JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, bir en iyi duruma getirilmiş yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama Protokolü ve genom çapında Kromatin devlet desenlerini donmuş tümör doku ve hücre hatları belirlenmesi için hesaplama analizleri potansiyel açıklar.

Özet

Histon modifikasyonları epigenome önemli bir bileşeni oluşturur ve ilişkili loci transkripsiyon durumunu belirlemede önemli düzenleyici rol oynarlar. Buna ek olarak, belirli değişiklikler varlığı pozisyon ve kimlik arttırıcılar gibi kodlama-işlevsel öğeleri belirlemek için kullanılmıştır. Son yıllarda, sonraki nesil sıralama (ChIP-seq) tarafından takip Kromatin immunoprecipitation bireysel Histon değişiklikler genom çapında profilleri belirlemede güçlü bir araç haline gelmiştir. Ancak, Kromatin değişiklikler, Kromatin Birleşik anılacaktır Kombinatorik şekillerinin kimlik ve ilişkili genomik locus doğasını belirlemek giderek netlik kazanmıştır. Bu nedenle, bir dizi Histon değişiklik işaretleri yanı sıra hesaplama analizleri boru hatları yetenekli profil oluşturma için sağlam yüksek üretilen iş (HT) metodolojisi oluşan iş akışları ChIP-Seq onbinlerce işleme veri profil oluşturma, için gerekli epigenomic Birleşik Devletleri çok sayıda örnekleri kapsamlı belirlenmesi. Burada sunulan HT-ChIP-Seq iş akışı iki modülden oluşmaktadır: 1) tümör örnekleri ve hücre hatları bir 96-iyi biçimde; küçük miktarlarda birkaç Histon bazı değişiklikleri profil oluşturma için deneysel bir protokol ve 2) bireysel işareti doluluk ve Kombinatorik Kromatin devlet desenleri hesaplamak için varolan araçları birleştiren bir sayısal veri analiz boru hattı. Birlikte, bu iki modül ChIP-Seq örnekleri yüzlerce kolay hızlı ve verimli bir şekilde işleme kolaylaştırmak. Burada sunulan iş akışı 6 Histon Ilhan profilleri Melanom tümörler ve hücre satırlarını Kromatin devlet desenleri türetmek için kullanılır. Genel olarak, biz onlarca insan tümör örnekleri ve kanser hücre hatları çeşitli maligniteler epigenomic anomalileri belirlemek için uygulanabilir kapsamlı bir çip seq iş akışı mevcut.

Giriş

Memeli genleri (98-%99) çoğunluğu kodlamayan dizisi oluşmaktadır ve bu nocoding bölgeler gen ekspresyonu ve Kromatin kuruluş1,2kontrolünde katılmak için bilinen yasal öğesinde yer. Normal bir hücrede, sıkıştırılmış Kromatin yapısı belirli derlemeye genomik DNA'ın mekansal organizasyon, düzenleme ve çeşitli DNA ilişkili işlemler3,4,5hassas zamanlama için önemlidir. Bir kanser hücresi ancak, Kromatin değişiklikler anormal epigenetik mekanizmalar tarafından uygun olmayan düzenleyici elemanlarının, kromozom döngü sistemleri ve gen ifade desenleri6erişim dahil olmak üzere Kromatin yapısı, organizasyonu yol açabilir, 7,8,9,10.

Son gelişmeler rağmen biz anlayış tümör ilerlemeyi veya terapötik yanıt ile ilişkili epigenetik değişiklikler sınırlıdır. Epigenome değişiklikler, Histon izleri ve DNA metilasyonu, topluca gen ifade ağları ve diğer işlemler korumak için kritik önem üzerine gelmesi (Kromatin devlet olarak adlandırılır) dinamik bir devlet oluşturmak da dahil olmak üzere bir dizi oluşur hücresel kimlik. Son zamanlarda, değişiklikler arttırıcılar içinde birden çok maligniteler H3K27Ac profilleri11inceleyerek gösterilmiştir. Bu tür çalışmalar izole epigenetik işaretleri korelasyon içgörü sağlamak rağmen 100'den fazla epigenetik değişiklikler belirlenen12,13 biyolojik rolleri net anlayış olmadan edilmiştir ve karşılıklı bağımlılık. Ayrıca, orada bu Histon ve DNA değişiklikler olası Kombinatorik desenleri daha büyük bir dizi ve epigenetik Birleşik14dikte bu Kombinatorik kalıpları - değil tek tek değişiklikleri - öyle. Bu nedenle, kanser ilerleme ya da terapi. yanıt sırasında değişiklikler bu Kromatin Birleşik Devletleri tanımlamak için muazzam gerek yoktur Kapsamlı bilgi epigenome değişikliklerini kanserleri ahşap kaplama kısmen teknik (örneğin klinik malzeme/tek hücreleri küçük bir miktar büyük ölçekli veri üretme) nedeniyle ve analitik (tanımlamak içinörneğin algoritmaları Kombinatorik Birleşik) Zorluklar. Bu nedenle, çok kritik ihtiyaç Histon değişiklik işaretleri klinik malzeme ve uygulamak kolay Hesaplamalı yaklaşımlar çok sayıda profil oluşturma için sağlam yüksek üretilen iş yöntemleri için kolaylaştıracaktır Kombinatorik desenleri tahmin etmek tumorigenesis ve tedavi direnci farklı aşamalarında ile ilişkili epigenetik Birleşik belirlenmesi. Ayrıca, veriler son epigenome profil oluşturma çalışmaları15,16,17,18,19,20,21, 22,23 normal dokuların ve hücre satırlarını Kromatin profilleri daha da epigenome katkı tümör biyolojisi anlayışlar için tümörlerin ile entegre olabilir.

Kromatin profil oluşturma çeşitli Kromatin değişiklikler15,24küresel bağlama kalıpları tanımlamak için güçlü bir araç haline gelmiştir. Son yıllarda, ChIP-seq "altın DNA-protein etkileşimler bir küresel ölçekte25,26,27üzerinde çalışmak için standart" haline gelmiştir. Herhangi bir çip seq deneme için doku işleme ve ayırma dahil, en uygun sonication koşulları, yağış, Kütüphane hazırlık için en uygun antikor yoğunlaşması belirleneceği belirleneceği, başarı için gerekli kritik adımlar vardır, veri işleme ve aşağı akım analiz sonrası sıralanıyor. Bu adımların her biri, anahtar kalite kontrol denetim noktaları içeren ve birlikte alındığında düzgün işlev doğrulama için olası hedefler belirlemek için önemlidir. Bu adımda yenilik metodolojileri ChIP veya çip Seq doku28,29,30,31,32 az miktarda gerçekleştirmek için çeşitli önceki çalışmalarda geliştirdik . Ayrıca, bazı çalışmalarda yüksek işlem hacmi ChIP deneyler PCR tarafından takip protokollerde Nefelometri33,34dayalı düşündürmektedir. Son olarak, bazı yayım kullanılabilir analiz platformlar ChIP-Seq veri için şimdi Easeq35 ve Galaxy36gibi kullanılabilir. Ancak, tek işareti ve Kromatin devlet analizleri gerçekleştirmek için sayısal bir boru hattı ile birlikte yüksek üretilen iş moda ChIP-Seq gerçekleştirmek için entegre bir platform eksik edilmiştir.

Bu iletişim kuralı tümör doku ve hücre hatları, Kromatin durumlarda genom geniş eşleme için bir tam ve çok yönlü ChIP-seq iş akışı ile kolay başarılı bir deneme için gerekli adımların tümünü kapsayan yönergeleri yerine getirmeniz açıklar. Daha önce Blecher-Gönen vd tarafından açıklanan bir yüksek-den geçerek yöntemi benimseyerek 37, bu protokolü örnekleri paralel onlarca üzerinde gerçekleştirilen ve kanser hücre satırları ve Melanom, kolon, prostat ve glioblastoma multiforme gibi insan tümörlerin başarıyla uygulandı. Biz insan melanoma hücre satırları ve tümör örnekleri epigenetik düzenleyici peyzaj anahtar bileşenlerini temsil eden altı çekirdekli Histon değişiklikler için metodoloji göstermek. Bu değişiklikler H3K27ac içerir (arttırıcılar), H3K4me1 (aktif ve hazır arttırıcılar), H3K4me3 (Organizatör), H3K79me2 (transkripsiyonu bölgeler), H3K27me3 (polycomb baskı) ve H3K9me3 (heterochromatic baskı). Bu işaretler baskıcı ve etkin etki alanları temsil eden işlevsel olarak farklı Kromatin Birleşik tanımlamak için tek başına veya birlikte kullanılabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm klinik örneklerin Kurumsal değerlendirme Komitesi yönergeleri izleyerek elde edilmiştir.

1. arabellek hazırlık

  1. TE arabellek (10 mM Tris-HCl, 10 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) pH 8.0) 200 mL olun.
  2. STE arabellek (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA pH 8.0, 140 mM NaCl) 200 mL olun.
  3. 2,0 M glisin (200 mL su glisin 37.52 g) 200 mL olun ve 65 ° c ısı
  4. 200 mL % 5 sodyum deoxycholate (DOC) çözeltisi (200 mL su içinde doktor 10 g) olun.
  5. ChIP hasat arabelleği (12 mM Tris-Cl, fosfat tamponlu tuz (PBS), 6 mM EDTA, % 0.5 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) x 0.1) 500 mL olun.
  6. ChIP seyreltme arabelleği 500 mL olun (10 mM Tris-Cl, 140 mM NaCl, % 0,1 Doktor, %1 Triton-X, 1 mM EDTA).
  7. RIPA yıkama arabelleği 500 mL olun (STE, % 1 Triton x-100, % 0,1 SDS, % 0,1 DOC).
  8. RIPA/500 yıkama arabelleği (RIPA tampon + 360 mM NaCl) 500 mL olun.
  9. LiCL yıkama arabelleği 500 mL olun (TE, 250 mM LiCl, % 0.5 NP-40, % 0.5 DOC).
  10. Doğrudan elüsyon arabelleği 500 mL olun: 10 mM Tris-Cl pH 8.0, 5 mM EDTA, 300 mM NaCl, % 0.5 SDS.
  11. Antikor bağlama/engelleme arabelleği (PBS + %0,1 ara-20 + %0.2 IgG-Alerjik BSA) 50 mL olun.

2. doku/hücre satır işleme ve Cross-linking

  1. Doku dondurulmuş flaş ise, ayrılma önce buzda dethaw.
  2. Doku (Histon değişiklik antikor ~ 8 mg) 50 mg 2 mL, Hanks dengeli tuz çözüm (steril bir jilet kullanarak HBSS) el ile ilişkisini. Yaklaşık 5 dakika içinde bir steril doku kültürü yemek için 3-4 mm parçalara doku kıyma.
  3. Doku ve HBSS çözüm dissociator tüp içine aktarmak ve HBSS başka bir 8 mL ekleyin. Daha fazla homojenize oluncaya kadar bir dissociator kullanarak doku ilişkilendirmelerini kaldırın.
  4. Melanom tümör, tüpler bir dissociator yerleştirin ve aşağıdaki her bir kez bu sırada döngüleri çalıştırın: h_tumor_01.01, h_tumor_02.01, h_tumor_03.01 ve m_heart_02.01.
  5. Scrape 21 × 106 hücre orta 10 ml (~ 3 × 106 giriş; başı Histon değişiklik işareti nadir nüfus başına 100.000 hücrelere indirdi) standart bir doku kültüründe yetiştirilen çanağı ve onları bir 15 mL konik tüp içinde toplamak.
    Not: temsilcisi melanoma hücre satırı WM115 için kullanılan medya DMEM % 10 Fetal sığır Serum ve %5 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş olması.
  6. Crosslink % 1 son formaldehit konsantrasyonu % 16 formaldehit 3 mL HBBS doku (veya hücreler için orta 3 mL) başına 200 µL ekleyerek kullanarak doku/hücre. Karışımı 10 devirde tam olarak 37 ° C'de 10 dakika için bir mikser kullanarak sallamak
    Dikkat: Formaldehit toksik ve bir uygun duman mahallede ele alınmalıdır.
  7. 2,0 M glisin örnek 3 mL başına 200 µL ekleyin ve başka bir 5 dakika 37 ° C'de 10 RPM sallayarak devam edin
    Bilginize: Glycine bir içki işlem görür. Taze glisin çözüm çözüm zamanla eğilimi pH pf olarak her ay olun.
  8. Örnekleri vasıl 934 x g benchtop santrifüj kullanarak 4 ° C'de 5 min için spin. Süpernatant kaldırın, buz soğuk PBS 5 mL ekleyin, tekrar vasıl 934 x g örnekler santrifüj kapasitesi ve süpernatant kaldırın.
  9. Flaş Pelet dondurma ve diğer işlemler-80 ° C'de saklayın.

3. doku lizis, Sonication ve antikor hazırlama

  1. 1 proteaz inhibitörü tablet çip hasat arabellek 10 mL başına geçiyoruz.
  2. ChIP hasat arabelleği doku 50 mg başına proteaz inhibitörleri ile 300 µL ekleyin ve buz üzerinde lizis 30 dk.
    Not: ChIP hasat arabelleği proteaz inhibitörleri başına 1 X 107 WM115 Melanom hücre hatları ile 300 µL ekleyin.
  3. Hücreleri lysing iken, açmak waterbath topu ve ilişkili soğutma sistemi ve sıcaklık 4 ° C. ulaşmak izin Sonicator tüpler waterbath topu yerleştirin ve Melanom doku 30 60 döngüleri için solüsyon içeren temizleyicide s açık ve 30 s ~ 200-600 baz çifti (bp), Kromatin parçaları almak için kapalı.
    Not: Sonication zaman doku türü arasında farklı olabilir ve buna göre ayarlanmalıdır. Bu kritik bir adımdır ve pilot deneme immunoprecipitation geçmeden önce optimize edilmelidir.
  4. Sonication sırasında protein G manyetik boncuklar antikor üç kez 1000 µL bağlama/engelleme arabelleği (PBS + %0.1 ara-20 + % 0,2 BSA) kullanarak örnek başına başına 20 µL yıkayın.
  5. Melanom doku ~ 8 mg için bağlama / 4 ° c 2 h için tampon tüp tabanca kullanarak döndürme ile engelleme 100 µL her Histon antikor 3 µg kuluçkaya. tekil bir antikor için 12 örnekleri boncuk 240 µL, antikor 36 µg ve 1200 µL bağlama/engelleme arabelleği içeren.
    Not: 3 × 106 hücreler için her antikor 5 µg ve Protein G manyetik boncuklar antikor başına 30 µL kullanın. Doku farklı miktarda kullanılmakta ise antikor ve Protein-G boncuk titre. Bu iletişim kuralı immunoprecipitation koşulları için açıklanan altı Histon değişiklikler (Tablo reçetesi) gösterir, ancak, antikor konsantrasyonları diğer değişiklikler ve transkripsiyon faktörleri için optimize edilmelidir.
  6. Parça boyutu belirlemek, sonciated Kromatin çözüm 20 µL kaldırmak ve bir elüsyon arabellek eklemek için ana mix (oda sıcaklığında) doğrudan elüsyon 44 µL içeren tampon, 1 µL RNase (20mg/mL) ve örnek başına 5 µL İndinavir K (20mg/mL). PCR termal cycler için en az 2 h 50 ° C'de örneklerinde kuluçkaya PCR arıtma seti üreticileri talimatları uygulayarak örnek arındırmak.
  7. Kromatin yeterince yüksek hassasiyet DNA electropherogram enstrüman adım 3.6 geçmeden önce kullanarak parça boyutu belirlenerek nın yaşadığı emin olun. Electropherogram araç üzerinde açın.
  8. Yüksek hassasiyet arabellek reaktif 2 µL bir 8-şey optik tüp şerit her kuyunun içine yükleyin. Yüksek hassasiyet merdivenin 2 µL kalan Wells arıtılmış örnekleri ilk iyi ve 2 µL yüklemek.
  9. Optik tüp kapaklar tüp stips ve girdap örnekleri 1 dk. aç kapağı 2000 devirde yer ve yeni yüksek duyarlı ekran teyp ve kutusu yükleme ipuçları ekleyin. Şerit caps kaldırmak ve örnekleri electropherogram araç yükleyin.
  10. Analiz yazılımı açın, ekran teyp üzerindeki ilk on üç alanlarda vurgulamak ve sağ alt köşedeki başlangıç SEKME tuşuna basın. Kromatin parçaları ~ 200-1000 bp arasında değişen küçük parça için uygundur.
  11. Sonicated çözüm için steril tüpler aktarmak ve tüpler 4 ° C'de 15 dakika bir masa üstü santrifüj kullanarak 21,130 x g de spin Süpernatant yeni tüpler aktarın.
  12. Süpernatant toplam hacmi belirlemek ve giriş kontrolü için toplam çözüm yüzde 10'u çıkarın ve 4 ° C'de saklayın

4. Kromatin Immunoprecipitation

  1. 2 proteaz inhibitörü tablet çip seyreltme arabelleği 20 mL başına geçiyoruz.
  2. Sonra sonication seyreltik % 0,1 SDS seviyelerine getirmek için ChIP seyreltme arabellek kullanarak kalan örnek 5 kez. 1080 µL 1350 µL bir son toplam hacmi elde etmek için ChIP seyreltme arabelleği ile kalan süpernatant ile 270 µL sulandırmak.
  3. Antikor ve protein G manyetik boncuklar kuluçka sona erdiğinde, tüp üzerinde bir mıknatıs yerleştirmek ve süpernatant kaldırın.
  4. Hala mıknatıs üzerinde oturan tüp ile çip seyreltme arabelleği proteaz inhibitörleri ile 750 µL ekleyerek boncuklar bir kez yıkayın.
    Not: Boncuk rahatsız ya da tüpler bu adımı sırasında döndürmek önemlidir.
  5. Seyreltme arabellek yıkama ve boncuk aynı çip seyreltme arabellek 240 µL içinde resuspend yonga çıkarmak. Boncuk 12 ayrı tüpler, içine aliquot 20 µL her biri için ayrı doku örneği kullanılır.
  6. Aliquot protein G boncuk spesifik antikor ve bir tüp tabanca gecede 4 ° C'de kullanarak aracılığı ile eşit olarak sonicated malzeme

5. yıkama ve ters polietilenin Immunoprecipitated DNA-protein kompleksleri

  1. Ertesi sabah ters crosslinking sonra antikor protein çözüm bir 96-şey plakasına aktarmak ve manyetik kürsüye yerleştirin. En az 30 s ve kaldırma için uygun boncuk izin süpernatant.
  2. Boncuk 5 kere ile 150 µL buz gibi RIPA yıkama arabelleği çok kanallı damlalıklı kullanarak yıkayın. Yıkama adımları sırasında değil damlalıklı boncuk yapmak ama mıknatıs sürekli sağdan sola 30 için hareket s yıkama başına.
  3. Örnekleri iki kez 150 µL buz gibi RIPA-500 yıkama arabelleği ile yıkayın.
  4. Örnekleri iki kez 150 µL buz gibi LiCl yıkama arabelleği ile yıkayın.
  5. Örnekler bir kez 150 µL buz gibi TE yıkama arabelleği ile yıkama ve TE arabellek hemen kaldırın. Bu adımı düşük giriş uygulamaları için atlanabilir.
  6. Adım 3.7 çip DNA örnekleri içeren 96-şey plaka taze kuyu içine giriş denetimi ekleyin.
  7. Çamaşır adımları sonra doğrudan elüsyon arabellek, 1 µL RNase (20 mg/mL) ve ters çapraz için ChIP ve giriş örnek başına 5 µL İndinavir K (20 mg/mL) 44 µL içeren bir elüsyon arabellek ana karıştırmak (oda sıcaklığında) ekleyin.
  8. 37 ° C, 4 50 ° C ve 8-16 h 65 ° C'de h 4 h için PCR termal cycler kullanarak örnekleri kuluçkaya

6. arıtma ve miktar zarlarını DNA'ın

  1. Ertesi sabah, yer örnekleri mıknatıs ve transfer süpernatant immunoprecipitated DNA içeren bir yeni 96-şey PCR plakasına geri.
  2. Paramagnetic boncuk x 2.3 çözüm (50 µL çözüm için 115 µL) ve dikkatlice yukarı ve aşağı 25 kez bir çok kanallı damlalıklı kullanarak damlalıklı ekleyin. Çözüm düzgün karışık, homojen hale gelecektir.
  3. Çözüm, oda sıcaklığında 4 dk. örnekleri üzerinde mıknatıs geri ve başka bir 4 dk. atma süpernatant oda sıcaklığında kuluçkaya yer için mıknatıs kapalı kuluçkaya.
  4. Örnekleri üzerinde mıknatıs bırakarak, 150 µL % 70 etanol (vol/vol) ekleyin ve 30 oda sıcaklığında kuluçkaya boncuk bozmadan s.
  5. Etanol kaldırmak ve yıkama tekrarlayın. Hava paramagnetic Boncuk 5 min için mıknatıs üzerinde kuru izin verir.
    Not: kalan etanol arıtma ile müdahale edecek gibi tüm etanol sonra ikinci yıkama kaldırmak.
  6. Örnekler mıknatıs kaldırın ve 10 mM Tris-Cl pH 8.0 30 µL ekleyin. 25 kere pipetting tarafından mix ve örnekleri, oda sıcaklığında 4 dk için mıknatıs kapalı kuluçkaya.
  7. Örnekleri geri üzerinde mıknatıs yerleştirmek ve başka bir 4 dk. Transfer 20 µL Kütüphane hazırlanması için yeni bir 96-şey plaka her örneğinin için oda sıcaklığında kuluçkaya. Kalan 10 µL çip DNA'ın olası herhangi bir sorun durumunda kütüphanelerin üretimi ile saklamak.
  8. Bu aşamada, çip DNA önce kitaplığı hazırlık ölçmek. DNA konsantrasyonu yüksek-duyarlı DNA reaktifleri ile ölçülür. Çöktürülmüş DNA adıma 7.1 bir yüksek hassasiyet DNA electropherogram enstrüman geçmeden kullanarak boyut dağılımı belirlemek.

7. Ultra II DNA Kütüphane NEBNext hazırlık seti kullanarak kütüphane üretimi

  1. DNA Kütüphane üretici tarafından önerilen protokol sonrası hazırlık kullanarak NGS sıralama için kitaplıkları oluşturmak. Bütün tepkiler 96-şey levha gerçekleştirilir ve incubations kapak sıcaklık set > 100 ° C ve birim 50 µL PCR termal cycler içinde gerçekleştirilir.
  2. Dizin, Multiplex Oligos NGS platformu için kullanılır. Aşağıdaki ayarları kullanarak PCR güçlendirme için 10 x döngüleri toplam gerçekleştirmek: 30 98 ° C'de ilk denatürasyon s, denatürasyon 10 98 ° C'de s, tavlama/uzatma için 30 65 ° C'de s (10 x devir), son uzantısı 65 ° C 5 min ve 4° C'de tutmak için
    Not: Tablo 1 PCR güçlendirme için kullanılan astar içerir.
  3. PCR güçlendirme sonra örnekleri kaldırmak ve Toplam hacim nükleaz ücretsiz su kullanarak 100 µL getir. Çift taraflı paramagnetic boyutu seçimi (0.55x/0.8x) ilk ekleyerek 55 µL boncuk tarafından gerçekleştirmek ve 25 kere pipetting karıştırın. Örnekleri, oda sıcaklığında 4 dk için mıknatıs kapalı kuluçkaya.
  4. Örnekleri üzerinde geri bir mıknatıs yerleştirmek ve başka bir 4 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. Bu adımı sıralama için uygun olmayan boncuk büyük parçaları korumak için kullanılır.
  5. Süpernatant yeni bir 96-şey PCR tabağa aktarın. Bu kısmen arıtılmış DNA içerdiğinden süpernatant atmayın.
  6. Başka bir 25 µL paramagnetic boncuk ekleyin ve 25 kere pipetting tarafından mix ve 4 dk için mıknatıs kapalı oda sıcaklığında kuluçkaya.
  7. Örnekleri geri üzerinde mıknatıs yerleştirmek ve başka bir 4 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya ve süpernatant atın. Bu adım ~ 200-600 parçaları korumak için kullanılır için kullanılacak olan bp kesinleşmiş kitaplıkları.
  8. Örnekleri üzerinde mıknatıs bırakarak, 150 µL % 70 etanol (v/v) ekleyin ve 30 için kuluçka sağlar (değil devam ederken mıknatıs) boncuk bozmadan s. Etanol kaldırmak ve yıkama ikinci kez tekrarlayın.
  9. Kalan etanol arıtma ile müdahale edecek gibi paramagnetic Boncuk 5 dakika süreyle mıknatıs üzerinde kuru hava için tüm etanol sonra ikinci yıkama kaldırmak izin verir.
  10. Örnekler mıknatıs kaldırın ve 10 mM Tris-Cl pH 8.0 25 µL ekleyin. 25 kere pipetting tarafından mix ve 4 dk. örnekleri üzerinde mıknatıs geri ve başka bir 4 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yer için mıknatıs kapalı oda sıcaklığında kuluçkaya.
  11. Yüksek hassasiyet DNA electropherogram enstrüman çoğullama önce kullanarak boyutları sıralama için uygun olduğundan emin olmak için kitaplıklarına ölçmek. Tamamlanan kütüphaneler ve 200-600 bp arasında aralığı tüm astar dimer yoksun bulunmaktadır.
    Not: gerekirse, ~ 130 bulunması istenmeyen astar dimer kaldırmak için başka bir 0,7 x paramagnetic boncuk arıtma gerçekleştirilir bp.
  12. Havuzu benzersiz dizin astar konsantrasyon göre temel quantified DNA. 6ng/µL arasındaki 1 ng/µL konsantrasyonları ile altı örnekleri içeren bir havuzu için en düşük fiyat örneği 15 µL ve en yüksek örnek 2.5 µL dağılımıdır. Bu sayıları eşit akış hücre her Lane'de dağıtılacaktır okunur sağlamak için yapılır.

8. ChIP-seq veri işlem sonrası

  1. Snakemake38,39 nolu dayalı bir boru hattı için kullanılan tüm aşağıdaki işlemi tek bir komutta yönlendirir. Önemlisi, bu adımların her biri ele alınmıştır tek tek ile ilişkili komutları.
  2. FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) kullanarak ham fastq sıralama okuma kalitesini belirlemek: unix terminal açın ve her altı Histon değişiklikler için ham fastq dosyaları içeren klasörün değişmek müdür (cd). Unix terminal türünü, fastqc *fastq.gz ve basın [dönüş]. Bu klasördeki tüm fastq dosyaları kalite kontrol ölçümleri çalışır.
  3. Kalite okuma için başvuru genom hizalayın ve bam dosyaları sıkıştırmadan önce Yinelenenleri kaldırmak. Bu papyon sürüm 1.1.239, SAMBLASTER sürüm 0.1.2140ve SAMTOOLS sürüm 1.3.141kullanılarak gerçekleştirilir: unix terminal türü, papyon -m 1 - n 1--en iyi--tabakaları -S - q /path_to/hg19 histone1.fastq.gz | samblaster - removeDups | samtools göster -Sb - > histone1.bam ve basın [dönüş].
    Not: path_to hg19 insan genomu derleme içeren klasörü gösterir. Bu faiz organizma bağlı olarak değişecektir.
  4. Sıralama SAMTOOLS birlikte aşağıdaki komutu kullanarak bam dosyaları: unix terminal türü'nde, samtools histone1.bam -m 2 G sıralama-@ 5 -T histone1.temp -o histone1.sorted ve basın [dönüş].
  5. Dizin SAMTOOLS birlikte aşağıdaki komutu kullanarak bam dosyaları: unix terminal türünü samtools histone1.sorted.bam histone1.sorted.bam.bai dizin ve [dönüş] tuşuna basın.
  6. SAMTOOLS flagstat ile aşağıdaki komutu kullanarak benzersiz olarak eşlenen ve hizalanmamış okuma belirlemek: unix terminal türünü, samtools flagstat histone1.sorted.bam ve basın [dönüş].
  7. Aşağıdaki komut ile rastgele örnekleme gerçekleştirerek bam dosyaları okuma sayıları her normalize: unix terminal türünü sambamba göster -f bam-alt örnekleme-tohum 3 -s 0.X histone1.sorted.bam = | samtools sıralama -m 2G-5 -T histone1.downsample.temp -o histone1.downsample.sorted.bam ve basın [dönüş] @.
  8. SAMTOOLS birlikte aşağıdaki komutu kullanarak yeniden bam dosyaları için dizini: unix terminal türünü samtools histone.downsample.sorted.bam histone.downsample.sorted.bam.bai dizin ve [dönüş] tuşuna basın.
  9. Genom tarayıcı (i.e. ChIP-seq arşivini görselleştirmek için UCSC veya IGV), deepTools sürüm 2.4.040 bam dosyaları okur kilobaz başına ölçekleyerek kullanarak önemli dosyaları oluşturmak milyon (RPKM). Bu aşağıdaki komutları kullanarak yapılabilir:
    1. Standart önemli dosyalar için: unix terminal türünü, bamCoverage -b histone1. downsample.sorted.bam--normalizeUsingRPKM--binSize 30 - smoothLength 300--extendReads 200 -o histone1.bw ve basın {RETURN].
    2. Giriş için düşülen önemli dosyaları: unix terminal türünü, bamCompare--bamfile1 histone1.downsample.sorted.bam - bamfile2 input1.downsample.sorted.bam--normalizeUsingRPKM--oranı çıkarma--binSize 30 - smoothLength 300--extendReads 200 -o histone1.subtracted.BW ve basın [dönüş].
  10. ChIP-seq sinyal zenginleştirme ChIP-seq (Mac) sürüm 1.4.225,26 ve sürüm 2.1.0 modeli temel analizi kullanarak "Giriş" arka plan üzerinde tanımlayın. "Geniş kaynak" faktörler H3K79me2, H3K27me3 ve H3K9me3 için "nokta kaynağı" etkenler H3K4me3, H3K4me1 ve H3K27ac ve macs2 için macs1 kullanın. Bu aşağıdaki komutları kullanarak gerçekleştirilir:
    1. İçin nokta kaynak: Unix terminal türünü, macs14 -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-5--nomodel--tutmak-dup - n histone1.file ve basın [dönüş].
    2. Geniş kaynak için: unix terminal türünü, macs2 callpeak -t histone1.downsample.sorted.bam - c input1.downsample.sorted.bam -g hs -f BAM -p 1e-6--geniş--geniş kesim 1e-6--tutmak-dup tüm--nomodel - n histone1.file ve basın [dönüş].
  11. Kullanım ChromHMM24 Kombinatorik Kromatin devlet biçimlerini belirlemek için aşağıdaki komutları kullanarak okudu Histon değişikliklere dayalı:
    1. UNIX terminalinin yazın, cd/path_to/ChromHMM_folder ve [dönüş] tuşuna basın.
    2. Bir kez ChromHMM dizin türü içinde java-mx2G-ChromHMM.jar BinarizeBam -b 1000 hg19.txt/path_to/bam_directory /path_to/CellMarkFile.txt/path_to/BinarizeBam_output kavanoz ve [dönüş] tuşuna basın.
    3. Türü, java-mx2G-ChromHMM.jar LearnModel -b 1000/path_to/BinarizeBam/path_to/output_directory 15 hg19 kavanoz ve [dönüş] tuşuna basın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu iletişim kuralı donmuş tümör doku ve bir yüksek-den geçerek yöntemi (resim 1A)kullanarak paralel örnekleri onlarca üzerinde gerçekleştirilen hücre satırlarından immunoprecipitation sağlar. Kromatin parçaları ~ 200-1000 bps için en uygun immunoprecipitation arasındaki mesafe. Biz aynı kesme uzunluğu ulaşmak için gereken süreyi farklı doku ve hücre tipleri için farklı gözlemlemekteyiz. Küçük parça--dan az mi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu iletişim kuralı genom geniş eşleme Kromatin durumlarda insan tümör doku ve hücre hatları için tam ve çok yönlü yüksek işlem hacmi ChIP-seq modülü açıklar. Herhangi bir çip seq protokolünde antikor özgüllük en önemli adımlardan biridir. Burada, immunoprecipitation koşullar tüm bunların ChIP-Grade ve daha önce bizim diğer laboratuvarlar42,44,ve45 doğrulanmış açıklanan altı Histon değişiklik...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çakışma olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

Marcus Coyle, Curtis Gumbs, MDACC SMF özünde sıralama destek için teşekkür ediyoruz. Bu makalede açıklanan çalışma NIH grant (CA016672) dan gelen hibe için SMF çekirdek tarafından desteklenen ve ncı K. R. (1K99CA160578 ve R00CA160578) Ödülleri

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
ChIP-grade H3K4me1 antibodyAbcamab8895
ChIP-grade H3K27ac antibodyAbcamab4729
ChIP-grade H3K4me3 antibodyAbcamab8580
ChIP-grade H3K79me2 antibodyAbcamab3594
ChIP-grade H3K27me3 antibodyAbcamab6002
ChIP-grade H3K9me3 antibodyAbcamab8898
1M Tris HCl, pH 8.0TeknovaT1080
EDTASigma-AldrichE9884
NaClSigma-AldrichS7653
GlycineSigma-AldrichG8898
Sodium deoxycholateSigma-Aldrich30970
DPBSSigma - Life SciencesD8537-500ML
SDSSigma-Aldrich74255
Triton-XSigma-AldrichX100-100ML
LiClSigma-Aldrich746460
NP-40Calbiochem492016-100ML
1% TWEEN-20Fisher BioreagentsBP337-500
BSA - IgG-freeSigma - Life SciencesA2058-5G
HBSSGibo14025092
GentleMACS C tubeGentleMACS120-008-466disassociation tube
16% FormaldehydePeierce28906
miniProtease inhibitor Roche Diagnostics11836153001protease inhibitor tablets
Dynabeads Protein G Invitrogen10009D
Bioruptor NGS tubes 0.65 mLDiagenodeC30010011sonication tubes
DynaMag - 96 Side SkirtedInvitrogen120.2796-well magnetic stand
TE bufferPromegaV6231
RNase AInvitrogen12091021
Proteinase KInvitrogen100005393
AMPure XP beadsBeckman CoulterA63882paramagnetic beads
EthanolSigma-AldrichE7023
Qubit ds DNA High Sensitivity Assay KitInvitrogenQ32854high sensitivity DNA reagents
NEBNext Ultra II DNA Library Prep KitNew England BioLabsE7645LDNA Library Prep Kit
Nuclease-free waterAmbionAM9932
High sensitivity D1000 ScreenTapeAgilent Technologies5067-5584high sensitivity DNA reagents
High sensitivity D1000 reagentsAgilent Technologies5067-5585high sensitivity DNA reagents
Multiplex Oligos (Index primers- Set 1)New England BioLabsE7335LMultiplex Oligos 
Multiplex Oligos (Index primers- Set 2)New England BioLabsE7500LMultiplex Oligos 
TapeStation 4200Agilent TechnologiesG2991AAhigh sensitivity DNA electropherogram instrument
Bioruptor Pico sonication device DiagenodeB01060001water bath disruputor
MixerNutator421105
Bio-Rad C1000 Touch Thermal CyclerBio-Rad1851196PCR Thermal cycler
Water BathFisher Scientific2322
Multichannel PipetDenville1003123
Tube RevolverThermo-Scientific88881001
96-Well Skirted PlateEppendorf47744-110
Allegra X-12R Centrifuge Beckman CoulterA99464benchtop centrifuge
Centrifuge 5424Eppendorf22620461tabletop centrifuge
Optical tube strips (8x Strip)Agilent Technologies401428
Optical tube strip caps (8x strip)Agilent Technologies401425
Loading Tips, 10 PkAgilent Technologies5067-5599
IKA MS3 vortexIKA3617000vortex

Referanslar

  1. Rao, S. S., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  2. Hnisz, D., Day, D. S., Young, R. A. Insulated Neighborhoods: Structural and Functional Units of Mammalian Gene Control. Cell. 167 (5), 1188-1200 (2016).
  3. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
  4. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).
  5. Wang, X., et al. SMARCB1-mediated SWI/SNF complex function is essential for enhancer regulation. Nat Genet. 49 (2), 289-295 (2017).
  6. Hnisz, D., et al. Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods. Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).
  7. Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nat Commun. 6, 6178(2015).
  8. Krijger, P. H., de Laat, W. Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (12), 771-782 (2016).
  9. Mansour, M. R., et al. Oncogene regulation. An oncogenic super-enhancer formed through somatic mutation of a noncoding intergenic element. Science. 346 (6215), 1373-1377 (2014).
  10. Weischenfeldt, J., et al. Pan-cancer analysis of somatic copy-number alterations implicates IRS4 and IGF2 in enhancer hijacking. Nat Genet. 49 (1), 65-74 (2017).
  11. Herz, H. M., Hu, D., Shilatifard, A. Enhancer malfunction in cancer. Mol Cell. 53 (6), 859-866 (2014).
  12. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  13. Tan, M., et al. Identification of 67 histone marks and histone lysine crotonylation as a new type of histone modification. Cell. 146 (6), 1016-1028 (2011).
  14. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  15. Ernst, J., et al. Mapping and analysis of chromatin state dynamics in nine human cell types. Nature. 473 (7345), 43-49 (2011).
  16. Consortium, E. P., et al. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  17. Rivera, C. M., Ren, B. Mapping human epigenomes. Cell. 155 (1), 39-55 (2013).
  18. Stergachis, A. B., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154 (4), 888-903 (2013).
  19. Xie, W., et al. Epigenomic analysis of multilineage differentiation of human embryonic stem cells. Cell. 153 (5), 1134-1148 (2013).
  20. Chen, L., et al. Transcriptional diversity during lineage commitment of human blood progenitors. Science. 345 (6204), 1251033(2014).
  21. Saeed, S., et al. Epigenetic programming of monocyte-to-macrophage differentiation and trained innate immunity. Science. 345 (6204), 1251086(2014).
  22. Bernstein, B. E., et al. The NIH Roadmap Epigenomics Mapping Consortium. Nat Biotechnol. 28 (10), 1045-1048 (2010).
  23. Roadmap Epigenomics, C., et al. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes. Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).
  24. Ernst, J., Kellis, M. ChromHMM: automating chromatin-state discovery and characterization. Nat Methods. 9 (3), 215-216 (2012).
  25. Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. Nat Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).
  26. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137(2008).
  27. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  28. O'Neill, L. P., VerMilyea, M. D., Turner, B. M. Epigenetic characterization of the early embryo with a chromatin immunoprecipitation protocol applicable to small cell populations. Nat Genet. 38 (7), 835-841 (2006).
  29. Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25 (4), 1037-1046 (2007).
  30. Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification H3K4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
  31. Dahl, J. A., et al. Broad histone H3K4me3 domains in mouse oocytes modulate maternal-to-zygotic transition. Nature. 537 (7621), 548-552 (2016).
  32. Shen, J., et al. H3K4me3 epigenomic landscape derived from ChIP-Seq of 1,000 mouse early embryonic cells. Cell Res. 25 (1), 143-147 (2015).
  33. Flanagin, S., Nelson, J. D., Castner, D. G., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Microplate-based chromatin immunoprecipitation method, Matrix ChIP: a platform to study signaling of complex genomic events. Nucleic Acids Res. 36 (3), e17(2008).
  34. Nelson, J. D., Denisenko, O., Sova, P., Bomsztyk, K. Fast chromatin immunoprecipitation assay. Nucleic Acids Res. 34 (1), e2(2006).
  35. Lerdrup, M., Johansen, J. V., Agrawal-Singh, S., Hansen, K. An interactive environment for agile analysis and visualization of ChIP-sequencing data. Nat Struct Mol Biol. 23 (4), 349-357 (2016).
  36. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W3-W10 (2016).
  37. Blecher-Gonen, R., et al. High-throughput chromatin immunoprecipitation for genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions and epigenomic states. Nat Protoc. 8 (3), 539-554 (2013).
  38. Tang, M. pyflow-ChIPseq: a snakemake based ChIP-seq pipeline. Zenodo. , (2017).
  39. Koster, J., Rahmann, S. Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine. Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).
  40. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Res. 44 (W1), W160-W165 (2016).
  41. Bailey, T., et al. Practical guidelines for the comprehensive analysis of ChIP-seq data. PLoS Comput Biol. 9 (11), e1003326(2013).
  42. Fiziev, P., et al. Systematic Epigenomic Analysis Reveals Chromatin States Associated with Melanoma Progression. Cell Rep. 19 (4), 875-889 (2017).
  43. Liu, T., et al. Broad chromosomal domains of histone modification patterns in C. elegans. Genome Res. 21 (2), 227-236 (2011).
  44. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
  45. Rai, K., et al. Dual Roles of RNF2 in Melanoma Progression. Cancer Discov. , (2015).
  46. Cotney, J. L., Noonan, J. P. Chromatin immunoprecipitation with fixed animal tissues and preparation for high-throughput sequencing. Cold Spring Harb Protoc. (2), 191-199 (2015).
  47. Cejas, P., et al. Chromatin immunoprecipitation from fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles. Nat Med. 22 (6), 685-691 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser ara t rmalarsay 134ChIP SeqKromatin immunoprecipitationyeni nesil s ralamaHiston de i tirmeinsan t m r dokusumetastatik MelanomKromatin devlet profilleri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır