JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, nasıl hücre photoconversion floresan protein, Eos, yaşayan hayvanlarda ifade belirli alanlara UV Işınlarına maruz kalma yoluyla elde edilir göstermek için bir iletişim kuralı mevcut.

Özet

Hayvan ve bitki dokusu hücrelerinin farklı nüfus oluşur. Bu hücreler oluşturmak ve doku korumak için zaman içinde etkileşim ve bozulduğu zaman hastalığa neden olabilir. Bilim adamları özellikleri ve bu hücreler sağlam doku içinde doğal dinamikleri floresan proteinler hücre alt kümeleri arasında ifade ederek araştırmak için akıllı teknikleri geliştirdik. Ancak, zaman zaman, deneyler hücreleri tek hücre veya hücreleri nüfus şekilde, bazen doku içinde daha fazla seçili görselleştirme gerektirir. Bunu başarmak ve hücreleri nüfusu içindeki tek hücreleri görselleştirmek için bilim adamları tek hücreli photoconversion floresan proteinlerin kullanılan. Bu tekniği göstermek için biz burada nasıl UV ışığı bozulmamış bir ilgi bir Eos ifade hücreye doğrudan için Zebra balığı yaşayan gösteriyor. O zaman doku nasıl değiştirdiler belirlemek için bu photoconverted Eos+ hücreleri 24 saat sonra görüntü. Biz iki teknik tarif: tek hücre photoconversion ve hücre nüfusun photoconversions. Bu teknikler hücre-hücre etkileşimleri, hücre-kader ve farklılaşma ve hücre geçişleri, yapım o çok sayıda biyolojik sorularda uygulanabilir bir teknik görselleştirmek için kullanılabilir.

Giriş

Birden çok farklı hücre oluşturmak ve karmaşık hayvan ve bitki dokularında korumak için etkileşim. Bu hücrelerin çoğu kez ara ve yüksek çözünürlüklü mikroskobu olmadan bir tek hücre düzeyinde doku fiksasyon gerektiren komşulardan ayırt etmek zor. Ancak, nasıl bu doku formu anlamak, muhafaza ve hastalıklı olmak için nasıl tek içinde doku hücreleri araştırmak için gerekli oldu zaman içinde etkileşim vardır. İdeal olarak, bu deneyler tek hücre içinde bir doku fiksasyon zorunluluğu olmadan non-invaziv bir şekilde etiketleme gerektirir. Bilim adamları şimdi bu görev1,2,3,4gerçekleştirmek için çeşitli teknikler geliştirdik.

Keşif ve denizanası yeşil flüoresan protein (GFP) uygulanması ayrı hücre doku çevre1etiketleme için izin verilen bir heyecan verici bir yaklaşım oldu. Hücre özel Organizatör kullanarak, genetik olarak1etiketli hücre alt grubunu seçmek mümkündür. Alternatif olarak, GFP viral indüklenen ifade-ebilmek var olmak kullanmak için kullanıcı tarafından seçilen ifade GFP3,4. Her ne kadar tamamen yararlı, GFP genetik aracılı ifade kullanıcı tarafından seçilen ifade içinde bir alt doku hücrelerinin izin vermez; ve her ne kadar avantajlı, GFP, viral ifade invaziv olabilir. GFP türevleri ve farklı floresan proteinler doku içinde daha seyrek hızlı Brainbow gibi akıllı teknikleri ortaya çıkmasıyla, tek hücre ve karmaşık doku2, aralarında etkileşimleri görselleştirmek mümkün oldu 5. ancak, bu yaklaşımların bir rasgele moda hücrelerde etiket. İstenen deney görüntülenmesini tek bir hücre veya hücre deneyci tarafından tanımlanan nüfus gerektiriyorsa, bu nedenle sınırlıdır. Bu tür deneyler, bu, bir tek hücre biçimde ayırt etmek için manipüle edilebilir bir genetik olarak ifade edilen floresan protein için avantajlı olur diğer ve floresan floresan hücreleri ondan.

Bu hedefe ulaşmak için ve hücre biyolojisi karmaşık canlı bir doku içinde tek hücre görselleştirmek için tek hücre photoconversion farklı floresan proteinler6,7,8bilimsel topluluk kullanır. Genetik olarak kullanarak kontrol ifade bir yeşilden için UV maruz kalınca kırmızı floresan durumu geçişleri photoconvertible protein (Yani, eos, kaede, vb) (488 nm) ışık, biz tek bir hücre fluorescently etiketli ayırt edebilirsiniz Komşular6,7,8. Bu yaklaşım bizim confocal mikroskop lazer yığın ışıktan ilgi bir kırınım-sınırlı bölgesine doğrudan bağlı bir aparat kullanır. Bu teknik ile biz de tek hücre veya bir kullanıcı tarafından tanımlanan şekilde9,10,11daha büyük nüfus etiketleyebilirsiniz. Viral GFP tek hücre enjeksiyonlari karşılaştırıldığında minimal invasif tekniktir. Kavramının bir kanıtı olarak, biz bir gangliyon periferik sinir sistemi ve spinal kord9,10ventral tarafında bulunan hücreler gibi photoconvert daha büyük nüfus içindeki photoconvert tek hücreleri elimizden göstermek, 11,12. O zaman onların hareket ve farklılaşma geliştirme sırasında bir anlayış kazanmak için bu photoconverted hücre popülasyonlarının 24 saat sonra görselleştirebilirsiniz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları Üniversitesi Notre Dame kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.

1. Zebra balığı numune hazırlanması

  1. Bir yetişkin erkek ve bir yetişkin kadın Tg (Cabrio protein) Standart prosedürler13başına bir çiftleşme odasına koyun. Bu makale, access ancak photoconvertible proteini transgenic diğer çizgilerle nedeniyle balık9 -ebilmek var olmak kullanılmış aynı derecede Tg(sox10:eos) kullanın. Balık yatıyor musun diye birden fazla odasını ayarlayın. Balık odasında gece kalmak izin verir.
  2. Ertesi sabah, 100 mm Petri yemeklerinde yumurta toplamak. 24 saat sonrası döllenme (hpf) olgun yumurta daha önce tarama sağlar.
  3. Hayvanlar yukarıdaki heterozygotes transgene için olsaydı, diseksiyon mikroskop setlerinde Ekran 24 hpf yemekleri Tg(sox10:eos) + embriyo 488 nm ışık kaynağı ve GFP için filtre. TG(sox10:EOS) + embriyolar izole ve 48 olarak olgun için izin hpf.
  4. Dechorionate embriyo bir iğne veya cımbız ile elle.
  5. Hazırlamak ve 5 mL % 0.8 düşük erime noktası özel çözüm de mikrodalga.
    1. Özel soğukluk kez 3-4 imzalat Tg (sox10:eos) + 48 yerleştirin hpf balık bir 10 mm cam-coverslip merkezinde alt Petri kabına.
    2. Coverslip, yaklaşık 1 mL yüzey karşılamak için yeterli özel ekleyin. Bir sonda iğne balık üzerinde yan yana düzenlemek için kullanın. Hayvanların montaj sağlamak için kuvvetlendirmek özel izin. Sürekli Zebra balığı agar14katılaşır kadar yeniden düzenlemek için gerekli olabilir. Katılaşma yaklaşık 2 dakika sürer.
  6. Özel için 2 dk katılaşmış sonra yavaş yavaş %0.02 aminobenzoic asit ester agar ve çanak alt yüzeyinin batık kadar yemek için (Tricaine) içeren embriyo orta ekleyin. Bu yaklaşık 3 mL olmalıdır.

2. mikroskop montaj ve öncesi dönüşüm görüntüleme

  1. Confocal yazılımını açın ve yakalama ve odak windows [şekil 1] seçin. Yakalama penceresi altında laboratuvar özgü dönüşüm görüntüleme ayarı sekmesi [şekil 1] açılır ayarlama yakalama altında seçin. Burada, laboratuvar özgü ayarı "balık Imaging." denir
  2. Numune confocal etki alanına yerleştirin ve ders ve hassas ayar düğmeleri kullanarak odak haline getirmek.
  3. Odak penceresini açın ve istediğiniz bölgenin ilgi (yani dorsal kök gangliyon) bulun.
  4. C488 lazer filtresi ayarla menüsünden seçin. 300 MS pozu ayarlamak, 5 güç lazer ve 75 [Şekil 2] yoğunlaştırmak.
  5. Türü yakalama bölümünün altında 3D kutuyu işaretleyin. 3D yakalama bölümünde geçerli konumu kullan ' ı seçin ve çevresinde geçerli aralığınıdenetleyin. Aynı bölümünde, 35, 36 uçak ve adım boyu 1 sayısı aralığı ayarlayın. Aralığın artırılması veya azaltılması için görüntüleme alanını derinliği karşılamak için. Omurilik için 35-40 yığınları arasında bir aralık değeri genellikle yeterli [şekil 5] ' dir.
  6. Geçerli konumunu [şekil 5] seçin.
  7. Görüntü elde etmek için yakalama penceresinin altındaki Başlat'ı tıklatın.

3. tek hücreli Photoconversion

  1. Confocal yazılımını açın ve yakalama ve odak windows [şekil 1] seçin. Yakalama penceresi altında laboratuvar özgü dönüşüm görüntüleme ayarı sekmesi [şekil 1] açılır ayarlama yakalama altında seçin. Burada, laboratuvar özgü ayarı "Balık tam çip ablate." denir
  2. C488 ve c541 lazer filtresi ayarla menü altında seçin. Değil istimal aynı mikroskop bilgisayar yazılımı farklı lazerler ve seçin 488 nm ve 541 nm lazerler seçmek için menüyü bulun. 300 MS Etkilenmeler ayarla, 5 güç lazer ve 75 [Şekil 2] yoğunlaştırmak. Bu lazer ayarları photobleaching ya da toksisite neden olmadan floresan yeterli sinyal üreten göre seçilir. Toksisite veya photobleaching görselleştirildiği, lazer güç veya pozlama azaltın.
  3. Odak penceresini açın ve odak penceresindeki photomanipulation sekmesinde tıklatın. Lazer parametreleri uygun şekilde ayarlayın. Lazer yığın güç 2 olarak değiştirin ve sonra devam' ı tıklatın. Raster blok boyutu 1 olarak değiştirin ve ayarla' yı tıklatın. Çift tıklatma boyutu 4 olarak değiştirin. Lazer çizgi v405 için değiştirmek [şekil 3].
  4. Gelişmiş yakalama ayarlarını Yakalama penceresi içinde açın. Photomanipulation sekmesini seçin ve çift tıklatma tekrar 2 olarak değiştirin. [Şekil 4] Tamam'ı tıklatın.
  5. XY sekme odağı penceresinde seçin. Çift lazer parametreleri adım 2 [şekil 3, şekil 4] photomanipulation sekmesinde kontrol edin. Photoconvert hücre photoconversion çevreleyen hücre olmadan ilgi için lazer ayarlarını ayarlayın.
    1. Photoconversion bitişik hücre varsa, lazer gücü düşür. Photoconversion hücre oluşmazsa, lazer gücü arttırılabilir. En iyi şekilde, lazer güç photoconvert faiz ve çevresinde değil yalnızca bölgenin ayarlayın.
  6. Türü yakalamakaltında timelapse kutuyu işaretleyin. Sonra [şekil 6A] Başlat ' ı tıklatın.
  7. Bir kez canlı timelapse pencere açık, üst araç çubuğunda [Şekil 7] daire aracını seçin
  8. Hücrenin ortasındaki bölgede bir daire çizin. Doğru tıkırtı çizilmiş daire, sıkı BAĞLAMAK bölgeyiseçin ve 3 saniye bekleyin. Seçili alanı dimmer olacaktır [şekil 8]. Yakalama durdur' u tıklatın.
  9. Eğer birden fazla hayvan Imaging, geri odak menüsü ve seçme pozisyonu 2 XY sekmesine gidin. Daha sonra adımları 4.1-4,6 yineleyin.
  10. Hücreleri nüfusu dönüştürmek için bölgenin ilgi sıkı BAĞLAMAK, Çizgi aracını kullanmak için bir daire çizim yerine adımları 4.1-4.4 Protokolü ve lazer parametrelerini izleyin. Faiz bölge üzerinde bir çizgi çizin ve yukarıda listelenen aynı parametreleri kullanarak bölge sıkı BAĞLAMAK.

4. mesaj-photoconversion görüntüleme

  1. Bir kez tüm noktaları photoconverted. Adım 3 görüntüleme precoversion açıklanan ayarlama laboratuvar özgü standart görüntü yığını seçin. Bu yakalama Yakalama penceresinde [şekil 5] sekmesi açılır ayarlama altında bulunur.
  2. C488 lazer seçin ve 300ms maruz ayarla, 5 güç lazer ve 75 [Şekil 2] yoğunlaştırmak.
  3. C488 lazer olarak aynı menü altında bulunan c541 lazer seçin. 500 MS pozu ayarlamak, güç 10 lazer ve 75 [Şekil 9] yoğunlaştırmak.
  4. Türü yakalama bölümünün altında 3D kutuyu işaretleyin. 3D yakalama bölümünde geçerli konumu kullan ' ı seçin ve çevresinde geçerli aralığını denetleyin. Aynı bölümünde, 35, 36 uçak ve adım boyu 1 sayısı aralığı ayarlayın. Aralık sayı istediğiniz görüntüleme derinliği [şekil 5] karşılamak için azaltabilir veya artırabilirsiniz.
  5. XY odak sekmesinde birden çok nokta varsa, çok noktalı Listele seçeneğini yakalama penceresinde seçin. Eğer değilse, geçerli konumunu seçin.
  6. Görüntü elde etmek için yakalama penceresinin altındaki Başlat'ı tıklatın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Photoconversion floresan proteinlerin bir doku6farklı hücrelerde etiketlemek için kullanılabilir. Bunu göstermek için Tg(sox10:eos) balık9 kullanılan sox10düzenleyici dizileri altında photoconvertible protein Eos ifade etmek için. Tg(sox10:eos) hayvanların 48 hpf olduğunu ilk monte edilmiş ve daha sonra oluşmuş olabilir herhangi bir non-spesifik photoconversion tespit etmek için yansıma. Dönüşt...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Karmaşık dokularda, farklı hücre tipleri belirli etki alanlarına düzenleyin. Son zamanlarda teknikleri bu büyük doku yapıları1,2,3içinde etiket tek tek hücreler için kullanılması. Burada benzer şekilde tek hücre etkileşimleri ve karmaşık dokularda hücre nüfus etkileşimleri görselleştirmek için kullanılması gereken iki teknikleri göstermektedir. Photoconversion tekniği belirgin bir hücre etiketlemek...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bernard Kulemaka ve onların yararlı yorumlar ve reaktif rehberlik, Sam Connell ve Brent Redford, Zebra balığı bakımı için görüntüleme sorular ve Deborah Bang, Karen Heed ve Kay Stewart fielding için 3i Smith laboratuara üyeleri teşekkür ederiz. Bu eser Zebra balığı araştırma Üniversitesi Notre ve kök hücre Merkezi ve Notre Üniversitesi, Rejeneratif Tıp Üniversitesi, Notre Dame, Elizabeth ve Michael Gallagher aile, Alfred P. Sloan Vakfı, Merkezi tarafından desteklenmiştir Dame. Tüm hayvan çalışmaları Notre Dame Üniversitesi ile uyumlu IACUC Dr Cody Smith için yapıldı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Tg(sox10:eos) zebrafish animalsFish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame
100 X 15 mm petri dishVWR25384-302
Embryo mediumEmbryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.
0.8% Low Melting Point Agarosedot scientific inc9012-36-6
35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dishTed Pella Inc.14021-20
Needle dissecting probe
0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine)Fluka analyticalA5040-250G
Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filtersZeiss Axiozoom
Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets3i spinning disk confocal
UV light source (laser) for photoconversion405 nm laser
Slidebook software3i
Methylene blueKordon

Referanslar

  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Livet, J., Weissman, T. A., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  3. Goins, W. F., Krisky, D., et al. Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system. J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).
  4. Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells. Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).
  5. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).
  6. Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).
  7. Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling. ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).
  8. Terskikh, A., Fradkov, A., et al. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).
  9. McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling. Neural Dev. 7 (23), (2012).
  10. Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone. PLoS biology. 12 (9), e1001961(2014).
  11. Ravanelli, A. M., Appel, B. Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment. Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).
  12. Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones. Glia. , (2016).
  13. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  14. Kirby, B. B., Takada, N., et al. In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development. Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).
  15. Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im biyolojisisay 133Zebra balphotoconversionEosconfocalmikroskobu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır