Sinonasal karsinom ve koku nöroblastomlar için iki olası moleküler işaretleyici olarak OTX1 ve OTX2 tanımlama

Özet

Düzenleme çoğu yetişkin organizmalarda tümörleri ile ilgili genler Homeobox genleri bulunmaktadır. Biz onların karşılaştırmalı ifade immunohistokimyasal ve gerçek zamanlı PCR analizleri, normal ve inflamatuar burun mucosae ve onlara olası tanı ve tedavi hedefleri kullanmak için sinonasal neoplazmlar tarafından araştırdık.

Özet

OTX (HB) homeobox genleri embriyonik morfogenez ve yetişkin organizmalarda koku epitel gelişimi sırasında ifade edilir. Bu genlerinde meydana gelen mutasyonlar kez insan tumorigenesis ilgili. Veri ile ilgili OTX genler ve burun boşluğuna tümörler arasındaki olası korelasyon bugün mevcuttur. Bu çalışmanın amacı, OTX1 ve OTX2 olarak nazal tümör gelişiminde moleküler belirteçleri kabul edilebilir eğer anlamaktır. Biz immunohistokimyasal ve gerçek zamanlı PCR analizleri OTX1 ve OTX2 genlerin ifade araştırmak için Burun kemiği ve sinonasal Adenokanserine seçildi. OTX1 ve OTX2 devamsızlık saatlerinizi tüm örneklerinde sinonasal bağırsak tipi Adenokanserine (ITACs). OTX2 mRNA sadece koku nöroblastomlar (ONs) ifade edildi iken OTX1 mRNA sadece sigara-Intestinal tip Adenokanserine içinde (NITACs) tespit edilmiştir. OTX1 ve OTX2 genler için fark gen ekspresyonu sinonasal tümör farklı tür ayırt edilebilmesi için yararlı bir moleküler işaretçisi olabilir göstermiştir.

Giriş

OTX HB genler (otd) Drosophila orthodenticle genlerin omurgalı homologue ve onlar normalde sırasında embriyonik morfogenez ifade edilir transkripsiyon faktörleri için kodlamak, ama onlar da farklı fonksiyonları ile yetişkin canlı ifade edilebilir . Embriyonik gelişim sırasında hücre kimliğini, hücre farklılaşma ve vücut axis¹ konumlandırma belirtimi kontrol ediyorlar. OTX ailesi farklı işlevler görüntülemek OTX1 ve OTX2 gen içerir. OTX1 beyin ve duyu organı geliştirme ilgilenmektedir. Yetişkin canlı duyu organları ifade edilir ve²hipofiz ön LOB düşük seviyelerde sentezlenir; Bu da hematopoiesis, hematopoetik pluripotent ve progenitör hücrelerin³ifade bir rol oynar. OTX2 rostral başından gelişiminde ilgilenmektedir ve onun çevrilmiş protein eylemleri bir morphogen olarak hangi diğer genler yoluyla bir degrade üretir çünkü aktif veya böylece hücreye katkıda spatio-zamansal bir şekilde bastırılmış nükleer silahların yayılmasına karşı ve farklılaşma. Yetişkin organizmada OTX2 sadece choroid plexus ve epifiz bezi⁴' te bulunur.

OTX genlerdeki mutasyonlar kez insan Konjenital, somatik veya metabolik kusurları görünümünü ilişkilidir. Onlar düzgün hücresel büyüme ve/veya farklılaşma⁵kontrol etmek mümkün değilse kazanç veya kaybın OTX genlerdeki mutasyonlar tumorigenesis teşvik. Kanserini ve kanserleri de olduğu gibi birçok solid tümör (örn., medulloblastomas⁶, agresif non-Hodgkin kanserleri², meme karsinomlar⁷, kolorektal kanserler⁸ve Retinoblastom⁹), kuralsız OTX HB genler iyi belgelenmiş¹⁰ifadesidir. Buna ek olarak, OTX2 mutasyonlar anophthalmia ve microphtalmia¹¹ bu gen göz geliştirme kontrolü için çok önemli rolü nedeniyle durumlarında gösterilmiştir.

Katı neoplazmlar bağlamında, moleküler ve fenotipik işaretleri keşfi tanı, sınıflandırma ve tümör¹¹burun ve paranazal köken de dahil olmak üzere, çeşitli tedavi için önemli bir sorun olduğunu. sinüsler. Aslında, bu rağmen bu alanlarda sadece mütevazı bir anatomik alan, Mukozal epitel, bezleri, yumuşak doku, kemik, kıkırdak veya sinirsel/nöroektodermal işgal, ve hematolymphoid hücreleri genellikle karmaşık ve histolojik olarak farklı kökeni için site olabilir tümör grupları. Neoplazmlar sinonasal yolu içeren farklı türde çeşitli ne genellikle üst aerodigestive sistem veya bile vücut¹²birçok yerinde boyunca görülen üstesinden özellikler mevcut. Sinonasal maligniteler nadirdir ve 1:100,000 nüfuslu bir yıllık insidansı dünya çapında mevcut ve bu yüzden bu çalışmalar ile ilgili tumorigenesis ve alternatif tedavi stratejileri test yolları önler. Buna rağmen teknikleri, Imaging'de gelişmeler cerrahi yaklaşımlar ve radyoterapi sinonasal kanser klinik yönetiminin iyileştirilmiştir. Ayrıca, hücre hatları gibi hayvan modelleri ve kanser genetik profilleme gelişimi şu anda gelecekte hedeflenen antikanser terapiler¹³temelini oluşturmaktadır. Bugüne kadar neoplazmlar OTX1 ve/veya OTX2 ifadede burun boşluğuna, paranazal sinüsler ve nazofarinksi ilgili hiçbir raporlar vardır. Daha önce meme kanseri⁷' OTX1 ve OTX2 dahil olan gözlemledim beri bu genler mevcut değil sadece normal nazal mukoza aynı zamanda burun boşluğuna içinde tümörler olup olmadığını merak etti. Biz "Ospedale di Circolo" Varese örneklerinde normal mukoza ve 1985 2012'ye toplanan ve Dünya Sağlık Örgütü (WHO) göre sınıflandırılmış Burun kemiği ve sinonasal Adenokanserine patoloji Bölümü elde edilen bu hedefe ulaşmak için Baş ve boyun tümörleri sınıflandırılması. Gerçek zamanlı PCR ve immünhistokimya analizleri çözümlemek seçtiğimiz ve bu tür tümör moleküler işaretleyiciler düşünülebilir eğer belirlemek için OTX1 ve OTX2 ifade değerlendirilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm çalışmaları (1975) Helsinki Bildirgesi ile aydınlatılmış onam yazılı ve Varese Insubria Üniversitesi etik kurul tarafından onaylanmış göre yapıldı.

1. toplama örnekleri

1. Toplamak ve insan Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) örnekleri WHO sınıflamasına göre baş ve boyun tümörleri¹⁴göre farklı alt gruplar bölmek.
   Not: Aşağıdaki örnekleri burada kullandığımız: Normal sinonasal mukoza kontrolü (10 örnekleri); Ters Papilloma (IP, ICD-O kodu 8121/1); Sinonasal ITAC (ICD-O kodu 8144/3, 32 örnekleri); NITAC (ICD-O kodu 8140/3, 12 örnekleri); Adenoid Kistik Karsinom (ACC, ICD-O kodu 8200/3); Pleomorfik adenom (PA, ICD-O kodu 8941/3); (ICD-O kodu 9522/3, 13 örnekleri); Ayrıştırılan kötü nöroendokrin Karsinomu (PDNEC, ICD-O kodu 8041/3, 19 örnekleri); Nöroendokrin tümör (NET, ICD-O kod 8041/3).

2. İmmünokimya

1. Deparaffinization ve rehydration bölümleri
   1. Örnek slaytlar bir fırında 30 dk 60 ° C'de ısı ve su bir alkol serisi kullanarak 3 µm kalınlığında FFPE bölümleri rehydrate.
   2. Kısaca slaytları Ksilen 10 dakika yıkayın ve bu adımı yineleyin; 5 min için slaytlar %100 alkol yıkama ve % 95, % 85 ve % 75 alkol seri olarak kullanarak bu adımı yineleyin. 5 dakika içinde distile su slaytlarını durulayın.
2. Endojen etkinlik engelleme
   1. Endojen faaliyetleri % 3 sulu hidrojen peroksit 12 dk için slaytları yerleştirerek engellemek.
3. Antijen alma
   1. Antijen alma ile 10 mM bir mikrodalga tedavi 10 min için sitrat arabellek (pH 6) tedavisi ile gerçekleştirin.
4. Kuluçka birincil antikor ile
   1. TBS arabellek (pH 7,4) bölümlerinde yıkayın, sonra 10 dakika için engelleme çözüm ekleyin.
   2. TBS arabellek (pH 7,4) bölümlerinde yıkayın, sonra %0,2 Triton X ekleyin.
   3. Gecede keçi Anti-insan OTX2 antikor seyreltilmiş 1: 100 ile 4 ° C'de kuluçkaya.
5. Kuluçka ikincil antikor ile
   1. Biotinylated tavşan Anti-keçi ikincil antikor seyreltilmiş 1: 200 ABC-peroksidaz kompleksi tarafından takip ile oda sıcaklığında 1 h için bölümleri kuluçkaya ( Malzemeleri tablolarıgörmek).
6. İmmunoreaction geliştirme
   1. 3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride kullanarak immunoreaction geliştirmek ve Harris Hematoksilen ile çekirdeği counterstain.
7. Montaj ve görüntüleme
   1. Bir Hilal alkol ölçeği kullanarak bölümleri kurutmak ve Terpen kökenli bir takas madde kullanarak bunları açıklamak ( Tablo malzemelerigörmek). Montaj orta bölümleri embed, bölümleri bir mikroskop slaytta yer ve bölümleri bir optik mikroskobu gözlemlemek.

3. RNA çıkarma ve ters-transkripsiyon

1. RNA çıkarma
   1. RNA immunoprecipitation Protokolü (bakınız Bölüm 2.1) ilk adımı uygulayarak bölümleri ayıklamak ve slaytları distile suda tut. Günahı bölümleri ilgili Hematoksilen-parçaları ilgi tanımlamak için bölümler lekeli Eozin ile çakışıyor.
   2. FFPE örnekleri ( Tablo malzemelerigörmek) ve aşağıdaki prosedürü yerine getirin için ticari bir RNA ekstraksiyon kiti kullanarak RNA ayıklama gerçekleştirmek.
2. RNA ters-transkripsiyon
   1. Retro uyarlamak-RNA cDNA için ticari bir setini kullanın (bkz. Tablo reçetesi) protokol sonrası. Retro-uyarlamak en az 1000 ng birkaç çözümlemesi yapma toplam RNA'ın.

4. gerçek zamanlı PCR ve veri analizi

1. Gerçek zamanlı PCR
   1. Nicel gerçek zamanlı PCR analizleri (qRT-PCR) prob tabanlı teknoloji ile gerçekleştirmek ( Tablo malzemelerigörmek) ve termal cycler.
2. PCR reaksiyon karışımı hazırlanması
   1. Sonda tabanlı ana karışımı 12.5 µL PCR reaksiyon karışımının hazırlamak, OTX1, OTX2 ve ACTB her 1,25 µL probları (bkz. Tablo reçetesi) 50 ng cDNA ve nükleaz ücretsiz su toplam hacminin 25 µL.
   2. Bütün tepkiler nüsha ACTB gen gen ifade düzeyleri normale endojen denetimi olarak kullanarak gerçekleştirin.
   3. Plaka 1,109 x g 3 dk santrifüj kapasitesi ve deneme kadar ışık 4 ° C'de korunuyorsunuz plaka saklayın.
3. Termal cycler ayarlama
   1. 40 devredir 15 95 ° c termal cycler profil bir ilk sıcak başlaması ile birlikte döngüsü 50 ° c 2 dakika ve 10 dakika, 95 ° C kümesi ardından s ve bir final çevriminde 60 ° C'de 1 dak.
4. Gen ifade düzey analizleri
   1. ACTB gen endojen denetimini kullanarak karşılaştırmalı döngüsü eşik (ΔCt) yöntemi ile gen ifade düzeyleri normale.
   2. 2^-ΔCt yöntemini kullanarak gen ifade düzeyini değerlendirin ve sonuçları arsa.
5. İstatistiksel analizler
   1. İstatistiksel analizler öğrencinin tkullanarak gerçekleştirmek-testi, p < 0,05 ile istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar göz önüne alındığında.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Normal mukoza OTX genler siliyer pseudostratified türü solunum epitel ve submucosal glandüler hücreler (şekil 1A) için güçlü ve homojen nükleer reaktivite görülmektedir. Bulduk nükleer ifadede tüm NITACs örnekleri (şekil 1B), az ise veya immunoreactivity OTX1 için ITACs (şekil 1 c) vurgulandı. Yoğun immunoreactivity mevcut tüm ONs (şekil 1 d); PDNEC...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu çalışmada gösterir, mRNA düzeylerine göre ilk defa OTX1 ve OTX2 HB genler ifade normal sinonasal mukoza ve submucosal bezleri, inflamatuar polipler, sinonasal Schneiderian papillomas ve farklı epitel ve nöroektodermal neoplazmlar, Skuamöz Karsinom, bağırsak türü sinonasal Adenokanserine, Tükürük bezi tipi tümörler, nöroendokrin neoplazmlar ve ONs da dahil olmak üzere.

Değişiklikler ve sorun giderme:

RNA yıkımı önlemek için biz patoloji lab...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation	Applied Biosystem	AM1975
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Applied Biosystem	4368814
TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG	Applied Biosystem	4326614
ABI Prism 7000	Applied Biosystem	270001857
ACTB probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
OTX1 probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
OTX2 probe	Applied Biosystem		Out of production. Sequence protected by copyright
Acqueous Hydrogen Peroxide	Merk	1072090250
Citrate Buffer	Sigma-Aldrich	20276292
Triton	Sigma-Aldrich	101473728
Tris	Merk	108382
NaCl	Merk	106404
Goat Anti-OTX2 Antibody	Vector Laboratories		Out of production. Catalog number not available
Rabbit Anti-Goat Antibody	Vector Laboratories	BA5000
ABC-Peroxidase Complex	Vector Laboratories	PK6100
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB)	Sigma-Aldrich	D5905
Harris Hematoxylin	Bioptica	0506004/L
Pertek	Kaltek SRL	1560
BioClear	Bioptica	W01030799