JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Facile Floresans tahlil kanonik olmayan amino-asit (ncAAs) memeli hücrelerinde proteinlerin içine birleşmeyle amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri verimliliğini değerlendirmek için sunulmuştur. G-protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) çalışmaya ncAAs uygulanması siteleri ve bioorthogonal GPCR canlı hücreleri üzerinde etiketleme bağlama fotoğraf-çapraz eşleme dahil olmak üzere açıklanır.

Özet

Kanonik olmayan amino asitler (ncAAs) yolu ile amber stop kodonu bastırma genetik birleşme yapay sonda ve reaktif moieties proteinleri üzerine doğrudan canlı hücre içinde yüklemek için güçlü bir tekniktir. Her ncAA ana bilgisayar organizma ithal bir adanmış ortogonal bastırıcı-tRNA/amino-asil-tRNA-sentetaz (AARS) çifti tarafından kurulmuştur. Farklı ncAAs birleşme verimliliğini büyük ölçüde farklılık gösterebilir ve bazı durumlarda yetersiz. Ortogonal çiftleri AARS veya tRNA manipüle ederek geliştirilebilir. Ancak, yönlendirilmiş evrim tRNA veya büyük kütüphaneler ve ölü/canlı seçim yöntemlerini kullanarak AARS değildir uygun memeli hücrelerinde. Burada, dik memeli hücreleri çiftinde verimliliğini değerlendirmek için bir facile ve sağlam Floresans tabanlı tahlil sunulur. Tahlil onlarca AARS/tRNA değişik bir orta çaba ile ve makul bir süre içinde yüzlerce tarama sağlar. Kullanım pyrrolysine ortogonal sisteminin performansını önemli ölçüde artıran yeni tRNA oluşturmak için bu testin anlatılan, ncAAs uygulamaya G-protein çalışmanın yanı sıra nesneleri ncAA için zorlu reseptörleri (GPCRs), birleşince mutagenesis. İlk olarak, sistematik bir reseptör ekstraselüler yüzeyi boyunca fotoğraf-crosslinking ncAA birleşmeyle, bozulmamış reseptör üzerinde farklı ligandlar bağlama siteleri doğrudan canlı hücre içinde eşleştirilir. İkinci, son nesil ncAAs bir GPCR birleşmeyle, floresan bir boya ile ultrafast katalizör-Alerjik reseptör etiketleme, hangi bioorthogonal zorlanma terfi ters Diels Alder cycloaddition (SPIEDAC) canlı hücre üzerinde olağanüstü başarı gösterilmiştir. NcAAs genellikle herhangi bir protein boyutuna üzerinde bağımsız olarak uygulanabilir gibi uygulamalar için genel ilgi yöntemidir. Buna ek olarak, ncAA birleşme herhangi bir özel ekipman gerektirmez ve standart Biyokimya laboratuvarlarında kolayca gerçekleştirilir.

Giriş

Kimyasal probları genetik birleşme proteinlerin içine protein işlevi doğrudan canlı hücre yerli bağlamında yapısal ve dinamik yönleriyle incelenmesi kolaylaştırmak için güçlü bir yöntemdir. Günümüzde, kanonik olmayan amino asitler (ncAAs) en farklı kimyasal gruplar ile donatılmış yüzlerce site-specifically protein biyosentezi1,2,3,4tarafından eklenebilir. Aralarında, bir fotoğraf-crosslinkers5, fotoğraf Kafesli6,7,8,9 ve fotoğraf değiştirilebilir amino asitler10, gibi fotoğraf duyarlı ncAAs bulur 11, amino asitler taşıyan gergin alkenes ve alkynes catalyst-Alerjik bioorthogonal kimya2,12,13,14,15,16 ,17, dansyl18, coumarin9,19ve prodan20,21 fluorophores taşıyan amino asitleri ve amino asitler biyofiziksel diğer probları ile donatılmış sonrası translasyonel modifikasyonlar1,2,3,4,22,23,24,ile25gibi iyi.

Genetik bir ncAA kodlama bir adanmış amino-asil-tRNA-ncAA yanıt olarak bir kehribar kodonu düzenli ribozomal sentezi sırasında birleştirmek soydaş bir bastırıcı-tRNA için eşleştirilmiş sentetaz (AARS) tarafından etkinleştirilir. ncAARS/tRNA çiftleri konak canlı, Yani değil çapraz-endojen çiftiyle hadis dik olacak şekilde tasarlanmıştır. Prokaryotik ve ökaryotik ana bilgisayarlar ve kolayca uygulanabilir memeli hücreleri hem de iyi kurulmuş bir tekniktir. Memeli hücrelerinde ncAA birleşme için çift üç ana ortogonal sistemlerinde temel alır: E. coli26 TyrRS bir tyrosyl amber bastırıcı B. stearothermophilus27 (Ec ile birleştiren tyrosyl sistemi TyrRS /BstYam çift), E. coli leucyl sistemi (EcLeuRS/tRNALeuCUA çifti)6,18,28 ve arke pyrrolysyl sistemi (PylRS/tRNA Pyl çifti)3, tRNAPyl bu sayede doğal kehribar bastırıcı. Genel olarak, her ncAA tarafından özel bir ncAARS tanınır. Her ne kadar bazı sentetaz birden fazla ncAA kabul edebilir ncAA yapısına bağlı olarak, ncAARS TyrRS, LeuRS veya PylRS, yönlendirilmiş evrim elde edilir.

Ortogonal çifti sadece bir plazmid vektör kullanarak hücre içine alınır. En yaygın ve etkin plazmid ortogonal çifti29şekillendirme tRNA sentetaz hem de encode ve bicistronic vardır. Kodlama değişikliği için belirlenmiş sitesinde bir kehribar kodon faizli protein için ikinci plazmid co transfected. NcAA sadece hücre büyüme ortamına eklenir. Ancak, farklı özel gruplar genellikle plazmid yapıları farklı türevleri bile aynı ncAA birleşme için kullanın. Düzenleme vektör, sentetaz türünü, kodon kullanım sentetaz gen, organizatörü kullanımı, değişken tRNA ve tRNA ifade kaset sayısı genlerin yapıları farklı. Ayrıca, farklı ncAAs birleşme verimliliği nedeniyle farklı katalitik verimini farklı sentetaz, tRNA ve diğer faktörler30kalitesini büyük ölçüde değişebilir. Bu nedenle, el altında dik çiftinin en uygun sistemi için istediğiniz uygulamayı seçin ve genel protein ifade geliştirmek bazı optimizasyon adımları gerçekleştirmek için verimliliğini değerlendirmek için hızlı ve güvenilir bir yöntem olması önemlidir verir.

Biz dik çiftleri29 (şekil 1) verimliliğini değerlendirmek için bir basit ve sağlam Floresans tabanlı tahlil kurduk. Assay olarak, plazmid ile birlikte her ikisi için bir kehribar kodonu izin veren bir konumda (EGFPetiketi) taşıyan yeşil flüoresan protein kodlama bicistronic muhabir plazmid ortogonal çifti için kodlama ile ortak transfected hücrelerdir ve mCherry gen. Bütün hücreli lysates kırmızı ve yeşil floresan bir plaka okuyucu bir 96-şey plaka üzerinde ayrı kanallarda okuyun. Kırmızı Floresans yoğunluğunu transfection etkinlik ve ölçülen örnek boyutunun doğrudan bir tahmin verir ise yeşil floresan yoğunluğu doğrudan kehribar giderme, verimliliği ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Floresans üzerinde dayalı benzer deneyleri ile ilgili olarak yardımlı hücre (FACS) sıralama okumak31,32, tahlil protein ifade acil ve kapsamlı bir değerlendirmesini daha fazla olan tüm cep telefonu topluluk içinde verir. Her zamanki deneysel koşullar, temsilcisi ve bir daha kolay veri toplama ve işleme standart yazılım ile sunmaktadır. Genel olarak, en büyük avantajı tahlil örnekleri çok sayıda orta paralel olarak analiz edilebilir olduğunu. Bu tahlil kullanarak, bastırıcı-tRNA Pyl ortogonal sistem30verimliliğini artırmak için mantıklı bir şekilde tasarlanmış bir kütüphane ekranlı. Bu eser bu tahlil gerçekleştirmek ve fotoğraf-crosslinking ncAA p-azido-L-fenilalanin (Polat) birleşme ortogonal çiftinin optimizasyonu ve karşılaştırılması gibi onun uygulama örnekleri göstermek için deneysel protokolünü açıklar birleşme verimliliği farklı amino asit (Şekil 2).

Geçen yıllar boyunca, yapısal araştırmak için çok güçlü kanıtlanmış ncAA araçları ve reseptörleri (GPCRs)33,34,35,36,37 G-protein fonksiyonel yönleri birleştiğinde , 38. insanlarda, GPCRs membran reseptörleri (800 üye) büyük bir aile oluşturmak ve tedavi edici ilaçlar için ana hedefleri temsil eder. GPCRs doğrudan yapısal karakterizasyonu hala meydan okuyor ve tamamlayıcı biyokimyasal yöntem son derece onların soruşturma için ihtiyaç vardır. Fotoğraf-çapraz ncAAs GPCR yüzeyler harita ve ligand bağlayıcı cepler34keşfetmek için kullanılmasına öncülük etmiştir. Polat birleşme için en iyi duruma getirilmiş sistemimizi kullanarak, biz sistematik olarak Polat GPCR canlı memeli hücrelerinde doğrudan, Bütün juxtamembrane etki alanı dahil. UV ışınlama Polat komşu molekülleri kovalent yakalar bir büyük ölçüde reaktif nitrene tür oluşturur. Ligand sisteme eklendiğinde, Polat hangi pozisyonlar reseptör ilişkili ligand yakın gel ortaya çıkarmak için bir yakınlık sonda olarak hizmet vermektedir. Bu şekilde, peptit hormon Urocortin ı (Ucn1) Sınıf B GPCR kortikotropin-serbest-faktör reseptör tarihinde 1 (CRF1R)33 tipi bağlama modu ilk açıldı. Son zamanlarda, farklı bağlama kalıpları agonistleri ve antagonistleri tarihinde aynı reseptör38ifşa. Benzer bir yaklaşım, orthosteric ve allosteric bağlayıcı siteleri diğer peptidler ve küçük molekül ligandlar tarihinde diğer GPCRs39,40,41,42ortaya çıkarmak için başkaları tarafından uygulanmıştır. Bu el yazması GPCR yüzeyler, fotoğraf-crosslinking eşleştirilmesine bizim laboratuvarında uygulanan deneysel protokolünü açıklar. Yöntem nispeten hızlı, basit ve böylece standart Biyokimya laboratuvarlarında uygulanabilir herhangi bir özel bir donanım gerektirmez. Önemlisi, yaklaşım sadece 3D yapısal verileri nerede kıt ligand bağlayıcı siteleri tanımlamak için aynı zamanda tam olarak post-translationally tarihinde reseptörleri üzerinden bilgileriyle varolan vitro verileri ek olarak değerli bir araç sağlar canlı hücre fizyolojik ortamı.

Roman ncAAs yan zinciri kimyasal gruplarında ultrafast katalizör-Alerjik bioorthogonal Kimya için uygun taşıyan son gelişme olasılığı son nesil fluorophores süper kararlılık düşsel için protein yüklemek için açtı 2,43doğrudan canlı hücreleri. Bu tür kimyasal dübel gergin cyclooctyne dahil SCOK14, bicyclo [6.1.0] nonyne BCNK12,17ve trans-cyclooctenes toplam sahip olma maliyeti içinde * K13,15,17 diğer ncAAs arasında norbornene16,17,44 veya cyclopropene45,46 yan yataklık. Bioorthogonal kimya hantal ncAAs genellikle PylRSAF ile belirtilen PylRS varyanta göre dahil (mutasyon gösteren Y271A ve M. barkeri PylRS Y349F), yanı sıra diğer gelişti geçici ncAARSs tarafından17 gibi , 44. bioorthogonal çapa yüksek etiketleme verim içinde birkaç dakika43,48vermek için ters elektron isteğe Diels-Alder cycloaddition via tetrazine reaktifler47 ile tepki. Ancak, uygulama için etiket GPCRs güçlü Bu yaklaşımın ortogonal ncAA birleşme sistem düşük bir genel verimliliğini nedeniyle zor oldu. Gelişmiş Pyl sistemimizi kullanarak, son zamanlarda yüksek verimli birleşme gibi amino asitler GPCRs ve ultrafast GPCR canlı memeli hücreleri30yüzeyinde etiketleme göstermiştir. Fizyolojik bir agonist ile reseptör aktif hale getirildiğinde içselleştirilmiş gibi etiketli reseptörleri hala fonksiyonel. Deneysel protokol bioorthogonal birleşme GPCRs tutturur ve aşağıdaki etiketleme adımları burada açıklanmıştır. GPCRs küçük parlak fluorophores ile donatılması ilk temel doğru GPCR yapısal dinamiklerin canlı hücredeki çalışma yolu ile gelişmiş mikroskobu teknikleri adımdır.

Protokol

1. Floresans tabanlı tarama birleşme verimliliği (şekil 1)

  1. Dulbecco'nın modifiye kartal orta HEK293 hücreleri korumak (DMEM; yüksek glikoz, 4 mM glutamin, pyruvate) % 10 (v/v) fetal sığır serum (FBS), 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin 37 ° C, % 95 nem oranı ve % 5 CO2ile desteklenmiştir.
  2. Tohum hücreleri transfection önceki gün.
    1. Hücreleri % 0.05 tripsin/PBS 0,5 mM EDTA ile desteklenmiş olarak 37 ° C'de 5 dakika ayır. 1 mL tripsin/EDTA 10 cm yemek için kullanın. Tam orta 10 birimleri ile gidermek ve hücreleri pipetting tarafından resuspend. Hemasitometre49kullanarak süspansiyon hücreleri saymak.
    2. 6-iyi tabak 2 mL tam büyüme orta kuyu başına tohum 6.0 x 105 HEK293 hücre. Çok kuyu örnekleri ve iki ek kuyu sayısı olarak vahşi tipli EGFP ve sahte transfected örnek için sırasıyla hazırlayın.
  3. İzdiham (alan hücreler tarafından işgal) mikroskop altında kontrol. % ~ 70 izdiham polyethyleneimine (PEI) Reaktif kullanarak hücreleri transfect.
    1. 1 saat önce transfection, taze hazırlanmış ncAA hisse senedi çözüm uygun miktarda eklemek tüm kuyular için bir final ncAA konsantrasyon 0,25-0,5 mM. NcAA vahşi tipi olumlu denetim ve ncAA hücresel büyüme üzerine etkisi neden olabilir floresan sinyallerini farklılıkları önlemek için sahte transfected hücreleri de dahil olmak üzere tüm wells ekleyin.
      Not: Hisse senedi çözümleri hazırlamak için 0,1-0,5 için ncAA dağıtılması M istimal 0,2-0,5 M NaOH. Ancak, bazı ncAAs 1 M HEPES (pH 7,4) dört birimler kullanımdan önce tarafından DMSO içinde ilk solubilization ve/veya nötralizasyon gerekebilir. Yaygın olarak, üretici bir hisse senedi çözüm hazırlamak için bir protokol önerir.
    2. Bir microcentrifuge tüp plazmid DNA muhabir plazmid DNA (pcDNA3.0-EGFP183TAG- mCherry) 1 µg ile test edilecek ncAARS/tRNA çifti için kodlama 1 µg karıştırın. Ayrı tüplerde EGFP vahşi-tür başvurusu kullanarak bir aynı transfection ve sahte bir transfection hazırlayın.
      Not: Plazmid ncAARS/tRNA çifti için kodlama içinde gömülü tRNA kaset kopyalarını uygulamaya bağlıdır. 4 kopya (kesinlikle gerekli de olsa) tavsiye edilir, ancak klonlama kolaylaştırmak için 1 tRNA kopya farklı tRNA, eleme önerilir zaman test farklı ncAARS veya aynı ortogonal çifti tarafından farklı ncAAs birleşme.
    3. Her tüp içeren DNA eklemek 100 µL laktat tamponlu tuz (LBS) 20 mM sodyum laktat pH 4.0 ve 150 mm NaCl içeren. Kısa bir süre karıştırın.
    4. Her tüpün içinde LBS 6 µL 1 µg/µL PEI eklemek LİBRE olarak DNA içeren (PEI/DNA oranı = 3/1 w/w) ve girdap hemen. RT 10-15 dk için kuluçkaya.
    5. Her kuyudan 400 µL cep orta alın ve pH nötralize etmek için DNA-PEI karışıma ekleyin. DNA karışımı hücreleri üzerine sür.
      Not: DMEM genellikle pH göstergesi olarak fenol red içerir. Nötralizasyon adımı sırasında kırmızı (nötr) sarı (asidik) tüp eklendi karışım rengini değiştirir. En yüksek transfection verimleri50DNA komplekslerinde LBS içinde şekillendirme asidik pH da, doğrudan pH 7,4 (örneğin DMEM) serum-Alerjik, DNA-PEI kompleksleri alternatif olarak oluşturulması mümkündür. DMEM form DNA komplekslerinde için kullanılıyorsa, 1.3.5 nötralizasyon adımı atlayın. Her durumda, hiçbir serum kompleksleri şekillendirme zaman karışımı mevcut esastır.
  4. Hücreleri 48 saat sonrası transfection hasat.
    1. Orta Aspire edin ve 2 mL Önceden ısıtılmış PBS (37 ° C) bir kez hücrelerle durulayın. 0,5 mM EDTA ile desteklenmiş PBS 800 µL ekleyin ve 37 ° C'de 20 dk için kuluçkaya Bağlantısını kesin ve hücreleri yukarı ve aşağı pipetting tarafından askıya alma.
    2. Hücre süspansiyon 5 mM MgCl2ile takıma 200 µL PBS içeren 1,5 mL tüpler içine aktarın.
    3. Vasıl 800 x g 2 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın.
      Not: Protokol burada duraklatılmış. Bu durumda, flash-granül sıvı N2 donma ve-80 ° C'de en fazla bir ay için saklayın. Her zaman göz koruma gözlük giymek.
  5. 100 µL Tris lizis arabellek ekleyin (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, % 1 Triton X-100, 1 mM EDTA ve taze ekledi PMSF) hücre topakları için ve 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya. Lizis, girdap her 5 dk kolaylaştırmak için.
  6. Spin aşağı 4 ° C ve 14.000 x g 10 min için hücre artıkları ve süpernatant ile 90 µL siyah 96-şey kalıplara transfer. EGFP ve mCherry floresan Floresans modülü ile donatılmış bir plaka okuyucu kullanarak ölçmek.
    Not: EGFP için uygun uyarma ve emisyon filtreleri kullanın (λabs: 488 nm; λem: 509 nm) ve mCherry (λabs: 588 nm; λem: 611 nm). Ölçüm EGFP değerleri genellikle vahşi tipli EGFP elde edilir bir maksimum değeri arasındaki sahte transfected hücrelerden elde edilen en düşük değer aralığı span. Alet içinde belgili tanımlık doğru ölçüm pencere kurma ilgilen.
  7. NcAA birleşme verimliliğini örnek Floresans ve vahşi-tipi EGFP ifadeden elde edilen floresan arasındaki oran olarak hesaplanır. Tüm değerleri mCherry floresan için normalleştirilmiş.
    figure-protocol-5242

2. genetik birleşmesiyle ncAAs GPCRs içine fotoğraf-çapraz eşleme, Ligand-GPCR etkileşimleri (şekil 3)

  1. % 10 (v/v) FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin 37 ° C, % 95 nem oranı ve % 5 CO2ile takıma DMEM hücrelerde HEK293T korumak.
  2. Tohum hücreleri transfection önceki gün.
    1. Hücreleri % 0.05 tripsin/PBS 0,5 mM EDTA ile desteklenmiş olarak 37 ° C'de 5 dakika ayır. 1 mL tripsin/EDTA 10 cm yemek için kullanın. Tam orta 10 birimleri ile gidermek ve hücreleri yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend. Hemasitometre49kullanarak süspansiyon hücreleri saymak.
    2. 6-iyi tabak 2 mL tam büyüme ortamda kuyuda başına tohum 5.0 x 105 293T hücre. Taranması her bir pozisyon için 1 de başına ligand artı bir şey için bağlama denetimi33,38hazırlayın. Ekstra bir şey ile vahşi-tipi (wt) reseptör transfected mutant ifade düzeyini kontrol edin dahil edilebilir.
  3. Bir gün sonra izdiham (alan hücreler tarafından işgal) mikroskop altında kontrol. % ~ 70 izdiham PEI kullanarak hücreleri transfect.
    1. 1 saat önce transfection, Polat son konsantrasyonu 0.5 mm bütün wells için ekleyin.
      1. Polat 0,5 M stok çözeltisi hazırlamak. 6-şey plaka, başına 1.2 mg Azi bir tüp içine tartmak ve 15 µL 0,5 M çözülür NaOH. 1.2 mL tam orta hisse senedi çözümde sulandırmak ve her şey için 200 µL karışımı ekleyin.
        Not: Her deneme için Hazi taze stok çözeltisi hazırlamak. Azid yan temel pH, özellikle de sulu çözümler içinde kısa bir yarı ömrü vardır ve AziRS olduğu gibi aynı zamanda bozulmuş form içerir.
    2. 2 µg DNA iyi başına toplam miktarı transfect: plazmid taşıyan bir etiket kodon istenen konuma ve plazmid Polat (E2AziRS51 ve 4 konağımız kopyalarını adanmış ortogonal çifti için kodlama 1 µg bayrak öğesini GPCR için kodlama 1 µg bastırıcı-tRNA BstYam)33,38.
      Not: Ne zaman bir wt karşılaştırma ifade düzeylerini denetlemek için de dahil olmak üzere, plazmid DNA wt reseptör için daha düşük bir miktarda transfect. Bağlı olarak GPCR 0,2-0,5 µg plazmid wt reseptör verim benzer düzeyde mutant plazmid 1.0 µg kodlama. DNA bütün Wells eksik DNA sahte (örneğin boş bir vektör) ile dolduruyor, aynı miktarda transfect.
    3. 1.3.3-1.3.5 içinde açıklandığı gibi devam edin.
    4. 48 saat sonrası transfection, ya da fotoğraf-ligandlar polietilenin için adım 2.4 ile devam ya da adım 2,5 doğrudan ürün toplama ve çözümleme reseptör ifade doğrulamak için gidin.
  4. Fotoğraf-ligand polietilenin.
    1. 1000 x ligand hisse senedi çözüm hazırlamak. Peptid ligand konsantrasyonu 100 µM DMSO, geçiyoruz.
      Not: Ligand konsantrasyonu ayrışma sabiti KD ligand-GPCR etkileşimin bağlıdır. Bir son 100 x KD tavsiye bölgedir. Peptid ligand bir tuz trifluoroacetic asit (TFA) ise, TFA ağırlığını molekül ağırlığı hesaplarken dikkate (1 x TFA başına peptid temel amino asit). Ayrıca, peptidler higroskopik genel olarak düşünün. Peptid tozu tekrar tekrar donma önlemek ve oda sıcaklığında ulaştı kadar bir peptid kapsayıcı açmayın.
    2. Ligand hisse senedi çözüm 1:1,000 % 0,1 BSA, % 0,01 oluşan bağlama arabellekte seyreltik Triton-X 100, 5 12,5 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES) içeren mM MgCl2 HEPES ayrılma arabelleği (HDB)-HCl pH 7.4, 140 mM NaCl ve 5 mM KCl. hazırlama Hazi-GPCR mutant başına 1 mL. Hücre orta 1 mL ligand çözeltisi ile değiştirin. 10 dakika dik, kuluçkaya
      Not: Ligand kinetik ve reseptör içselleştirilmesi için muhasebe belirli GPCR kuluçka süresi ayarlayın. Kuluçka süresi uzatan crosslinking verimleri artırmak değil.
    3. Örnekleri için bir UV crosslinker 365, içinde 20 dk ışınlatayım nm 5 x 8 W ile tüpler ve ~ 5 cm mesafe hücrelere. Pipetting tarafından hücreleri ayırmak ve 1,5 mL tepki tüp içine aktarabilirsiniz. Vasıl 800 x g 3 dk için hücreleri cips ve süpernatant atın.
    4. Proteaz inhibitörü (PI) 1 50 x hisse senedi çözüm yapmak mL 25 mM EDTA/H2O kokteyl bir tablet geçiyoruz. Aliquot PI çözüm stok ve -20 ° C'de saklayın 50 x hisse senedi 1:25 de HDB sulandırmak ve hücre topakları 2 50 µL içinde resuspend x PI HDB içinde. Flaş-sıvı N2hücrelerinde kıpırdama.
      Not: Göz koruma gözlük takıyorum. Bu noktada, örnekleri-80 ° C'de en fazla bir ay için saklanır. Adım 2.6 ile devam edin.
  5. Doğrudan hücre hasat.
    1. Orta Aspire edin. 0.5 mm EDTA 800 µL HDB içinde ekleyin. 10 dk RT veya buz üzerinde kuluçkaya.
    2. Hücreleri yukarı ve aşağı pipetting tarafından ayırmak ve 1,5 mL tepki tüp içine aktarabilirsiniz. 5 mM MgCl2 200 µL HDB içinde ekleyin. Vasıl 800 x g 3 dk için hücreleri cips ve süpernatant atın.
    3. Hücre topakları 2 50 µL içinde resuspend x PI HDB ve sıvı N2flaş donma. Göz koruma gözlük takıyorum.
      Not: Bu noktada, örnekleri-80 ° C'de 1 ay boyunca saklanır.
  6. Hücre lizis.
    1. 30-45 s ve girdap için 37 ° C'de bir su banyosu hücrelerde kısaca çözülme. Örnekleri şu andan itibaren soğuk tutmak. Pelet membranlar 2500 x g ve 4 ° C'de 10 dakika süreyle, toplu sitozolik protein içeren süpernatant, atın.
    2. Granül 50 µL HEPES lizis arabelleği 50 mM HEPES-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, % 10 gliserol, %1 Triton X-100, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT ve taze ekledi 2 x PI kokteyl içeren resuspend. İyice karıştırın. Buz ve girdap her 5 dk 30 dk hücreleri parçalayıcı.
    3. Spin aşağı 10 dk az 14.000 x g ve 4 ° c için hücre artıkları Hemen süpernatant temiz tepki tüp aktarın.
      Not: Analizi ile hemen devam edin. Lysates-20 ° C'de depolanabilir, ancak, her donma-çözülme döngüsü sonuçları kalitesini bozar.
  7. Western blot analizi.
    1. Örnek hazırlamak, 3-5 µL lysate almak ve ilâ doldurmak 7 H2o 2 eklemek µL 1 M DTT ile µL ve 63 mM Tris-HCl pH 6.8, % 2 SDS, % 10 gliserol ve %0,04 bromphenol içeren 3 µL 4 x örnek arabellek mavi. 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
    2. GPCR glikozile ve zayıf veya lekeli bantları ne zaman bir sorun, deglycosylate örnekleri PNGase sinyal yoğunluğu artırmak ve bantları keskinleştirmek için F ile vardır. 3-5 µL lysate ve deglycosylate toplam hacmi 10 µL tedarikçinin protokol sonrası içinde kullanın. Örnek arabellek x 3 µL 4 ekleyin.
      Not: Membran proteinlerinin SDS-sayfa analizi de çözüm kalitesini azaltır glikozile birden fazla siteleri ve Birleşik, çoğu kez. Her nasıl, değil deglycosylate örnekleri tam olarak glikozile hücre yüzeyinde olgun reseptör bölümünü değerlendirmek ilgili olduğu için anti-bayrak antikorları kullanarak Hazi-GPCR mutantlar ifade düzeyini analiz için yapmak.
    3. Örnekleri Standart SDS-sayfası üzerinden gidermek ve PVDF membran transfer protein leke.
      Uyarı: Akrilamid sinir hücrelerini tahrip eder. Eldiven ve göz koruma giymek.
    4. RT, 1 h veya gecede %5 yağsız süt TBS-T içeren 20 mM Tris-HCl pH 7.4, içinde 4 ° C'de membran engellemek 0.15 M NaCl ve % 0.1 ara 20.
    5. HRP-Birleşik ikincil antikor tarafından takip bir anti-ligand antikor ile membran sonda. Arada TBS-T. ile yıkayın Polat-GPCR ifade düzeyini tespit için membran ile ticari HRP antikor araştırması ( Tablo malzemelerigörmek).
    6. Ev yapımı ECL reaktif kullanarak gelişmiş Kemiluminesan (ECL) reaksiyonu gerçekleştirmek ve karanlıkta 5 min için sinyalleri algılayabilir.

3. ultrafast Bioorthogonal GPCRs canlı memeli hücrelerde etiketlerine göre

Not: Protokol 4-şey odacıklı coverslips için optimize edilmiştir (iyi alan 2,2 cm2=). Farklı iyi boyutları için protokol buna göre ölçekli olmalıdır.

  1. Yüzey kaplama mikroskop slayt. Steril bir başlık altında tüm prosedürü yerine getirir.
    1. Poli-D-lizin hydrobromide hazırlamak (MW = 500-550 kDa) (PDL) hisse senedi çözüm konsantrasyonu 1 mg/mL 50 mM Bor arabelleği (pH 8,5). 4 ° C'de 6 aya kadar saklayın. Dondurma değil.
    2. PDL hisse senedi çözüm 1:40 25 µg/mL (çalışma çözüm) son bir konsantrasyon için steril ultra-saf suda sulandırmak, sonra çözüm 0,22 µm steril filtre ile filtre.
      Not: Çalışma çözüm 4 ° C'de 3 aya kadar saklanabilir.
    3. Tam olarak kuyunun her mikroskobu slaydın 500 µL PDL çalışma çözüm ile kapak. RT, 20 dk için kuluçkaya ve PDL çalışma çözüm Aspire edin.
      Not: PDL çalışma çözüm en fazla üç kez kullanılabilir. Çözüm yeniden alması gerekiyorsa, kullanılan çözüm için taze bir steril tüp kaplamalı slaytlardan aktarmak ve buna göre tüp etiket. Asla taze çözüm ile geri dönüşümlü çözüm karışımı.
    4. Her şey 3 x ile durulayın ~ 700 µl steril ultra saf su ve izin en az 1 h için kuru.
      Not: Artıkları PDL çözüm hücrelere zehirli olduğu gibi doğru bir şekilde kuyuları durulama çok önemlidir. Hemen mikroskopi için kullanılan veya bir hafta 4 ° C'de depolanan kaplamalı slaytlar
  2. % 10 (v/v) FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin 37 ° C, % 95 nem oranı ve % 5 CO2ile takıma DMEM hücrelerde HEK293T korumak.
  3. Tohum hücreleri transfection önceki gün.
    1. Hücreleri % 0.05 tripsin/PBS 0,5 mM EDTA ile desteklenmiş olarak 37 ° C'de 5 dakika ayır. 1 mL tripsin/EDTA 10 cm yemek için kullanın. Tam orta 10 birimleri ile gidermek ve hücreleri pipetting tarafından resuspend. Hemasitometre49kullanarak süspansiyon hücreleri saymak.
    2. İyi başına tohum 1.0 x 105 HEK293T hücreleri (alan 2.2 cm²) 600 µL boya ücretsiz tam DMEM.
      Not: Görüntüleme amaçları için başlangıçta herhangi bir boya içermeyen bir ortamda çalışmak çok uygun. Boya ücretsiz DMEM formülasyonları ticari olarak kullanılabilir.
  4. İzdiham (alan hücreler tarafından işgal) mikroskop altında kontrol etmek ve hücrelerin lipid tabanlı transfection reaktif kullanarak ~ %70 izdiham, transfect.
    1. 1 saat önce transfection, toplam sahip olma maliyeti taze 100 mM stok çözeltisi hazırlamak * K 0.2 M NaOH ve % 15 (v/v) DMSO.
    2. Şey, toplam sahip olma maliyeti 3 µl mix * 1 M HEPES pH 7.4 12 µL K hisse senedi çözümle. Yavaşça çözüm için son bir TCO wells için ekleyin * K konsantrasyonu 0.5 mm.
    3. 500 ng DNA iyi başına toplam miktarı hazırlayın. Bir microcentrifuge tüpte 200 seyreltik pcDNA3.1_CRF1R ng-95TAG-EGFP, 200 MbPylRSAF/tRNA içinPyl ortogonal çifti kodlama plazmid ng (tRNA dört kasetM15) ve 100 pcDNA3.1_Arrestin3 ng Plazmid 50 µL orta (boya ücretsiz, serum-ücretsiz, antibiyotik ücretsiz).
      Not: Genel olarak, eş transfection Arrestin GPCR içselleştirilmesi gözlemlemek gerekli değildir. Ancak, ortak transfecting Arrestin3 CRF1R, içselleştirilmesi kadar birçok mutantlar içselleştirilmesi analiz ederken çok uygun olduğu hızlandırır.
    4. Transfection lipid-esaslı reaktif (1 µg DNA'ın başına 2.5 µL) 1,25 µL 50 µL orta (boya ücretsiz, serum-ücretsiz, antibiyotik ücretsiz) sulandırmak ve çözüm DNA karışıma ekleyin. Girdap hemen ve 5-10dk RT. Ekle DNA-lipid kompleksleri hücrelere, kuluçkaya.
      Not: Deneyim, hücre transfected göre lipid tabanlı transfection görünüyor daha fizyolojik PEI ile kullanarak hücre morfolojisi transfected. PEI daha yüksek transfection verim verir gibi lipid tabanlı transfection deneyler görüntüleme için hücreleri transfect için daha iyi bir seçimdir, ancak PEI gibi Western blot, aşağı akım uygulamalar için tercih edilmelidir.
  5. 24 saat sonrası transfection, etiket reseptör floresan boyalar ile.
    1. 0,5 mM boya-tetrazine hisse senedi ve bir çözüm DMSO 10 mg/mL ultra-saf H2' O. boya stok çözüm boyama DNA'ın hazırlamak
    2. 100 µL orta her kuyudan 1,5 mL tepki tüp içine aktarın. Boya-tetrazine hisse senedi çözüm 1.8 µL ve boya stok çözüm boyama DNA'ın 0.3 µL ekleyin. İyi başa boya içeren orta aktarmak ve 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya
      Not: Tetrazine-turuncu-floresan boya 1,5 µM son bir konsantrasyonu vardır.
    3. Orta Aspire edin ve yavaşça iki kez PBS boya aşırı kaldırmak için hücrelerle durulayın. Tam boya ücretsiz büyüme orta ısıtılmış 600 µL 37 ° C'ye Ekle
  6. Floresans mikroskobu ve reseptör içselleştirilmesi.
    1. Küçük 63 x (veya benzer) etiketli reseptörleri görselleştirmek GFP için uygun filtreler kullanarak büyütme (λabs: 488 nm; λem: 509 nm), portakal-floresan boya (λabs: 550 nm; λem: 570 nm) ve DNA boya (λ boyama ABS: 350 nm; λem: 461 nm). Reseptör etkinleştirmeden önce her filtre ile bir fotoğraf çekin.
    2. Reseptör içselleştirilmesi 200 kullanarak teşvik Ucn1 nM.
      1. 200 µM DMSO 1.000 x Ucn1 stok çözeltisi hazırlamak.
        Not: Peptid çözünürlük bağlı olarak saf su veya arabellek stokta hazırlamak mümkün olabilir.
      2. 100 µL orta bir kuyudan 1,5 mL tepki tüp içine aktarmak ve peptid agonist hisse senedi çözüm 0.6 µL ekleyin. Orta geri kuyunun içine aktarın.
      3. Mikroskop altında içselleştirilmesi gözlemlemek. İçselleştirilmesi (reseptör ve Arrestins overexpression bağlı olarak saat 10-15 dk) açıkça tespit bir hafta sonra fotoğraf çekmek daha önce bahsedilen filtreleri kullanarak.

Sonuçlar

Floresans tahlil anahat şekil 1' de tasvir edilir. Tahlil üç uygulamalarda istihdam edilmektedir. İlk etapta tRNA türevleri Lys(Boc) Pyl ortogonal çifti tarafından birleşme için bir dizi ekranlı. Lys(Boc) Pyl için sterically benzer bir amino asittir. Pyl ticari olarak mevcut olmadığı gibi Lys(Boc) standart bir substrat PylRS için yaygın olarak kullanılır. Filtrelenmiş tRNA tRNA üzerinde temel alanPyl. Her tRNA değişken tek üs...

Tartışmalar

Protokol ncAAs birleşme memeli hücrelerinde proteinlerin içine dik çiftleri verimliliğini değerlendirmek için basit ve güvenilir bir tahlil açıklar. Bu yöntem yaygın olarak kullanılan deneyleri FACS üzerinde dayalı açısından büyük avantajı bu eşzamanlı hazırlanması ve örnekleri daha büyük sayıda ölçüm sağlar ve kolayca sıradan bir yazılım kullanılarak analiz veri sağlar olduğunu. Dik memeli hücreleri çiftinde analiz etmek için bir orta-den geçerek yöntem kullanılabilirliği me...

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çakışma olmadığını bildirmek için var.

Teşekkürler

Bu eser tarafından Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) hibe CO822/2-1 (Emmy Noether programı) ve CO822/3-1 için araç ten altında kurulan

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1)Carl Roth3029.1
Ammonium persulfate (APS)Carl Roth9592.2
p-Azidophenylalanine (Azi)BachemF-3075.0001
Boric acidSigma AldrichB6768
BromphenolblueSigma-AldrichB0126-25G
Bovine serum albumine (BSA)Carl Roth8076.2
Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z))NovaBiochem8540430100
Cyclooctyne-L-lysine (SCOK)SichemSC-8000
DMEMLife Technologies41966052
DMSOCarl RothA994.2
DTTCarl Roth6908.1
enhanced chemiluminescence reagent (ECL) home-made10 mg/l luminol in 0.1 M Tris-HCl pH 8.6 ; 1100 mg/l  p-coumaric acid in DMSO ; 30 % H2O2 (1,000 : 100 : 0.3)
EDTACarl Roth8043.1
EGTACarl Roth3054.1
endo-bicyclo[6.1.0]nonyne-L-lysine (BCNK)SichemSC-8014
FBSThermo Fisher (Gibco)10270106
FluoroBrite DMEMThermo Fisher (Gibco)A1896701
GlycerolCarl Roth7533.1
GlycinCarl Roth3908.3
HEPESCarl Roth9105.3
Hoechst 33342Sigma AldrichB2261
KClCarl Roth6781.3
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher11668019
LuminolApplichemA2185,0005
MethanolCarl Roth0082.3
MgCl2Carl Roth2189.2
NaClCarl RothHN00.2
Na-LactateSigma-Aldrich71718-10G
NaOHGrüssing121551000
PBSSigma-AldrichP5493-1L
p-Coumaric acidSigma-AldrichC9008-1G
poly-D-lysine hydrobromideCorning354210
PEIPolysciences23966
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher (Gibco)11548876 (15140-122)
PMSFCarl Roth6367.1
PNGase FNEBP0704L
Protease InhibitorRoche11873580001
PVDF membrane Immobilon-PMilliporeIPVH00010
Skim Milk Powder Sigma70166
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Carl RothCN30.2
Tetrazine-Cy3Jena BioscienceCLK-014-05
Tetramethylethylenediamine (TEMED)Carl Roth2367.3
trans-Cyclooctene-L-lysine (TCO*K)SichemSC-8008
TRISSigma-AldrichT1503
Triton X-100Carl Roth3051.4
Trypsin 2.5%Thermo Fisher (Gibco)15090046
Tween 20Carl Roth9127.2
Wasserstoffperoxid (30%)Merck1.07210.0250
Cell lines
HEK293 cellsGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)ACC-305
HEK293T cellsGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)ACC-635
Equipment
Crosslinker Bio-Link 365 nmBio-Budget Technologies GmbH40-BLX-E3655 x 8 Watt tubes
Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega BMG LABTECH
Plasmids
Plasmid E2AziRSThe huminized gene for E2AziRS was synthesized by Geneart (Life Technologies)Plasmid containing 4 tandem copies of the suppressor tRNA Bst-Yam driven by the human U6 promoter and one copy of a humanized gene for the enhanced variant of the Azi-tRNA synthetase (EAziRS) driven by a PGK promoter
POI-TAG mutant plasmidsPlasmid encoding the POI driven by the CMV promoter, C-terminally fused to the FLAG-tag, bearing a TAG codon at the desired position 
CRF1R-95TAG-EGFPCloned in the MCS of pcDNA3.1
HA-PTH1R-79TAG-CFPCloned in the MCS of pcDNA3.1
Arrestin3-FLAGSynthesized by Genart (Life Technologies)Cloned in the MCS of pcDNA3.1
Antibodies
Anti-FLAG-HRP M2 antibody conjugate Sigma-AldrichA8592 monoclonal, produced in mouse clone M2
Goat-anti-rabbit-HRP antibodySanta Cruzsc-2004
Rabbit-anti-CRF antibodyhome-madePBL #rC69polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)
Rabbit-anti-Ucn1 antibodyhome-madePBL #5779polyclonal
Turnbull, A.V., Vaughan, J., Rivier, J.E., and Vale, W.W. Endocrinology, 140, (1), 71-78 (1999)

Referanslar

  1. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  2. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  3. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  4. Wang, L. Genetically encoding new bioreactivity. N Biotechnol. 38 (Pt A), 16-25 (2017).
  5. Zhang, M., et al. A genetically incorporated crosslinker reveals chaperone cooperation in acid resistance. Nat Chem Biol. 7 (10), 671-677 (2011).
  6. Wu, N., Deiters, A., Cropp, T. A., King, D., Schultz, P. G. A genetically encoded photocaged amino acid. Journal of the American Chemical Society. 126 (44), 14306-14307 (2004).
  7. Gautier, A., et al. Genetically encoded photocontrol of protein localization in mammalian cells. J Am Chem Soc. 132 (12), 4086-4088 (2010).
  8. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  9. Luo, J., et al. Genetically encoded optochemical probes for simultaneous fluorescence reporting and light activation of protein function with two-photon excitation. J Am Chem Soc. 136 (44), 15551-15558 (2014).
  10. Bose, M., Groff, D., Xie, J., Brustad, E., Schultz, P. G. The incorporation of a photoisomerizable amino acid into proteins in E. coli. J Am Chem Soc. 128 (2), 388-389 (2006).
  11. Hoppmann, C., et al. Genetically Encoding Photoswitchable Click Amino Acids in Escherichia coli and Mammalian Cells. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (15), 3932-3936 (2014).
  12. Borrmann, A., et al. Genetic encoding of a bicyclo[6.1.0]nonyne-charged amino acid enables fast cellular protein imaging by metal-free ligation. Chembiochem. 13 (14), 2094-2099 (2012).
  13. Nikic, I., et al. Minimal tags for rapid dual-color live-cell labeling and super-resolution microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 53 (8), 2245-2249 (2014).
  14. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  15. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  16. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal reaction. Nature Chemistry. 4 (4), 298-304 (2012).
  17. Lang, K., et al. Genetic Encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J Am Chem Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  18. Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
  19. Wang, J., Xie, J., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent amino acid. J Am Chem Soc. 128 (27), 8738-8739 (2006).
  20. Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
  21. Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
  22. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins. Nat Chem Biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  23. Nguyen, D. P., Garcia Alai, M. M., Kapadnis, P. B., Neumann, H., Chin, J. W. Genetically encoding N(epsilon)-methyl-L-lysine in recombinant histones. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14194-14195 (2009).
  24. Hoppmann, C., et al. Site-specific incorporation of phosphotyrosine using an expanded genetic code. Nat Chem Biol. 13 (8), 842-844 (2017).
  25. Schmidt, M. J., Borbas, J., Drescher, M., Summerer, D. A genetically encoded spin label for electron paramagnetic resonance distance measurements. J Am Chem Soc. 136 (4), 1238-1241 (2014).
  26. Chin, J. W., et al. An expanded eukaryotic genetic code. Science. 301 (5635), 964-967 (2003).
  27. Sakamoto, K., et al. Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4692-4699 (2002).
  28. Lemke, E. A., Summerer, D., Geierstanger, B. H., Brittain, S. M., Schultz, P. G. Control of protein phosphorylation with a genetically encoded photocaged amino acid. Nat Chem Biol. 3 (12), 769-772 (2007).
  29. Serfling, R., Coin, I. Incorporation of Unnatural Amino Acids into Proteins Expressed in Mammalian Cells. Methods Enzymol. 580, 89-107 (2016).
  30. Serfling, R., et al. Designer tRNAs for efficient incorporation of non-canonical amino acids by the pyrrolysine system in mammalian cells. Nucleic Acids Res. , (2017).
  31. Wang, W. Y., et al. Genetically encoding unnatural amino acids for cellular and neuronal studies. Nature Neuroscience. 10 (8), 1063-1072 (2007).
  32. Chatterjee, A., Xiao, H., Bollong, M., Ai, H. W., Schultz, P. G. Efficient viral delivery system for unnatural amino acid mutagenesis in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11803-11808 (2013).
  33. Coin, I., et al. Genetically encoded chemical probes in cells reveal the binding path of urocortin-I to CRF class B GPCR. Cell. 155 (6), 1258-1269 (2013).
  34. Coin, I., Perrin, M. H., Vale, W. W., Wang, L. Photo-Cross-Linkers Incorporated into G-Protein-Coupled Receptors in Mammalian Cells: A Ligand Comparison. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 8077-8081 (2011).
  35. Ye, S., et al. Tracking G-protein-coupled receptor activation using genetically encoded infrared probes. Nature. 464 (7293), 1386-1389 (2010).
  36. Damian, M., et al. Ghrelin receptor conformational dynamics regulate the transition from a preassembled to an active receptor:Gq complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (5), 1601-1606 (2015).
  37. Tian, H., Furstenberg, A., Huber, T. Labeling and Single-Molecule Methods To Monitor G Protein-Coupled Receptor Dynamics. Chem Rev. 117 (1), 186-245 (2017).
  38. Seidel, L., Zarzycka, B., Zaidi, S. A., Katritch, V., Coin, I. Structural insight into the activation of a class B G-protein-coupled receptor by peptide hormones in live human cells. Elife. 6, (2017).
  39. Grunbeck, A., et al. Genetically encoded photo-cross-linkers map the binding site of an allosteric drug on a G protein-coupled receptor. ACS Chem Biol. 7 (6), 967-972 (2012).
  40. Koole, C., et al. Genetically encoded photocross-linkers determine the biological binding site of exendin-4 peptide in the N-terminal domain of the intact human glucagon-like peptide-1 receptor (GLP-1R). J Biol Chem. 292 (17), 7131-7144 (2017).
  41. Rannversson, H., et al. Genetically encoded photocrosslinkers locate the high-affinity binding site of antidepressant drugs in the human serotonin transporter. Nat Commun. 7, 11261 (2016).
  42. Valentin-Hansen, L., et al. Mapping substance P binding sites on the neurokinin-1 receptor using genetic incorporation of a photoreactive amino acid. Journal of Biological Chemistry. 289 (26), 18045-18054 (2014).
  43. Nikic, I., Kang, J. H., Girona, G. E., Aramburu, I. V., Lemke, E. A. Labeling proteins on live mammalian cells using click chemistry. Nat Protoc. 10 (5), 780-791 (2015).
  44. Kaya, E., et al. A genetically encoded norbornene amino acid for the mild and selective modification of proteins in a copper-free click reaction. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (18), 4466-4469 (2012).
  45. Elliott, T. S., et al. Proteome labeling and protein identification in specific tissues and at specific developmental stages in an animal. Nature Biotechnology. 32 (5), 465-472 (2014).
  46. Yu, Z., Pan, Y., Wang, Z., Wang, J., Lin, Q. Genetically encoded cyclopropene directs rapid, photoclick-chemistry-mediated protein labeling in mammalian cells. Angew Chem Int Ed Engl. 51 (42), 10600-10604 (2012).
  47. Mayer, S., Lang, K. Tetrazines in Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Cycloadditions and Their Use in Biology. Synthesis-Stuttgart. 49 (4), 830-848 (2017).
  48. Lang, K., Davis, L., Chin, J. W. Genetic encoding of unnatural amino acids for labeling proteins. Methods Mol Biol. 1266, 217-228 (2015).
  49. Phelan, K., May, K. M. Basic techniques in mammalian cell tissue culture. Curr Protoc Cell Biol. 66, 1-22 (2015).
  50. Fukumoto, Y., et al. Cost-effective gene transfection by DNA compaction at pH 4.0 using acidified, long shelf-life polyethylenimine. Cytotechnology. 62 (1), 73-82 (2010).
  51. Takimoto, J. K., Adams, K. L., Xiang, Z., Wang, L. Improving orthogonal tRNA-synthetase recognition for efficient unnatural amino acid incorporation and application in mammalian cells. Mol Biosyst. 5 (9), 931-934 (2009).
  52. Nikic, I., et al. Debugging Eukaryotic Genetic Code Expansion for Site-Specific Click-PAINT Super-Resolution Microscopy. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (52), 16172-16176 (2016).
  53. Lykke-Andersen, S., Jensen, T. H. Nonsense-mediated mRNA decay: an intricate machinery that shapes transcriptomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 665-677 (2015).
  54. Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1. J Am Chem Soc. 136 (44), 15577-15583 (2014).
  55. Ye, S. X., et al. Site-specific incorporation of keto amino acids into functional G protein-coupled receptors using unnatural amino acid mutagenesis. Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1525-1533 (2008).
  56. Grunbeck, A., Huber, T., Sachdev, P., Sakmar, T. P. Mapping the ligand-binding site on a G protein-coupled receptor (GPCR) using genetically encoded photocrosslinkers. Biochemistry. 50 (17), 3411-3413 (2011).
  57. Grunbeck, A., Huber, T., Sakmar, T. P. Mapping a ligand binding site using genetically encoded photoactivatable crosslinkers. Methods Enzymol. 520, 307-322 (2013).
  58. Naganathan, S., Grunbeck, A., Tian, H., Huber, T., Sakmar, T. P. Genetically-encoded molecular probes to study G protein-coupled receptors. J Vis Exp. (79), (2013).
  59. Huber, T., Naganathan, S., Tian, H., Ye, S., Sakmar, T. P. Unnatural amino acid mutagenesis of GPCRs using amber codon suppression and bioorthogonal labeling. Methods Enzymol. 520, 281-305 (2013).
  60. Gronemeyer, T., Chidley, C., Juillerat, A., Heinis, C., Johnsson, K. Directed evolution of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase for applications in protein labeling. Protein Eng Des Sel. 19 (7), 309-316 (2006).
  61. Los, G. V., et al. HaloTag: a novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).
  62. Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281 (5374), 269-272 (1998).
  63. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: synthesis and biological applications. J Am Chem Soc. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  64. Hoffmann, C., et al. A FlAsH-based FRET approach to determine G protein-coupled receptor activation in living cells. Nature Methods. 2 (3), 171-176 (2005).
  65. Nuber, S., et al. beta-Arrestin biosensors reveal a rapid, receptor-dependent activation/deactivation cycle. Nature. 531 (7596), 661-664 (2016).
  66. Lee, M. H., et al. The conformational signature of beta-arrestin2 predicts its trafficking and signalling functions. Nature. 531 (7596), 665-668 (2016).
  67. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. J Am Chem Soc. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  68. Knorr, G., Kozma, E., Herner, A., Lemke, E. A., Kele, P. New Red-Emitting Tetrazine-Phenoxazine Fluorogenic Labels for Live-Cell Intracellular Bioorthogonal Labeling Schemes. Chemistry. 22 (26), 8972-8979 (2016).
  69. Park, M., Tian, H., Naganathan, S., Sakmar, T. P., Huber, T. Quantitative Multi-color Detection Strategies for Bioorthogonally Labeled GPCRs. Methods Mol Biol. 1335, 67-93 (2015).
  70. Tyagi, S., Lemke, E. A. Genetically encoded click chemistry for single-molecule FRET of proteins. Methods Cell Biol. 113, 169-187 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kimyasay 134Sigara kurall amino asit ncAAkehribar stop kodonu bast rmabirle me verimlili iortogonal amino asil tRNA sentetaz tRNA iftlerifoto raf apraz e lemeprotein ba lay c arabirimleribioorthogonal kimyaFloresans mikroskobu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır