JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Uyuyan ve aktif kanser hücre fenotipleri nicel faz Imaging'i kullanma ile karakterize. Hücre çoğalması, geçiş ve Morfoloji deneyleri entegre ve basit bir yöntem ile analiz edildi.

Özet

Anjiogenik fenotip edinimi tümör uyuşukluk kaçış temel bir bileşenidir. Birkaç klasik vitro deneyleri (örneğin, nükleer silahların yayılmasına karşı göç ve diğerleri) ve in vivo modelleri araştırmak ve anjiogenik ve sigara anjiogenik hücre fenotipleri karakterize geliştirilmiştir, bu yöntemler zaman olmakla birlikte yoğun emek ve genellikle pahalı reaktifler ve aletleri yanı sıra önemli uzmanlık gerektirir. Son çalışmada, hızlandırılmış ve etiketleme-Alerjik karakterizasyonu anjiogenik ve sigara anjiogenik insan osteosarkom KHOS hücre yapmak için bir roman nicel faz (QPI) tekniği Imaging kullanılan. Bir panel hücre morfolojisi, yayılması ve hareketliliği, gibi hücresel parametrelerinin kantitatif ölçüldü ve QPI kullanılarak analiz. Bu roman ve kantitatif yaklaşım sürekli ve non-invaziv basit ve entegre bir şekilde ilgili hücresel süreçler, davranışları ve kanser hücrelerinin özellikleri ve diğer hücre tipleri çalışmaya fırsat sağlamaktadır. Bu rapor hücre hazırlık, QPI toplama ve veri analizi de dahil olmak üzere bizim deneysel protokolünü açıklar.

Giriş

Bir gelişme ve ilerleme bir solid tümör erken denetim noktaları anjiogenik fenotip, kanser damgasını edinimi biridir. Bu ilerleme biyokimyasal ve moleküler işlemleri1,2,3çeşitli içerir. Çalışmada tümör ilerleme anahtar bu adımda, teknik bir sorun sürekli olarak ve kantitatif karakterize ve tarafsız bir şekilde canlı kanser hücrelerinin anjiogenik ve sigara anjiogenik fenotipleri birbirinden ayırmak için Araçlar olmaması. Örneğin, Hücre proliferasyonu/geçiş4,5deneyleri, aletleri ve pahalı reaktifler anjiogenik ve sigara anjiogenik hücre hücresel davranışları genellikle araştırmak için kullanılan geleneksel deneyleri gerektirir, 6,7,8,9,10,11,12,13,14 veya tamamlayıcı vivo içinde değerlendirme4,5,6,8,15,16gibi önemli uzmanlık ve yoğun gerektiren emek ve zaman tüketimi.

Son zamanlarda, nicel faz (QPI) görüntüleme hücre morfolojisi ve davranış parametreleri17,18,19, çeşitli hızlandırılmış ve etiketleme-Alerjik değerlendirmesini sağlayan yeni bir teknik olarak ortaya çıkmıştır 20 , 21 , 22. ışık geçer bir optik nesnesi aracılığıyla ve dönüştürülmüş optik kalınlık ve ses düzeyi ile bir hologram yeniden yapılandırır sonra geleneksel optik mikroskobu QPI faz kayması piksel piksel varyasyonları böylece doğrudan etkinleştirme quantifies analiz canlı hücreleri ve aşağıdaki özellikler: (1) kantitatif görüntüleme, (2) non-invaziv ve hızlandırılmış görüntüleme, görüntü (3) etiket-Alerjik ve (4) aynı anda çok parametreli görüntüleme. Bu özellikler QPI değerlendirmek ve hücresel düzeyde patolojik süreçleri anlamak için güçlü bir araç sağlar.

Bir son çalışmada, biz QPI kantitatif karakterize ve anjiogenik arasında ayırt etmek için kullanılan KHOS-A ve anjiogenik KHOS-N fenotipleri insan osteosarkom hücreleri hücre morfolojisi, analizlerini birleştirerek sistematik ve nicel bir şekilde nükleer silahların yayılmasına karşı ve motilite23. Görüntü analiz yazılımı, bir panel kullanarak hücre morfolojik ve davranış parametreleri kantitatif anjiogenik ve sigara anjiogenik insan osteosarkom hücreleri arasında karşılaştırıldı ve bu ikisi arasında beş karakteristik farklılıkları tespit edilmiştir fenotipleri. Bu yeni yaklaşımın biyolojik ilgili hücresel özellikleri çeşitli değerlendirmek için tümleşik ve nicel bir platform sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada Boston Çocuk Hastanesi kurumsal Biyogüvenlik Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1. hücre hazırlık

  1. KHOS-bir çözülme ve -N hücreleri
    1. Kültür orta, Yani, ısınmak Dulbecco'nın kartal orta % 10 (vol/vol) fetal buzağı serum (FBS) ve % 1 (vol/vol) penisilin/streptomisin ile desteklenmiş değiştiren.
    2. Kriyojenik şişeleri hücrelerinin sıvı azot tankından al, şişeleri dibinde bir 37 ° C su banyoda sıcak su içine sokmak ve çözülme sürecini hızlandırmak için kriyojenik şişeleri yavaşça salla. Kriyojenik şişeleri ağzını su kirlenmesini önlemek için iletişim kurmanızı tut. En kısa zamanda hücreleri çözdürülen, kriyojenik şişeyi % 70 etanol çözüm püskürtme ve şişe silinerek sterilize.
    3. Laminar akış hood, hemen hücre süspansiyon kriyojenik şişe dan Aspire edin ve yavaşça 10 mL sıcak kültür (1.1.1 içinde açıklanan) ortamda askıya alma. Hücre süspansiyonlar, yaklaşık 200 x g için 5-7 dk santrifüj kapasitesi.
    4. Hücre Pelet 10 mL sıcak kültür orta ile resuspend ve bir T75 şişesi aktarın. Yavaşça birkaç kez pipet eşit bir 10 mL damlalıklı kullanarak hücreleri askıya alma.
    5. %5 (vol/vol) CO2 ve oksijen atmosferi ile 37 ° C kuluçka makinesi içine şişeye koyun. Hücreleri en az 12 h eklemek izin verir.
    6. Yaklaşık 3-7 gün öncesine kadar % 80-100 birleşmesi için hücreleri kuluçkaya. Kültür orta 2-3 günde değiştirin.
  2. KHOS-A bölme ve -N hücreleri
    1. Kültür medya balonun kaldırın.
    2. 5 mL steril PBS hücrelerle yıkayın (1 x) kalsiyum ve magnezyum sigara yapışık hücreleri veya kesir kaldırmak için olmadan.
    3. 1 mL % 0.05 tripsin-EDTA çözüm balonun ekleyin ve kısa bir süre şişeye tripsin-EDTA eşit dağınık emin olmak için girdap.
    4. 2-3 dk 37 ° C kuluçka veya 3-5 dk oda sıcaklığında şişeye kuluçkaya. Hücreleri yukarı yuvarlamak ve müstakil emin olmak için yaklaşık 400 x büyütme, mikroskop altında hücreleri denetleyin.
    5. Sonra hücreleri ayrılır, 10 mL kültür orta ekleyin ve hafifçe yukarı ve aşağı birkaç kez hücre toplamları 10 mL damlalıklı kullanarak bir tek hücre süspansiyon içine bölmek için orta pipette.
    6. Bir hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak. 2 × 106 hücre yoğunluğu veya bir oranı 1:4 yeni T75 şişeler içine hücre süspansiyon tohum.
    7. Hücreleri QPI deneme için tohum önce 80-%100 izdiham için büyümeye izin.
  3. KHOS-A tohum ve QPI için -N hücreleri
    1. Tohum KHOS-A ve 6-şey plakaları, 50.000-300,000 hücreler/iyi ile 5 mL kültürü olan bir hücre sayaç sayım sonra Orta yoğunluk -N hücrelerde.
      Not: Tohum yoğunluğu için hücre proliferasyon hızı ve görüntüleme dönemini bağlıdır < % 100 izdiham edinme görüntüleme sırasında.
    2. Hücreler için ek izin vermek en az 12 h kuluçkaya.
    3. Taze medya ile orta QPI gerçekleştirmeden önce değiştirin.

2. QPI edinme

  1. Kapak kurmak slip
    1. Birkaç kez çalıştıran deiyonize su ile durulama tarafından kapak notu temiz ve 15 dk. kapak notu kuru steril laminar akış hood koymak için daldırma tarafından % 75 etanol çözüm ile sterilize.
    2. Dikkatlice kapak notu açık kabarcıklar önlemek için bir 6-şey plaka üzerine koyun. Alt kapak fişinin kültür medya (en az 5 mL/de) dalmış emin olun.
    3. Plaka (37 ° C, % 5 CO2ve oksijen atmosfer) en az 15 dakikadır equilibrate kuluçka makinesi yerleştirin. Sis ile ilgili kapak formu oluşturur, steril pamuklu çubukla temiz silmek için kullanın.
  2. Hücreler mikroskopla görüntüleme
    1. Kendi kendine kalibrasyon pozlama süresi, desen kontrast ve hologram gürültü de dahil olmak üzere sistem başlatmak için yazılımını açın. (Yeşil veya sarı aralığında gösterilmiştir) değerleri kabul edilebilir olduğundan emin olun.
    2. 6-şey plaka Sahne Alanı'na QPI mikroskop yer.
    3. "Canlı yakalamak"'ı tıklatın ve "El ile" seçeneğini "Yazılım odakta." Kaba "Mikroskop ayarı" iş uzaktan ayarlayarak hücreleri faz görüntülerini odaklanmak özetliyor hücrelerin faz görüntüler elde etmek için. Değiştirmek için "Otomatik" "Yazılım odak."
    4. "Yeni bir deneme"'ı tıklatın Yeni bir deneme oluşturmak için. Sayısal altlığında fareyi veya ok tuşlarını kullanarak görüntü Alım pozisyonları yelpazesi ile başlayın. "Hatırla" her seçimden sonra'ı tıklatın. Normalde 3-5 konumları her örnek için seçilir.
    5. Görüntüleme aralığı ve zaman dilimi "Timelapse" bölümünde ayarlayın.
      Not: kanser hücrelerinin açıkça izlemek için aralıkları 5 dk. 48 saat süre kasanın QPI analiz olarak ayarlanmış olan daha kısa olması gerekir.
    6. Hangi automatically odak ve görüntüleri ayarı zaman noktalarda "Yakalama" tıklayarak deneme başlayın.

3. veri analizi

  1. Hücre Morfoloji analizi
    1. "Hücreleri tanımlamak." tıklayın Böylece arka plan gürültü de ayrılmış hücre alanları "İçin arka plan eşik" sayısal ayarını ayarlayın. "Nesne boyutu" ayarı numarasını ayarlamak her hücre bir çekirdeğe sahiptir emin olmak için. Bunlar son alan ve hacim ölçüleri etkileyebilir gibi karşılaştırılması gereken örnekleri için tutarlı parametreleri korumak. El ile hücre kesimleri "El ile değişiklik," kullanarak gerekirse değiştirin.
    2. Hücreleri çözümlemek için yazılımda "verileri çözümlemek" işlevini kullanın. Yeni bir veri analizi "Yeni analiz." tıklayarak başlatın Seçilen görüntüler hücre alanı (µm2), optik kalınlık (µm) ve cilt (µm3) için tek tek her hücre de dahil olmak üzere "Kaynak çerçeveler" sekmesini ve hücre morfolojisi parametreleri içine sürükleyin. Dağılım çizim veya çubuk grafik modu ve ihracat verileri tablo veya şekiller olarak seçin.
  2. Hücre çoğalması analizi
    1. Farklı zaman makas-in ilgi (örneğin, ilk, 12 h, 24 h, 36 h ve 48 h) için en az 5 resim seçin. Yazılım tarafından sağlanan kayıt hücre sayıları.
    2. Katlama zaman tahmin etmek için hücre sayıları ile ilk sayılar normalize sonra arsa ve üstel büyüme eğrileri ile uygun.
  3. Hücre hareket analizi
    1. Yazılım "hücreleri izleme" işlevini kullanın. "Yeni analiz"'ı tıklatın Yeni veri analizi başlatmak için. Sürükle serisi için belirlenen zaman dilimi (örneğin, 4 h 24 h kuluçka sonra) "Kaynak çerçeveler" sekmesini içine görüntülerin rastgele 10-30 hücreleri "Hücre Ekle" seçim modu altında hücreleri tıklatarak seçin. Kenarları ve bu görüş alanı dışında hücreleri hariç.
    2. Görüntüleri dizi izlemede dikkatlice kontrol edin. Sistem bir hücreye mefhumunu kaybeder veya yanlış hücre izler olay bu, el ile izleme hücre hücreleri tanımlamak için "tanımlamak" veya "yer değiştirme" seçeneğinin tıklatılması tarafından hücre konumu değiştirmek için "Select" modunda ayarlayın.
    3. Hücre yörüngeler "Arsa hareketi" gül arsa veya arsa "Arsa özellikleri sayfasında" hareketliliği hız (µm/h), motilite (µm), geçiş (µm) ve geçiş telaş gibi diğer hareket etme parametreler için seçin. Veri tabloları veya rakamlar olarak verin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Şekil 1 bir tipik hücre morfolojisi karakterizasyonu gösteriyor. Görüntüleri hologramları (şekil 1A-B) ve 2D görüntüleri (şekil 1 c-D) sunulmaktadır. Optik hücre kalınlıkları (Kırılma indisi ve optik yol uzunluğu hesaplanır) satırı profil veya tüm cep telefonu ölçüm ile sayılabilir. Dağılım alanı ve kalınlık KHOS-a çizer ve tüm cep...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu çalışmada, kantitatif anjiogenik ve sigara anjiogenik fenotipleri insan osteosarkom hücreleri ayırdetmek için QPI kullanarak bir vitro, non-invaziv ve etiket içermeyen yöntemi açıklanmaktadır. Birden çok hücresel parametre aynı anda hücre alan, hücre kalınlığı, hücre hacmi, nükleer silahların yayılmasına karşı oranı, zaman, geçiş telaş, hareketliliği hız, geçiş ve hareketliliği iki katına da dahil olmak üzere bu entegre, yüksek üretilen iş yöntemine göre analiz edilm...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.

Teşekkürler

Yazarlar meme kanseri Araştırma Vakfı ve gelişmiş tıbbi araştırma Vakfı desteğiyle minnetle kabul etmiş oluyorsunuz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
T75 flaskCorning, NY, USA353136
6-well plates Corning, NY, USA3506
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA, USA11965092
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals, GA, USAS11550
Penicillin StreptomycinThermo Fisher Scientific, MA, USA15140122
Phosphate buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USA10010023
Beckman Z1 Coulter counterBeckman Coulter, IN, USAZ1 
HoloMonitor M4Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, SwedenM4Microscope
HololidPhase Holographic Imaging Phi AB, Lund, SwedenPHI 8020
HStudioM4Phase Holographic Imaging Phi AB, Lund, SwedenHStudioM4Software

Referanslar

  1. Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
  2. Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
  3. Harper, J., Moses, M. A. Molecular regulation of tumor angiogenesis: mechanisms and therapeutic implications. EXS. (96), 223-268 (2006).
  4. Naumov, G. N., et al. A model of human tumor dormancy: an angiogenic switch from the nonangiogenic phenotype. Journal of the National Cancer Institute. 98 (5), 316-325 (2006).
  5. Fang, J., et al. Matrix metalloproteinase-2 is required for the switch to the angiogenic phenotype in a tumor model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (8), 3884-3889 (2000).
  6. Almog, N., et al. Transcriptional switch of dormant tumors to fast-growing angiogenic phenotype. Cancer Research. 69 (3), 836-844 (2009).
  7. Hu, J., et al. Gene expression signature for angiogenic and nonangiogenic non-small-cell lung cancer. Oncogene. 24 (7), 1212-1219 (2005).
  8. Harper, J., et al. Repression of vascular endothelial growth factor expression by the zinc finger transcription factor ZNF24. Cancer Research. 67 (18), 8736-8741 (2007).
  9. Jia, D., et al. Transcriptional repression of VEGF by ZNF24: mechanistic studies and vascular consequences in vivo. Blood. 121 (4), 707-715 (2013).
  10. Jia, D., Huang, L., Bischoff, J., Moses, M. A. The endogenous zinc finger transcription factor, ZNF24, modulates the angiogenic potential of human microvascular endothelial cells. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (4), 1371-1382 (2015).
  11. Almog, N., et al. Prolonged dormancy of human liposarcoma is associated with impaired tumor angiogenesis. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (7), 947-949 (2006).
  12. Almog, N., et al. Consensus micro RNAs governing the switch of dormant tumors to the fast-growing angiogenic phenotype. PloS One. 7 (8), e44001(2012).
  13. Satchi-Fainaro, R., et al. Prospective identification of glioblastoma cells generating dormant tumors. PloS One. 7 (9), e44395(2012).
  14. Almog, N., et al. Transcriptional changes induced by the tumor dormancy-associated microRNA-190. Transcription. 4 (4), 177-191 (2013).
  15. Gao, D., Nolan, D. J., Mellick, A. S., Bambino, K., McDonnell, K., Mittal, V. Endothelial progenitor cells control the angiogenic switch in mouse lung metastasis. Science. 319 (5860), New York, N.Y. 195-198 (2008).
  16. Folkman, J., Watson, K., Ingber, D., Hanahan, D. Induction of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia. Nature. 339 (6219), 58-61 (1989).
  17. Popescu, G. Quantitative phase imaging of cells and tissues. , McGraw-Hill: New York. (2011).
  18. Lee, K., et al. Quantitative Phase Imaging Techniques for the Study of Cell Pathophysiology: From Principles to Applications. Sensors. 13 (4), 4170-4191 (2013).
  19. Mir, M., Bhaduri, B., Wang, R., Zhu, R., Popescu, G. Quantitative Phase Imaging. Progress in Optics. 57, 133-217 (2012).
  20. Marrison, J., Räty, L., Marriott, P., O'Toole, P. Ptychography--a label free, high-contrast imaging technique for live cells using quantitative phase information. Scientific Reports. 3, 2369(2013).
  21. Falck Miniotis, M., Mukwaya, A., Gjörloff Wingren, A. Digital holographic microscopy for non-invasive monitoring of cell cycle arrest in L929 cells. PloS One. 9 (9), e106546(2014).
  22. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. AJP: Cell Physiology. 295 (2), C538-C544 (2008).
  23. Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Characterization of dormant and active human cancer cells by quantitative phase imaging. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Advancement of Cytometry. 91 (5), 424-432 (2017).
  24. Mir, M., Bergamaschi, A., Katzenellenbogen, B. S., Popescu, G. Highly sensitive quantitative imaging for monitoring single cancer cell growth kinetics and drug response. PloS One. 9 (2), e89000(2014).
  25. Mir, M., Tangella, K., Popescu, G. Blood testing at the single cell level using quantitative phase and amplitude microscopy. Biomedical Optics Express. 2 (12), 3259-3266 (2011).
  26. Park, Y., et al. Measurement of red blood cell mechanics during morphological changes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6731-6736 (2010).
  27. Pham, H. V., Bhaduri, B., Tangella, K., Best-Popescu, C., Popescu, G. Real time blood testing using quantitative phase imaging. PloS One. 8 (2), e55676(2013).
  28. Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 5, 9976(2015).
  29. Park, H., et al. Measuring cell surface area and deformability of individual human red blood cells over blood storage using quantitative phase imaging. Scientific Reports. 6, 34257(2016).
  30. Bishitz, Y., Gabai, H., Girshovitz, P., Shaked, N. T. Optical-mechanical signatures of cancer cells based on fluctuation profiles measured by interferometry. Journal of Biophotonics. 7 (8), 624-630 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser ara t rmalarsay 132nicel faz g r nt lemeholografik mikroskobut m r uyu uklukt m r angiogenezh cre fenotiph cre morfolojisih cre gh cre d ng sosteosarkom

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır