
  21. Sourvinou, I. S., Markou, A., Lianidou, E. S. Quantification of circulating miRNAs in plasma: effect of preanalytical and analytical parameters on their isolation and stability. J Mol Diagn. 15 (6), 827-834 (2013).
  22. Yamaura, Y., Nakajima, M., Takagi, S., Fukami, T., Tsuneyama, K., Yokoi, T. Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis. PLoS One. 7 (2), e30250 (2012).
  23. Kirschner, M. B., Edelman, J. J., Kao, S. C., Vallely, M. P., van Zandwijk, N., Reid, G. The Impact of Hemolysis on Cell-Free microRNA Biomarkers. Front Genet. 4, 94 (2013).
  24. Mestdagh, P., et al. High-throughput stem-loop RT-qPCR miRNA expression profiling using minute amounts of input RNA. Nucleic Acids Res. 36 (21), e143 (2008).
  25. Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat. Rev. Genet. 13 (5), 358-369 (2012).
  26. Moldovan, L., Batte, K. E., Trgovcich, J., Wisler, J., Marsh, C. B., Piper, M. Methodological challenges in utilizing miRNAs as circulating biomarkers. J. Cell. Mol. Med. 18 (3), 371-390 (2014).
  27. Mangolini, A., et al. Diagnostic and prognostic microRNAs in the serum of breast cancer patients measured by droplet digital PCR. Biomark. Res. 3, 12 (2015).
  28. Miotto, E., Saccenti, E., Lupini, L., Callegari, E., Negrini, M., Ferracin, M. Quantification of circulating miRNAs by droplet digital PCR: comparison of EvaGreen- and TaqMan-based chemistries. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 23 (12), 2638-2642 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Molek ler Biyolojisay 132mikroRNAbiyomarkerplazmanicel Polimeraz zincir reaksiyonu qPCRmutlak miktarn amplifikasyon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır