İsteğe bağlı 2D değişiklik ile akıcı 3D serebellar farklılaşma Protokolü

Özet

Biz bir basitleştirilmiş 3D farklılaşma tanımlanan protokolü kullanarak hPSCs, orta tarif ve büyüme faktörleri, erken neuroepithelial yapıları ile hücre toplamları oluşturma yeteneğine ve serebellar ilişkili işaretçileri, hem de bir isteğe bağlı için olumlu azaltılmış Hücreleri işlevsel sinir hücreleri oluşturmak için monolayer ayırt için 2D değişiklik.

Özet

Karmaşıklık ve farklılaşma protokolleri maliyetini azaltarak araştırmacılar için önemlidir. Bu faiz olası istenmeyen etkileri dışsal desenlendirme faktörler model beyin gelişimi ya da hastalık fenotip maskeleme gibi patofizyolojisi, insan pluripotent kök hücre (hPSC) oluşturabileceğine kaygıları ile uyuyor. Burada, iki serebellar farklılaşma protokol için tasarlanmış basit başlangıç yöntemini, daha az desenlendirme faktörler ve daha az önceki iletişim kuralları daha malzeme gereksinimleri hPSCs, mevcut. Son zamanlarda, biz serbest yüzer 3 boyutlu (3D) ürünleri beyin "organoid" iletişim kuralları türleri Morfoloji beyin gelişimi gibi alt/ventrikül bölge - modelleme ile ilgili ve rhombic de dahil olmak üzere diğer tutarlı oluşturmak kültür yordamlar geliştirilen dudak benzeri yapılar. İkinci ürün serebellar ilişkili işaretçileri için olumludur ve nöron benzeri kalsiyum influxes sergilemek gibi fonksiyonel serebellar nöronlar, üretme yeteneğine sahip gösterilir tam farklılaşma yapışık, 2D monolayer yordamına kullanır. Birlikte, bu protokoller bilim adamları aerodinamik sinirsel saptamaları diğer türleri test etmek için farklı araştırma amaçlı, hem de bir temel modeli için uygun seçenekleri sunuyoruz.

Giriş

Vitro iletişim kuralları hPSCs serebellar soy doğru başlangıçta differentiating için in vivo Serebellar geliştirme^1,2,3,4taklit eden ilke üzerine işletilen. Bu nedenle, onlar bir arkaya faktörlerin sürücü pro serebellar desenlendirme ve olgunlaşma için belirli zamanlarda tanıttı gerekli. Bunlar arasında Şef WNT, vardı kemik morfogenetik proteinler (BMP) ve orta arka beyin gelişimi ve oluşumu isthmic Organizatör^5,6,7bilinen rolleri ile fibroblast büyüme faktörleri (FGFs). Tabii ki, her ek adım ve faktör emek yoğun işlemler ve daha fazla gider bir artış için araştırmacı anlamına gelir, ve çok daha basit protokolleri eşit sonuçları ulaşma yeteneğine sahip gelişmekte olan ilgi. Hücreleri üzerinde kendi geliştirme içinde vitroböyle sıkı, dış denetim gerektiren olup olmadığını pratik bu sorun güzel varsayımsal soru ile dovetails.

Serebellar farklılaşma için 2015 yılında yayınlanan bir protokol amacıyla⁸desenlendirme için sadece FGF2, FGF19 ve stromal hücre kaynaklı faktörü 1 (SDF1) kullanarak büyüme faktörlerinin geniş bir numarasını kullanarak gerekliliği ele. Bu çalışma aynı zamanda bir serbest yüzer 3D kültür sistemi kullanılarak önceden serebellar kurallarından farklıydı. Serebellar işaretçileri için hücreleri olumlu üreten ek olarak, "kendi tekniği ile üretilen beyin organoids" ilgili Morfoloji, rhombic dudak benzeri yapıları gibi geleneksel 2D monolayer kültürlerde kullanılamaz sergilemek gösterilmiştir. Daha az karmaşık ve pahalı büyüme faktörleri, tek tip embryoid organları (EBs) ve 96-şey tabak (96WPs), kültür gibi diğer özellikleri ile ilgili olarak her ne kadar ilk adımları uyguladığınızda procedurally karmaşık yaptı. Başka bir 3D protokol aynı yıl yayınlanan, sinirsel soy yaygın ve ucuz hücre kültürü teknikleri⁹kullanarak için başarılı farklılaşma bildirdi. Her ne kadar bu grup serebellar farklılaşma yerine kortikal araştırıyordu, uygulama serebellar farklılaşma için onların kavramının indirimli değil.

Biz son zamanlarda desenlendirme faktörlerin azaltılmış bir kullanan bir 3D serebellar farklılaşma Protokolü rapor (yani, FGF2, 4 ve 8), yanı sıra boyunca orta gereksinimleri¹⁰en aza indirmek için 6-şey levha (6WPs) hücreleri tutarak basitleştirilmiş bir Kur. Granül hücrelerinin üretimini yardımcı olmak için smoothened agonist (SAG) son olgunlaşma adımı sırasında kullanıldı. SAG olduğunu daha önce serebellar protokolleri, granül hücre öncüleri (GCPs) vivo^1,2, büyüme teşvik rolü nedeniyle kullanmıştı sonic kirpi (SHH), daha az pahalı bir kimyasal alternatif ^11,12,13. Farklılaşma ürünleri serebellar ilişkili işaretçileri varlığı morfolojik ilgili yapıları^8,9' da dahil olmak üzere diğer 3D protokollerinden gelen tutarlı edildi. Böyle sonuçlar asla bilemeycek ayrıntılı önceki mesajı takviye vivo çevre karmaşık 3D vitro farklılaştırma protokolleri için gerekli olmayabilir.

3D protokolüne ek olarak, bu rapor aynı hızlı kurulum ile temel malzemeler, tasarlanmış bir 2D protokolünü açıklar ve büyüme faktörleri sayısını azalttı. Bu insan embriyonik kök hücreleri (hESCs) hücrelerden üretebilen veya pluripotent kök hücreler (hiPSCs) indüklenen, işaretçileri için olumlu associated ile erken sinirsel, serebellar ve granül hücre kimlikleri. Buna ek olarak, kalsiyum görüntüleme fonksiyonel insan nöronlar varlığını gösterir. Araştırmacılar, ya da bu ilgi için protokolleri arasında seçmek için yetenek ekler bir düzeyde bir esneklik: (1) üreten belirli hücre türleri, (2) modelleme insan beyin gelişimi ve ilişkili yapıları, (3) analiz monolayer içinde en iyi duruma getirilmiş ayarlar (örneğin, yama-kelepçe kayıtları) veya (4) hücre-hücre etkileşimleri karışık sinirsel kültürlerde. Basit ve düşük maliyetli doğaları onları erişilebilir hPSC alana yeni veya temel hPSC yordamlar daha fazla farklılaşma seçenekleri keşfetmek için gerek araştırmacılar için yapar.

Protokol

1. hazırlıkları

Not: tüm Malzemeler tablo belirli maddeler için bkz.

1. 500 mL tanımlanan hPSC kültür orta hPSC kültür için hazırlamak
   Not: Orta adımları 2.1-2,6 için kullanın.
   1. HPSC orta ek gecede (o/n) 4 ° C'de erimek HPSC temel Orta 12,5 mL orta şişeden kaldırın, sonra 10 mL ek ve 2.5 mL (100 U/L yapma) ekleyin penisilin/streptomisin (kalem/Strep) şişe için.
   2. 4 ° C'de depolayın ve 2 hafta içinde kullanın.
      Not: HPSC orta hücreleri aşağı 10 µM ROCK inhibitörü (RI) ve % 10 DMSO ekleyerek dondurmak için kullanılabilir.
2. 1 L sinirsel bakım orta (NMM) farklılaşma kültür için hazırlamak
   Not: orta 3.1-4.4 adımları için kullanın.
   1. Mix glutamin müstahkem DMEM/F12 ve sinirsel temel (1:1 oran) ortamda bir 1 L şişe, sonra ilave (1 x) N2 ek ile (1 x) B27 ek, 5 µg/mL insülin, 1.5 mM L-glutamin, 100 µM esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), 100 U/L kalem/Strep ve 10 µM Beta-mercaptoethanol.
   2. Orta 4 ° C'de depolayın ve 3 hafta içinde kullanın.
      Not: karışık Bazal ortamına takviyeleri eklemeden önce eklenen bileşenler üzerinde hisse senedi konsantrasyonları dayalı gerekli birim için ayarlamak için uygun birim kaldırın.
3. HPSCs passaging için 500 mL 0.5 mM EDTA çalışma çözeltisi hazırlamak
   Not: Orta 2.4 ve 2.5 adımları için kullanın.
   1. Akış başlık altında 49 mL, fosfat tamponlu tuz (PBS) 500 mL steril PBS şişeden bir 50 mL tüp aktarın. 0.5 mL 0.5 M EDTA ve 0.9 g NaCl 50 mL tüp ekleyin. Karışımı yavaşça dağıtılması için.
   2. Filtre sterilize etmek çözüm bir 0,22 µm filtre ve transfer 500 mL steril PBS şişe için kullanarak. (RT) oda sıcaklığında saklayın.
4. HPSC kültür plakaları hPSC kültür için hazırlamak.
   Not: tabak adımları 2.1-2,6 için kullanın.
   1. 50 x çalışan çözüm yapisan kaplama (PAAC) hPSC uygun yapmak: PAAC o/n 4 ° C'de bir şişe tezcan PAAC 1:1 oranında DMEM/F12 ve transferi ile 1,5 mL tüpler içine 400 µL aliquots sulandırmak. 50 x çalışma çözüm PAAC-80 ° C'de depolayın
      Not: (önemli) PAAC hızlı bir şekilde RT katılaşır, bu nedenle tüm bileşenleri (DMEM, tüpler, vb) buz üzerinde (veya 4 ° C'de) tutulmasını gerekli değildir.
   2. Tüp 50 x çalışan çözüm PAAC 4 ° C'de erimek, sonra soğuk DMEM/F12 50 x oranında seyreltin. 750 µL/kuyu seyreltilmiş PAAC için bir 6WP ekleyin. Plaka için en az 1 h 37 ° C'de kuluçkaya
      Not: PAAC plaka 4 ° C'de 1 hafta için 1 h Kuluçka döneminden sonra plaka sarma tarafından depolanabilir. Kullanmadan önce 37 ° C sıcak plaka.
5. Anti-yapıştırıcı (AA) plakalar farklılaşma kültür için hazırlamak
   Not: tabak adımları 3.1-4.1 için kullanın.
   1. 5 mg/mL olun Poli (2-hydroxyethyl metakrilat) (Poli-HEMA) çözüm % 95 etanol. Net bir çözüm elde edilir kadar o/n 37 ° C'de sallamak. Mağazada RT.
      Not: 0,22 µm filtresi filtre undissolved Poli-HEMA kaldırabilirsiniz.
   2. Poli-HEMA her kuyunun kapsar kültür plaka ekleyin. Plaka 37 ° C'de 2 gün kuluçkaya ve kalenin tam buharlaşma sıvı/üniforma kaplama Wells emin olmak için incelemek. AA plaka sarılmış ve RT. saklı
6. Poly-L-Ornithine/Laminin (PLO/LAM) plakalar farklılaşma kültür için hazırlamak
   Not: adımları için 4.2-4.4 tabak kullanın.
   1. Steril PBS içinde çözünmüş 20 µg/mL PLO kullanarak Wells, yüzey alanı kat. Plaka o/n 37 ° C'de kuluçkaya PLO Aspire edin ve 3 kez PBS ile durulayın.
      Not: (İsteğe bağlı) Incubated plaka PLO ile sarılmış ve ihtiyaç kadar 4 ° C de depolanır.
   2. PLO kaplı Wells yüzey alanlarını kat, 10 µg/mL LAM kullanarak çözünmüş steril PBS. En az 2 h 37 ° C'de veya o/n 4 ° C'de için kuluçkaya LAM kaldırmak ve yıkama kuyuları PBS ile 2-3 x, sonra hemen uygun orta ve/veya hücreleri ekleyin.
      Not: (İsteğe bağlı) kaldırıldı LAM çözüm 4 ° C'de depolanan ve en fazla 2 kez yeniden kullanılır. (Önemli) LAM kaplı yüzeyler kurumasına izin vermez; önlemek için bu hemen Ekle PBS veya uygun orta.
       

2. iletişim kuralı 1: Besleyici-Alerjik hPSC kültür

Not: hESCs bir ticari olmayan kuruluştan elde edilmiştir (H01 satır, Tablo malzemelerigörmek). Üç hiPSC kontrol şeritleri (hvs51, 60 ve 88) fibroblast (fibroblastlar anonim, Sigara olarak tanımlanabilen bağışçılardan türetilmiş ve bu nedenle IRB onay muaf) üç sağlıklı insan hastalardan yeniden programlama tarafından oluşturulan^{10, 17}.

1. HPSCs besleyici-Alerjik kültüründe korumak
   1. Sonra çözülme ve hPSCs hPSC orta PAAC levha üzerine kaplama (bkz. Adım 2.2), % 5 CO₂37 ° C'de hPSCs korumak. HPSC orta günlük (bkz. Adım 2.3) hariç gün çözdürme serinletmek ya da passaging sonra ve hücrelerin mikroskop altında incelemek (hedefleri: 2.5x/0.06, 5 x / 0,12 Ph0, 10 x / 0,25 Ph1) büyüme oranı ve farklılaşma (şekil 3 potansiyel alanları belirlemek gözlemlemek için , üst sol panelde örnek farklılaşma gösterir).
   2. Her 3-4 gün hPSCs geçiş veya ne zaman ulaşır Kültür > % 80 izdiham. Hücreleri sergi farklılaşma, kullanım normal hPSC yöntemi passaging % 5'den az (2.4 bkz. adım eğer), aksi takdirde nazik yöntemi kullanın (bkz. Adım 2.5). Kültür gerek kalmadığında, hPSCs uzun süreli depolama için dondurulmuş olabilirler (bkz. Adım 2.6).
2. Tezcan hPSCs hPSC orta
   1. HPSC orta gerekli hacmi çözdürme işleminin (9 mL/kriyojenik tüp) steril tüpler ve çözdürülen hücreleri almak için hazırlanan PAAC plaka aktarın. Her iki tüpler ile 10 µM RI ortamda ek.
   2. Cryotube LN₂ depolama ve yer doğrudan bir su banyosu (37 ° C) alın. Ne zaman sadece küçük bir kristal kalır buz, su banyosundan kaldırmak ve çözdürme işlemi için tüp kriyojenik tüp içeriğini aktarmak (toplam hacmi 10 mL). 290 x g RT., 5 min için de tüp santrifüj kapasitesi
   3. PAAC kaldırmak için serolojik pipet kullanın (bkz. Adım 1.4) çözüm PAAC plaka kuyulardan amaçlanan hücrelerini ve hPSC orta 10 µM RI ile eklemek.
      Not: PAAC çözüm emme bir iğne veya aspiratı kuvvetlendirmek ve vakum pompası için satırları yapışmasına neden olabilir (önemli).
   4. Tüm tüpünden süpernatant kaldırın ve hPSC orta 10 µM RI ile hücrelerde resuspend. Hedef plaka 1 kriyojenik tüp/kuyu 6WP oranı, hücrelere dağıtabilirsiniz. %5 CO₂37 ° C'de kuluçkaya ve orta 1 gün için yenileme değil.
      Not: %5 O₂ hücreler başlangıç hücre yaşam artırabilir.
3. HPSC orta Yenile
   1. HPSC orta RT, steril bir tüp veya bir su banyosu gerekli hacmi sıcak; 6WP 2 mL/kuyu önerilmektedir.
      Not: (İsteğe bağlı): hPSC orta ilave bir miktar ekleyerek, hPSCs refreshing; olmadan fazladan bir gün kalabilir Ancak, bu birden çok kez bir hafta izin vermez.
   2. Orta hPSCs içeren kuyulardan Aspire edin ve taze hPSC orta ekleyin.
   3. Bir kuluçka 37 ° C ve % 5 CO₂hPSCs kültür.
4. Geçit hPSCs hPSC orta
   1. Steril tüpler, passaging işlemi için ve pasajlı hücreleri almak PAAC plaka hazırlanması için gerekli hPSC orta hacmi aktarın. Orta 10 µM RI ile hedef plaka için ek. Orta tüpler RT veya bir su banyosunda ısıtın.
      Not: bir alternatif kaplama malzemesi birden kullanarak Tablo reçetesilisteleniyorsa hazırlama ve işleme farklı olacaktır.
   2. PAAC kaldırmak için serolojik pipet kullanın (bkz. Adım 1.4) çözüm PAAC plaka kuyulardan amaçlanan hücrelerini ve hPSC orta 10 µM RI ile eklemek.
      Not: (önemli) yapmak değil bir emme PAAC çözüm iğne, kuvvetlendirmek ve vakum pompası için satırları yapışmasına neden olabilir gibi Aspire edin.
   3. Orta hPSCs ile kuyulardan pasajlı, 0,5 mM EDTA, iki kez hücrelerle yıkayın sonra 0,5 mM EDTA eklemek ve 37 ° C'de 2-5 min için kuluçkaya Aspire edin
      Not: 1 mL/iyi 6WP, EDTA yeterli bir birim çamaşır ve kuluçka için değil.
   4. Mikroskop altında kuyu kontrol (hedefleri: 2.5x/0.06, 5 x / 0,12 Ph0, 10 x / 0,25 Ph1). Hücreleri ayırmak başlıyor, EDTA çözüm ve floş hücreleri hPSC orta kullanarak ücretsiz Aspire edin.
      Not: Bütün hPSC kolonileri EDTA alıyorum ne zaman kaldırmak için değil (önemli) Take care (tüm kolonileri ayırma kadar beklemeyin). Bu hPSCs zarar ve pluripotency etkiler gibi hücreleri fazla 5 kez floş değil. Ayrıca, onlar yeniden plaka için uygun gibi hPSC orta RI ile wells, hücrelerden kızarma önce stand hücreleri izin vermeyin.
   5. Ampirik belirlenmesi (genellikle ile ilgili izdiham, koloniler ve büyüme oranı boyutunu) bağlı olarak, bir yarma oranı 1:4-1 kullanarak hedef plaka wells için hPSCs transfer: 16(, orijinal plaka 1 kuyudan hedef 4 kuyu için plaka). %5 CO₂37 ° C'de kuluçkaya ve orta 1 gün için yenileme değil.
      Not: 1:16-1:20 kalabalık önlemek ve koloniler görünümünü iyileştirmek mümkün olduğu kadar yüksek oranları bölme.
5. Nazik-yöntem (G-yöntem) kullanarak geçiş hPSCs
   1. Steril tüpler, passaging işlemi için ve pasajlı hücreleri almak PAAC plaka hazırlanması için gerekli hPSC orta hacmi aktarın. Orta 10 µM RI ile hedef plaka için ek. Sıcak orta tüpler RT veya su banyosu 37 ° C'de
   2. Kullanım PAAC plaka kuyulardan Kaldır PAAC çözüm için serolojik pipet (bkz. Adım 1.4) hücrelerini ve hPSC orta 10 µM RI ile eklemek tasarlanmıştır.
      Not: değil aspiratı PAAC emme bir iğne veya kuvvetlendirmek ve vakum pompası için satırları yapışmasına neden olabilir (önemli).
   3. Orta pasajlı için hPSCs ile kuyulardan Aspire edin ve iki kez 0,5 mM EDTA kullanarak hücreleri yıkayın. İkinci yıkama, daha önce EDTA, alıyorum bekle 30 s sonra PBS 1 mL ekleyin ve 4-9 dk 37 ° C'de için kuluçkaya Beklerken, PBS 4 mL steril bir tüpü hazırlayın.
      Not: 1 mL/iyi 6WP, yıkama için EDTA yeterli miktarda var.
   4. Mikroskop altında kuyu kontrol (hedefleri: 2.5x/0.06, 5 x / 0,12 Ph0, 10 x / 0,25 Ph1). Hücreleri ayırmak başlatıyorsanız, dikkatle ücretsiz kolonileri yardım için plaka tarafında dokunun. Ne zaman > %50 kolonileri yüzer boş, 1 mL PBS kolonilerde 4 mL PBS içeren tüp aktarmak için 5 mL serolojik pipet kullanın (değil triturate).
      Not: (HPSC kültürünü temizlemek için amaç bu yanaönemli), hücre kalır farklı olup olmadığını belirlemek için kontrol plaka bağlı. Ayrıca, içinde bu süreci iyi kullanarak bağlı kalır kolonileri kalabilir öylesine tüm kolonileri geçiş gerekli değildir.
   5. RT tüp yerleşmek hücreler için 5-10 dk bekle (değil santrifüj kapasitesi). PBS kapatılan hPSCs kaldırmak için değil dikkat çekici tüpünden Aspire edin. Dikkatle hPSC orta hücrelerde resuspend (triturate değil) ve hücreleri bölme oranı 1:4-1 kullanarak hedef plakasına transfer: 16. %5 CO₂37 ° C'de kuluçkaya ve orta 1 gün için yenileme değil.
6. HPSCs dondurma
   1. İzdiham bağlı olarak 1-2 dondurma şişeleri LN₂depolama için doldurmak için 2-3 gün (kültür, maksimum), de hPSCs, 1 kullanın.
   2. Passaging (Adım 2.5) sonunda 500 µL kullanın veya aktarmak için hPSC orta 1 mL hücreleri 6WP de 1 1 veya 2 dondurma şişeleri için sırasıyla (500 µL/flakon). Her tüp, 2 x orta içeren hPSC orta, 20 µM RI ve % 20 DMSO buz gibi 500 µL ekleyin.
      Not: (İsteğe bağlı) hücreleri doğrudan 1 x 1 mL/flakon orta dondurucu transfer edilebilir.
   3. Soğutmalı 4 ° C ve mağaza-80 ° C'de hemen önceden (isopropanol içeren) kriyojenik kapsayıcı kriyojenik tüplerde yerleştirin
   4. Ertesi gün, uzun süreli depolama için bir LN₂ tank kriyojenik tüpler aktarın.

3. Protokolü 2: 3D "Organoid" farklılaşma

1. Değiştirilmiş G-hPSCs passaging yöntemi ile farklılaşma Kur
   1. NMM hedef kuyu sayısı için gerekli hacmi için steril bir tüp aktarın. 4 ng/mL FGF2 ve 10 µM RI ek. Orta tüp RT veya su banyosu 37 ° C'de sıcak
      Not: köken wells izdiham bağlı olarak hPSCs hedef plaka 2:1 veya 3:1 dağıtım sırasında oranı (Yani, orijinal plaka 2 kuyulardan 1 de hedef plaka), 2.5 mL/iyi bir son hacmi ile yoğunlaşmıştır 6WP.
   2. Farklı için hPSCs içeren kuyulardan orta Aspire edin ve iki kez 0,5 mM EDTA kullanarak hücreleri yıkayın. İkinci yıkama, daha önce EDTA, alıyorum bekle 30 s sonra PBS 1 mL ekleyin ve 4-9 dk 37 ° C'de için kuluçkaya Beklerken, PBS 4 mL steril bir tüpü hazırlayın.
      Not: 1 mL/iyi 6WP, yıkama için EDTA yeterli miktarda var. (Önemli) Çözdürme sonra son geçit ve en az 1-2 pasajlar sonra 3 gün içinde kültür daha uzun hPSCs kullanmak tercih edilir.
   3. Mikroskop altında kuyu kontrol (hedefleri: 2.5x/0.06, 5 x / 0,12 Ph0, 10 x / 0,25 Ph1). Hücreleri ayırmak başlatıyorsanız, plaka tarafında hafif dokunarak hücreleri ücretsiz. Hücreleri 4 mL PBS ile 5 mL pipet içeren bir tüp aktarın.
      Not: (önemli) hafif kızarma ve toz kolonileri kadar kırmak ve gevşek hücreleri toplamak ama yoksaymak için plaka yapıştırılır kalan hücreleri için verilir.
   4. RT, 10 min yerçekimi ayrılması için oturmak için tüp izin. İsteğe bağlı olarak, hücreleri hafifçe santrifüj kapasitesi (fazla 5 min için de RT, 200 x g) Eğer gerekli.
   5. Aspiratı PBS kapatılan hPSCs kaldırmak için değil dikkat çekici tüp NMM hücrelerde 4 ng/mL ile resuspend FGF2 ve 10 µM RI ve 2:1 veya 3:1 oranında AA kaplı levha dağıtın. %5 CO₂37 ° C'de kuluçkaya ve orta 3 gün için gerekli olmadıkça yenileme yapmak (bkz. Adım 3.2.1).
      Not: (İsteğe bağlı) hücreleri aktarma kolaylık sağlamak, kültür orta bölümünü hedef plaka dağıtım önce kuyu ekleyin ve küçük bir hacim hücrelerde resuspend. Ayrıca, hPSCs lekeli ve tam başlangıç hücre yoğunluğu tanımlamak için sayılır. Ancak, hedef plaka son hacim 2.5 mL/iyi 6WP olmalıdır.
2. Serbest dalgalanma farklılaşma kültür 37 ° C'de (%5 CO₂) korumak
   1. Tabakları değişiklikler orta renk, ölü hücreleri, topaklanma ve bağlılık dipleri de birikimi için her gün kontrol edin.
      1. İsteğe bağlı: orta değiştirmek programı ne olursa olsun (ilk 3 gün de dahil olmak üzere hiçbir ferahlatıcı) yenileme bu kapattıysa orta sarı ve orta Değiştir/yenileme (Adım 3.3) yönergelerini izleyin. Hücreleri çoğunluğu ölü görünüyorsa, yerçekimi ayırma (Adım 3.4) ile orta Değiştir/yenileme için yönergeleri izleyin.
         Not: EBs oluşumu ve büyük hücreli agrega içine büyüme bekleniyor ama hücreleri ve hücre toplama işlemlerini birlikte bireysel büyüme/yayılması nedeniyle değil büyük kitleler halinde yığın. Bu gözlem yapılırsa, kitleleri kırmaya ışık toz câizdir. Hücreleri AA-plaka yüzeyine uymaları başlatırsanız, kuyu içeriğini kayan kalan doğrudan yeni kuyular için transfer, veya olabilir orta Değiştir/yenileme işlemi sırasında transfer. Plakasına yapıştırılır hücreleri aktarmak çalışmayın.
   2. 3 günde orta NMM için 4 ng/mL ile FGF2 değiştirin. Orta her geçen gün yenileyin.
   3. 7 günde orta NMM için 1 µM ile değiştirin retinoik asit (RA), 100 ng/mL FGF8B ve 4 ng/mL FGF2. Orta her geçen gün yenileyin.
      Not: (önemli) RA ışığa duyarlı. RA kültür örnekleri ışıktan korumak.
   4. 14 günde orta NMM için 100 ng/mL FGF8B, 100 ng/mL FGF4 ve 20 ng/mL FGF2 ile değiştirin. Orta her geçen gün yenileyin.
   5. 17 günde orta NMM için 100 ng/mL ile FGF8B değiştirin. Orta her geçen gün yenileyin.
   6. 21 günde orta NMM 100 ng/mL beyin türetilmiş Nörotrofik faktör (BDNF) ile ve 10 ng/mL gliyal türetilmiş Nörotrofik faktör (GDNF) olarak değiştirin. Orta her geçen gün yenileyin.
   7. 28 günde orta NMM için 100 ng/mL BDNF ve 10 ng/mL GDNF, 3 ng/mL SAG, 100 ng/mL Nörotrofik faktör 3 (NT3) ve 25 mM KCl. yenileme orta her geçen gün ile değiştirin.
   8. Gün 35, analiz için 3D organoids toplamak.
3. Değişim/farklılaşma orta 3D kültür için Yenile
   1. NMM gerekli hacmi (bileşen zamanlama adımları 3.2.2-3.2.7 bakınız) uygun bileşenleri ile steril bir tüp aktarın. Sıcak su banyosu 37 ° C'de
   2. Plaka ipucu ve hücreleri kuyu alt kenarlarını yerleşmek kadar hafifçe çalkalanır. Dikkatli bir şekilde hücreleri, kaldırılması kaçınarak bir serolojik pipet kullanarak eski orta 2 mL kaldırın sonra taze orta 2 mL ekleyin. %5 CO₂37 ° C'de kuluçkaya.
      Not: (önemli) sonunda birim 2.5 mL/iyi 6WP olması gerekir. Buharlaşma meydana gelirse, 2 mL eski ortamı olarak bu daha fazla hücre kültürleri kuru çıkarmayın; Bunun yerine, ekstra orta ekleyin.
4. Değişim/farklılaşma orta yerçekimi ayırma ile yenileme
   1. NMM gerekli hacmi uygun bileşenleri ile steril bir tüp aktarın. Sıcak su banyosu 37 ° C'de
   2. Kuyuları içeriğini aktarmak için steril bir tüp ve tüp RT, 10 min yerçekimi ayrılması için oturmak izin.
   3. Eski orta tüm tüpünden kaldırmak için bir pipet kullanın, alarak bakım değil kaldırmak için hücreleri, uygun bileşenlerle NMM içinde resuspend yerleşmiş ve daha sonra yeni AA-kaplı wells için dağıtabilirsiniz. %5 CO₂37 ° C'de kuluçkaya.
      Not: için kolaylık sağlamak, kültür orta kısmı hedefe eklenebilir (isteğe bağlı) ile düşük bir ses resuspended hücreleri ayırt dağılıma önceki kuyuları. Son birim 2.5 mL/iyi 6WP olmalıdır.

4. Protokolü 3: Alternatif 2D farklılaşma kültür

1. Başlatmak ve sürdürmek için 3D protokolü ile gün 12 bölüm 3 aynı derecede adımları kullanarak kültür
   1. Adımları 3.1-3.2.3 ve değişim/yenileme orta adım 3.3 ve 3.4 göre izleyin.
2. Geçiş ve 2D monolayer kültür olarak korumak
   1. Gün 13 farklılaşma, yerçekimi ayrılık (Adım 3.4) ile değiştir/yenileme ortam için yönergeleri izleyin, yalnızca hücre/toplamları PLO/LAM kaplı levha dağıtmak (bkz. Adım 1.6) bir son hacmi 2.5 mL/6WP, de.
      Not: Orta 10 µM RI ile bağlılık ve hayatta kalma hücre yardımcı olmak için ilk kaplama sırasında takıma. (Önemli) Bu eşit wells, düşük yoğunluklu veya Tabaklarda kalabalık önüne geçmek ve (bkz. Adım 4.4) gerektiği gibi geçiş için hücrelerde yaymak için arzu edilir. PLO/LAM kaplı plakaların (Yani, 6WP, 12WP, vb) tercih etmek büyüklük ampirik olarak, hücre proliferasyon oranı ve amaç için ürün göre belirlenmelidir. Talimatları birimleri için 6WP verecek ve her biri iyi numarası (Yani, 2 mL/iyi için 6WP, 1 mL/12WP, vbiçin iyi) iki katına için yarıya indirmek tarafından dönüştürülebilir
   2. 14 günde orta NMM için 100 ng/mL FGF8B, 100 ng/mL FGF4 ve 20 ng/mL FGF2 ile değiştirin. Orta 4.3. adımda açıklandığı gibi her gün yenileyin.
   3. 17 günde orta NMM için 100 ng/mL ile FGF8B değiştirin. Orta 4.3. adımda açıklandığı gibi her gün yenileyin.
   4. 21 günde 100 ng/mL BDNF ile NMM için orta ve 10 ng/mL GDNF değiştirin. Orta 4.3. adımda açıklandığı gibi her gün yenileyin.
   5. 28 günde 100 ng/mL BDNF ve 10 ng/mL GDNF, 3 ng/mL SAG, 100 ng/mL NT3 ve 25 mM KCl. yenileme orta 4.3. adımda açıklandığı gibi her gün NMM için orta değiştirin.
   6. Günde 35, analiz için hücreleri toplamak veya adım 4.2.5 genişletilmiş kültür (potansiyel sınırı test) için aynı ortamda korumak.
3. Değişim/farklılaşma orta 2D kültür için Yenile
   1. NMM gerekli hacmi uygun bileşenleri (bileşen zamanlama adımları 4.2.2-4.2.5 bakınız) ile steril bir tüp aktarın. Sıcak su banyosu 37 ° C'de
   2. Orta kuyulardan Aspire edin, sonra 2 mL yeni orta ekleyin. %5 CO₂37 ° C'de kuluçkaya.
      Not: (İsteğe bağlı) sonunda birim-ebilmek saklanmak 2.5 mL /, de 6WP, eski orta 2 mL kaldırmak için bir pipet kullanma ve 2 mL taze orta ekleme. Bir bölümü eski ayırma orta kuyu ve Önleme hücreleri hava kişiden gelen şok hücrelere değişiklik adımları sırasında azaltmak olabilir.
4. Geçit 2D farklılaşma kültür
   1. NMM gerekli hacmi (bileşen zamanlama adımları 4.2.2-4.2.5 bakınız) uygun bileşenleri ile işlem passaging için steril tüpler, transfer ve ayrı ayrı, PLO/LAM hazırlamak için plaka pasajlı hücreleri almak için kaplı. Hedef plaka 10 µM RI ile orta ek. Orta tüpler RT veya 37 ° C'de bir su banyosunda sıcak Bileşenleri kaydetmek için hücreleri passaging işlemi sırasında yıkama için NMM yalnız kullanmak mümkündür.
      Not: (Eğer ürünleri kalsiyum görüntülemede kullanılanönemli) deneyleri, geçit hücrelere farklılaşma sonundan önce 2-6 gün arasında olun.
   2. Orta kuyulardan için pasajlı Aspire edin. 300 µL/iyi ayrılma tripsin tabanlı aracısı eklemek (bakınız Tablo malzemeler), girdap plaka wells kapak, sonra hemen ayrılma aracısını kaldırın.
   3. Plaka 2 dk RT az oturmak izin verin ve sonra hücreleri plaka tarafında dokunarak gevşetin. 600 µL/iyi tanımlanmış tripsin inhibitörü (DTI) ekleyin ve 5 mL NMM ile steril bir tüp DTI hücrelerde aktarmak.
   4. Tüp, 290 x g RT. aspiratı orta, 15 dakika santrifüj kapasitesi ve başka bir 5 mL NMM tüp ekleyin.
   5. Tüp, 290 x g RT. aspiratı orta, 15 dakika santrifüj kapasitesi ve uygun orta RI içeren hücrelerde resuspend.
   6. Hücreleri bölme oranı 1:1-1 kullanarak PLO/LAM plaka üzerinde dağıtmak: 12, bağlı olarak ilk izdiham, yayılma hızı ve boyutu fark kökenli hedef plaka ve % 5 CO₂37 ° C'de korumak.

Sonuçlar

Genel bakış düşük büyüme faktörü 2D ve 3D serebellar farklılaşma protokolleri
Şekil 1 extrinsic faktörler ve kaplama süreyi belirleme 2D ve 3D serebellar farklılaşma protokolleri için genel zaman çizelgesini gösterir. 3D serebellar başkalaşım geçiren hPSCs için tipik ilerleme Şekil 2' de tasvir edilir: koloniler besleyici-Alerjik kültür gün 0 (sol üst rakam); hESC çizgi H01 ile geçiren EB oluşumu ile gün 2 (üst orta); gün 14 (sağ üst); RA ve FGF8 sinir indüksiyon takip belirgin Lümen ile daha büyük hücre toplamları büyüyen toplamları büyüklüklerde ve gün 28 (sol alt); şekil şekillendirme bir tek agrega farklı yapıları ile karmaşıklık gelişmekte belirtilen gün 28 (alt orta); ve aynı yapıları (sağ alt) gün 35 morfolojik değişiklikler devam etti. 2D serebellar başkalaşım geçiren hPSCs için tipik ilerleme şekil 3' te tasvir edilir: Besleyici-Alerjik kültür gün 0 (sol üst alan hESC kolonileri arasında farklılaştırılmış hücrelerin gösteren daire ile figür) kolonilerde olarak H01 ile hESC satır ; geçiren EB oluşumu ile gün 2 (üst orta); gün 13 (sağ üst); RA ve FGF8 sinir indüksiyon takip belirgin Lümen ile daha büyük hücre toplamları büyüyen (alt); yapışık hücreleri sola kaplama 14 gün sonra Proliferasyona ve hücre daha fazla karmaşık/olgun görünümdeki monolayer sonra günde 35 yüksek büyütme (sağ alt) ve düşük (alt orta) altında.

3D ürün sergi işaretleri ve erken Neuroepithelium yapılarının
Resim 2 (alt sol görüntü) ve şekil 4 3D toplam Morfoloji, değişen büyüme ve/veya olgunlaşma oranları yanı sıra Stokastik birleştirme veya agrega ayrı kırılma nedeniyle kültür boyunca görülen heterojen göster. Heterojenite rağmen her farklılaşma serebellar granül işaret ZIC1, şekil 5' te boyama immunocytochemistry (ICC) tarafından belirtildiği şekilde dahil olmak üzere erken sinirsel ve nöronal işaretleri sergilenmesi toplamları oluşturur. Daha da önemlisi, şekil 5 ve şekil 6 düşük büyüme faktörleri ile basit bir 3D kültür karmaşık yapıdaki erken neuroepithelium ve rhombic dudak gibi beyin gelişimi ile ilgili toplamları üretme yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir.

2D ürünleri sergi serebellar işaretleri ve fonksiyonel nöronal aktivite
2D kültürler karmaşık 3D yapılar yeniden olamaz, onlar serebellar granül hücre işaretçisi ZIC1, Şekil 7' deki ICC boyama tarafından belirtildiği şekilde dahil olmak üzere erken sinirsel ve nöronal işaretleri sergilenmesi hücre üretme yeteneğine sahip vardır. Erken granül hücre işaretçisi ATOH1 varlığı deneyler ve satırları arasında değişken olsa Gene ifade analizi yoluyla RT-PCR, ICC boyama sonuçları, şekil 8' de görüldüğü gibi destekler. Kalsiyum görüntüleme 2D kültüründe daha kolay işlenir. Şekil 9, ek Video 1ve tamamlayıcı Video 2görüldüğü gibi işlevsel nöron nesil düşündüren nöronal ateş şekillerinin tipik kalsiyum influxes elektriksel olarak uyarılmış olan hücreleri gösterir.

Şekil 1: zaman çizelgesi (farklılaşma 0 gün başlayarak) farklılaşma Protokolü'nün. Düz çizgi kutuları belirli faktörler kültür ortamına eklenir ve plaka-kaplama isteğe bağlı 2D değişiklik için noktalı çizgi kutuları gösterir gösterir. FGF2 için aşağı oku düşük konsantrasyonlarda (4 ng/mL) ve yukarı ok daha yüksek konsantrasyonlarda (20 ng/mL) gösterir. Bu rakam Holmes ve Heine¹⁰değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: temsilcisi aydınlık alan görüntüleri 3D Protokolü'nün. hESC colonies adlı d0, EBs, d2, indüksiyon d14, farklı boyut ve Morfoloji (numaralandırılmış 1-5) adlı d28, (harfler bir-ctarafından gösterilen) d28, benzersiz, tanımlayıcı özellikleri ile tek bir toplamak agrega takip toplar ve d35 aynı özellikleri görünür değişiklikleri. Ölçek çubuğu 100 µm =. Bu rakam Holmes ve Heine¹⁰değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: temsilcisi aydınlık alan görüntüleri 2D Protokolü'nün. hESC kolonileri d0 EBs, d2, indüksiyon, d13, 5 x büyütme ve 20 x büyütme, görüldüğü gibi olgunlaşma itibariyle d35 sonra toplamları, d14, kaplama sonra sonra toplar. Üst sol panelinde beyaz daire farklılaşmış hücreler arasında hESC kolonileri alanında gösterilir. Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: değişen boyut ve karmaşıklık 3D kültüründe gösterilen aydınlık alan görüntüleri. Toplamları(a)günde 8 (hESCs) ve (B) d35 (hiPSCs). İkinci görüntü tüm toplama göstermek için üç ayrı görüntülerini oluşur. Her iki toplamları küçük toplamları veya kaybı (yapılarının kopması) birleştirerek etkilenmiş olabilir. Ölçek çubuğu 200 µm =. Bu rakam Holmes ve Heine¹⁰yayınlanacaktır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: ICC resimleri 3D ürünlerin ilgili işaretleri ve yapıları göster. Kültür d35 3D ürünler Sergi: PAX6 (yeşil) ve TBR2 (kırmızı) tarafından Lümen sinirsel rozet benzeri oluşumu (ilk sıra); DCX (yeşil) ve dış kenarı ventrikül bölgesinden (VZ) yayılan NeuN (kırmızı)-gibi (ikinci sırada) yapısı; KIRREL2, serebellar neuroepithelium ile ilişkili bir işaretleyici (üçüncü satır, sol); ve bir işaretleyici serebellar granül ile ilişkili ZIC1 (3. sıra, sağ) hücreleri. Deneme dört farklı hPSC satır birden çok kez kullanılarak yapılmıştır: hESC satır H01 (n = 5) ve IPSC satırları hvs88 (n = 4), hvs60 (n = 3) ve hvs51 (n = 1). Oklar işaret Rhombic dudak (RL)-hangi tarihlerde yapısı. Ölçek çubuğu 100 µm =. Bu rakam Holmes ve Heine¹⁰yayınlanacaktır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6: büyük ölçekli ventrikül bölge gibi yapısında 3D ürün. Kültür d35 bir hESC elde edilen toplam PAX6 (yeşil) ve TBR2 (kırmızı) yaygın ventrikül bölgeleri (VZs) ve subventricular bölgeleri (SVZs), içinde vivoiçinde bulunan erken nöronlar ile ilişkili pozitiftir. (Üst) Bir yıldız işareti (*) işaretleri toplamak, kenarı boyunca derinlik/Anabilim Dalı VZ belirten köşeli ayraç ile çalışan VZ benzeri bölge apikal yan / SVZs. (orta) birleştirilmiş sinyalleri show PAX6 dağınık bölümlerini + / TBR2-hücre boyutu üst sağ sonuna doğru artan VZ. (Alt) Yüksek büyütme Resim bölümünün bir dikdörtgen orta panelinde gösterilir. Ölçek çubuğu 100 µm =. Bu rakam Holmes ve Heine¹⁰değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 7: ICC resimleri 2D ürünlerin ilgili işaretleri göster. Kültür d35 hESCs (üst satır) ve hiPSCs (alt satır), 2D ürünlerini sergilemek için pozitif hücreleri: granül hücre işaretçisi ZIC1 ve göçmen serebellar nöron marker (sol sütun); TAG1 ve nöronal işaret neurofilament (NF) ve TAG1 (sağ sütun). Ölçek çubuğu 50 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 8: RT-PCR 2D ürünleri. mRNA ifade analizi (üst satır) hESC hattı H01 ve hiPSC satır hvs60 (alt satır) 2D sonunda ürünler için Jel Elektroforez ile iletişim kuralı gösterir: granül hücre işaretçisi ZIC1, granül hücre işaretçisi ATOH1, göçmen serebellar nöron marker TAG1, Purkinje hücre işaretçisi Calbindin (CALB), voltaj bağımlı kalsiyum kanal CACNA1A (C-1A), CACNA1E (C-1E), gama - aminobütirikasit (GABA) B reseptör 1 (G-Br1) ve Oda temizliği gene EIF4G2).

Şekil 9: kalsiyum görüntüleme/analiz 2D ürünleri. Kültür d35 hPSC farklılaşma ürünler için mikroskop altında 2 dk fluor5 boya ile kuluçka sonra kaydedildi. 30 s, hücreleri elektrikle 10 için teşvik s, 10 Hz.(a)sabit görüntüler Haritayı hESCs at 0 s (solda) ve 30 elektriksel stimülasyon başladıktan sonra s (sağda). Oklar bölge kalsiyum akını çözümlenmesi için (ROI) ilgi gösterir. Yatırım Getirisi için zaman karşı göreli floresan (B) grafik çözümlemesini gösteren değişiklik (floresan içinde değiştirme = (F-F₀) / f₀, nereye F₀ (∑F_1-n) = / n), nöron gibi dikenli önce sırasında ve sonrasında meydana gelen uyarım. Siyah bar elektriksel stimülasyon uzunluğunu gösterir. Ölçek (beyaz) sırasıyla = 50 µm. tam kayıt (burada görüldüğü gibi) hESC ve (gösterilmez) hiPSC çizgisi ek Video 1 ve ek Video 2, kullanılabilir. AVI formatında, 4 x hızda kayıtları vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı Video 1: video hESC çizgi H01 2D ürünün Imaging kalsiyum. Kültür d35 farklılaşma ürünleri H01 kaydedildi mikroskop altında 2 min için kuluçka ile fluor5 sonra hESC satırından boya. 30 s, hücreleri elektrikle 10 için teşvik 10 Hz. kayıtları s 2 kare/s yapılmış ve AVI video ~ 7 kare/s, ~ 30 kalıcı bir video üreten içine işlenmiş s ~ 4 x hızda. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı Video 2: video hiPSC çizgi hvs51 üzerinden 2D ürünün Imaging kalsiyum. Kültür d35 kuluçka fluor5 boya ile sonra mikroskop altında 2 min için hiPSC satır hvs51 Urun farklılaşma kaydedildi. 30 s, hücreleri elektrikle 10 için teşvik 10 Hz. kayıtları s 2 kare/s yapılmış ve AVI video ~ 7 kare/s, ~ 30 kalıcı bir video üreten içine işlenmiş s ~ 4 x hızda. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Karmaşıklığı ve maliyeti seçerek veya farklılaşma protokoller geliştirme kök hücre araştırmacılar için ilgili faktörlerdir. Ne kadar dış denetim istediğiniz hücre tipleri, üretmek için gerekli olan bir açık soru olduğu gibi bu özellikle doğrudur ya da — farklı poz için — yetkili hPSCs kendi gelişim ortamı üreten kendilerini yeterli ile bırakılırsa ne kadar besin. Extrinsic etkenler vitro getirilmesi çok iyi istediğiniz hücre ürünleri üretmek, ama onlar da engelleyebilir içsel gelişim kapasiteleri ile hücre içinde vivosergiledik. Böyle konuları, özellikle eğer amaç hastalığı modelleme için hasta kaynaklı iPSCs kullanılması önemlidir. Yoğun kullanımı desenlendirme ve/veya büyüme faktörleri, hastalık fenotipleri maske. Bu raporda detaylı protokollerin karmaşıklığı, maliyet ve/veya dışsal desenlendirme faktörler^8,9kullanımını azaltmak için önceki çalışmalarda trendi takip.

Muguruma vd., ya da bizim kendi yeni çalışma tarafından bildirilen sonuçlara dayanarak, göründüğü gibi daha önceki çalışmalar yaptık farklılaşma serebellar kader in vivo koşullarda, çoğaltmak uyumlu çabaları olmadan doğru ulaşmak mümkündür ^{1 , 2 , 3 , 4 , 8 , 10}. en ilgi çekici kısmı iki çalışma farklı büyüme faktörleri, hem de FGF2 kullanılabilir olsa da ben de kümesi gerekli, düşündüren bir kümesi kullanılır. Biz nerede FGFs seçerek iletişim kuralından hariç ve hücreleri dışsal FGFs¹⁰olmadan aynı ürünler üretme yeteneğine sahip olduğunu gösterdi ek testler yaptım. Çalışmalarımız arasındaki farklar gerçeği biz, farklı hPSC hatları ve kültür yöntemleri kullanılan sinir farklılaşma RA ile indüklenen ve granül hücre hayatta kalma ve olgunlaşma (BDNF, GDNF, SARKMA ve KCL) desteklemek için bileşenleri dahil tarafından nitelikli^{11 -14}. Buna ek olarak, için Muguruma vd., kıyasla daha az karmaşık bir başlangıç yöntemini istihdam edildi. Onları fiziksel ve kimyasal olarak birbirinden izole 96WPs üniforma EBs oluşturarak onların Protokolü başladı. İletişim kuralı tüm PSC'ler nispeten birlikte 6WPs içinde onları serbestçe etkileşimine izin EB oluşumu sırasında kalabalık vardı. Nasıl Bu differentially EBs ve daha sonra organoids (bileşikleri sinyal içsel üretim de dahil olmak üzere) fiziksel ve kimyasal ortamının etkilemiş olabilir bilinmeyen ve keşfedilmeyi. Biz ifade gösterirken aynı zamanda, genler ile ilişkili — ve çok düşündüren — serebellar kökeni, morfolojik benzer yapıları içinde yer alan rapor tarafından Muguruma vd., biz cant hariç nesil nöronal benzeri yapıları serebellar kimliği vardır. Gelecekteki çalışmaları, antikorlar bu gibi büyük bir panelini kullanarak Muguruma vd tarafından bildirilen (Yani, ATOH1, CALB, vb) bu tür atamaları ve her iki iletişim kurallarını, daha kesin ürünleri arasında karşılaştırma yapar.

3D iletişim kuralına ile başlamak önemlidir ve hücre kültürü son ürün analiz için yeterli sayıda sağlamak için yeterli sayıda korumak. Önemli die-off erken protokolünde göz önüne alındığında, EBs/iyi sırasında kültür (şekil 1) ilk 3 günde fazla 500 ile başlayan öneririz. Bu hPSCs besleyici-Alerjik kültür için verilen koloni boyutları elde etmek zor olmamalı ama hala besleyici bağımlı yöntemleri kullanarak bu kadar kolay olmayabilir. Hücreleri çok sayıda göz önüne alındığında, bu renk değişikliği (pH değişiklikleri gösteren) orta ve ölü hücreleri birikimi izlemek önemlidir. Her ikisi de kültür çöküşü önlemek için düzeltilmiş olması gerekir. Ayrıca olabilir hücreleri ve toplamları topaklanma büyük yapılar. Her ne kadar hala çözümlenebilir toplamları neden olabilir, böylece onları daha küçük toplamları ile nazik toz içine ayrılıyor yararlı olabilir ürün miktarı büyük ölçüde, azalacaktır. Ancak, rahatsız edici normal agrega, kaçının hangi kendilerini büyüyebilir büyük boyutlarda (şekil 4). Toplamları çok seyrek olur, böylece toplamları tamamen izole değildir kuyu birleştirmek için önerilir. Ürün arasındaki değişkenlik (sayısı, boyutu ve Morfoloji) 3D hücre kültürü, düşündüren izole, tek EB oluşumu adımları ile daha az karmaşık bir başlatma yordamını (burada açıklanan Protokolü gibi başlayan bu protokoller için de dahil olmak üzere iyi bilinen bir sorundur ) daha pratik^8,15olabilir. Bu heterojenlik araştırmacılar, özellikle analizi sırasında unutmayın gereken bir şey ise bildirilen Protokolü ürünleri diğer 3D protokolleri^8,9,15' te bulunanlar ile tutarlı oluşturulan. Boyutu ve Morfoloji dayalı, sinirsel rozet aralığı içinde beyin organoid için küresel sınıflandırılması uygun en Kelava ve Lancaster¹⁵tarafından son incelemede açıklandığı gibi düşerler. Özellikle dikkate değer, 3D yapılar varlığını düşündüren lümen, (alt) ventrikül bölgeleri ve rhombic-rını özellikleri gibi sinirsel rozet (şekil 5 ve şekil 6) tarafından tanımlandığı gibi diğer grupları^{8 , 15 , 16 , 17}. her deney en az bir üretilen bu yana toplam sözde VZ/SVZs ve serebellar ilişkili işaretçileri (ZIC1, KIRREL2), RL benzeri ile bizim iletişim kuralını kullanarak 3D ayırt etme başarısını belirlemek yararlı ölçütleri Bunlar ek destek sağlayan özellikler. Kültür uzunluğu 35 gündür uzanan test değil ama büyüme, karmaşıklık ve olgunluk bu tekniği ile izin verilen azami ölçüde belirlemek için takip.

2D protokolü aynı yapışık olmayan EB oluşumu ve sinirsel indüksiyon işlemi 3D iletişim kuralı olarak kullanır ve bu nedenle belgili tanımlık yorum yukarıda da geçerli. Bir kez kaplama, dikkat edilmesi gereken noktalar farklı bir dizi düşünülmelidir. EBs hızlı bir şekilde dışa tabağa çoğalırlar hücreler için uygun olmalıdır. Bağlılık, RI, (zaten kullanılıyorsa) eklenmesi ile ilgili sorunlar orta hacmi azaltılmış veya PLO/LAM konsantrasyon deneysel yapılan değişiklikler geçerli varsa. Hücre büyümesini çok yoğun ya da seyrek (tercihen 20-%80 confluency arasında Yetişkin) tutmak önemlidir Wells; günlük izleme ve zamanında passaging bitti-confluency ya da yüzen hücreleri önlemek önemli. 3D Protokolü olmamalıdır önemli die-off kültür sırasında olabilir rağmen zavallı gelişim alanları veya bir nükleer silahların yayılmasına karşı oranları yavaşlama. Passaging hücreleri (örneğin, hücre oluşum ve Gelişmiş ağ hücreleri arasında kaldırma) olgunlaşma durumunu etkiler ve nerede hücreleri toplanan veya bir şekilde analiz Puan yaklaşırken göz önünde tutulmalıdır. Örneğin, kalsiyum için bu düşsel analiz önce 2-6 gün arasında geçiş hücrelere önemlidir. Yakın passaging analiz hücreleri bağlamak için zamanım olmadı ve/veya olgun ve çok uzak aşırı kalabalık, görüntüleme zorlaştırır hücrelerde neden olabilir anlamına gelebilir. Deneyler arasında değişkenlik var olabilir rağmen ilk 2D serebellar protokolleri^1,2' bildirdi tutarlı sonuçlarıdır. ICC boyama ve gen ifade analizi de diğer sinir ve serebellar kimlikleri ile (Şekil 7 ve şekil 8) ilişkili işaretçileri belirlenmesi sırasında hücreleri için granül hücre işaretçisi ZIC1, pozitif varlığını doğrulamaktadır. Fluor5 boya ile inkübe hücrelerinin elektriksel stimülasyon içerir, kalsiyum görüntüleme belirtilen işlev nöronal aktivite (Şekil 9, ek resim 1ve tamamlayıcı Şekil 2) değil doğruladı rağmen eğer bu Granül hücreleri vardı. Hücreleri daha fazla zaman veren Kültür uzunluğu 35 gündür genişleterek olgun tarafından fonksiyonel nöronal aktivite miktarı artırmalıdır tartışılabilir. Bu potansiyeli gelecekte keşfedilmeyi.

Yukarıda önerilen araştırma satır ek olarak, bu ürün kimliklerini (miktar ve kalite) farklılıkları belirlemek için ilgi 2D ve 3D iletişim kuralları arasında olacak. Dışsal FGFs önemini 2D protokolünde test değil ve eğer bilmek yararlı olacaktır kaplama sonra 3D yapısını eksikliği ve çok ilişkili sinyal yollar yapmak istiyorum 2D kültürler erken bileşikler biçimlenme üzerindekiler daha fazla veya daha az bağımlı. Daha fazla stripped-down iletişim kurallarını (örneğin, hayır RA, BDNF, SARKMA) aynı derecede daha fazla araştırma yapılması için makul satırları vardır. Son olarak, gelecekteki çalışmaları daha iyi karakterize (ve üretimi verimliliğini değerlendirmek için) yeni araştırma araçlardan yararı olabilir insan özgü serebellar nöronal alt türlerinden.

Akılda verilen uyarılar ile her ikisi de farklı amaçlar için uygun ürünlerle serebellar saptamaları için kullanılabilir iletişim kurallarını bildirdi. Onlar pilot çalışma, yürütmektedir araştırmacılar hücre hatları için böyle saptamaları veya hedeflenen sinirsel farklılaşma diğer türleri için temel bir model olarak canlılık test için pratik başlangıç noktası hizmet verebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12+Glutamax	Gibco	31331-028	glutamine fortified DMEM/F12
Neurobasal medium	Gibco	21103-049	neural basic medium
N2 supplement	Gibco	17502-048
B27 supplement	Gibco	17504001
Insulin	Imgen	PT468-B
L-glutamine	Gibco	25030-024
Non-essential Amino Acids (NEAA)	Gibco	11140-035
beta-mercaptoethanol	Gibco	21985-023
Poly-L-Ornithine	Sigma	P3655
Poly (2-hydroxyethyl methacrylate)	Sigma	P3932	aka Poly-Hema
Laminin	Sigma	L2020
E8 medium and supplement	Gibco	A1517001	hPSC medium and supplement
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122
Sodium Chloride	Sigma	S-5886
y-27632 (ROCK inhibitor)	SelleckChem	S1049-10mg
DMSO	Sigma	D-2650
Geltrex	Gibco	A1413302	hPSC-appropriate adherent coating (PAAC)
0,5M EDTA	Gibco	15575-020
0.2 um filter	VWR	28145-77
1.5 mL Eppendorf tube	VWR	525-0130
DMEM/F12	Gibco	21331-020
Ethanol	VWR	83804360
Parafilm	Sigma	PM996	wrap for culture plates
cryotubes	ThermoFisher	368632
TrypLE	Gibco	12563-029	trypsin-based dissociation agent
Defined Trypsin Inhibitor (DTI)	Gibco	R-007-100
FGF-2	Peprotech	100-18B
FGF-4	R&D Systems	100-31
FGF-8B	Peprotech	100-25
Retinoic Acid	Sigma	R2625
Brain Derived Neurotrophic Factor	Peprotech	450-02
Glial Derived Neurotrophic Factor	Peprotech	450-10
Potassium Chloride	Sigma	P5405
Neurotrophic Factor 3	Peprotech	450-03
Smoothened Agonist (SAG)	Cayman	11914	CAS 912545-86-9
Axiovert 40C microscope	Zeiss		Brightfield imaging microscope
Axiocam	Zeiss		Brightfield imaging - image aquisition
Eppendorf Centrifuge 5810	Eppendorf	521-0996	centrifuge for cell culture
PBS (gebufferde natrium oplossing)	Braun Medical	3623140
5 ml Serological pipets	VWR	612-4950
10 ml Serological pipets	VWR	612-4951
6-wells culture plates	VWR	734-2323
12-wells culture plates	VWR	734-2324
hESCs	WiCELL		line H01