JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz canlı hücrelerdeki karmaşık düzenleyici ve sinyal mekanizmaları incelemek soya önceki büyük miktarlarda hazırlanması için basit ve etkili iletişim kuralı geliştirilmiştir.

Özet

Soya (Glycine max (L.) Merr'e.) bir önemli bitki türü ve genetik ve biyokimyasal yolları araştırmalar baklagil modeli haline geldi. Bu nedenle, soya içinde bir verimli geçici gen ifade sistemi kurmak önemlidir. Burada, soya önceki hazırlanması için basit bir protokol ve geçici işlevsel analizleri için uygulama raporu. Bulduk soya fidan genç unifoliate yaprakları kaliteli önceki büyük miktarlarda sonuçlandı. PEG-kalsiyum-aracılı dönüşüm yöntemi optimize ederek, soya unifoliate önceki kullanarak yüksek dönüşüm verimliliği elde etti. Bu sistem etkin ve çok yönlü modeli karmaşık düzenleyici ve sinyal mekanizmaları incelenmesi canlı soya hücrelerdeki için sağlar ve Bakliyat çeşitli hücresel, gelişimsel ve fizyolojik süreçleri anlamak zorunda yardım için daha iyi.

Giriş

Önceki hücre duvarlarının kaldırılması içeren bitki hücreleri vardır. Onlar özelliklerin çoğunu ve bitki hücreleri faaliyetlerinin sürdürdükçe, önceki gözlemlemek ve çeşitli hücresel olaylar değerlendirmek için bir iyi model sistemi vardır ve somatik melezleştirme1 çalışma ve rejenerasyon2bitki değerli araçlardır. Hücre duvarları aksi halde DNA hücre içine geçişini engellemek istiyorsunuz bu yana önceki bitki dönüşümü3,4,5için aynı zamanda yaygın olarak kullanılan. Önceki bazı fizyolojik tepkilerin ve dolayısıyla hücre altı protein Yerelleştirme6,7,8çalışmaya temel araştırma temel değeri sunan sağlam bitkilerin hücresel süreçler sahip, protein-protein etkileşimleri9,10ve organizatörü etkinliği11,12,13 ' te hücreleri yaşıyor.

Bitki önceki yalıtım ilk 196014 ' te bildirildi ve protokolleri yalıtım ve önceki dönüşümü için geliştirilen ve en iyi duruma getirilmiş. Standart bir prosedür protoplast tecrit yaprakların kesme ve Enzimatik sindirim yayımlanan önceki ayrılması tarafından sindirilmiş sigara doku enkazı takip hücre duvarlarının içerir. Dönüşüm stratejileri elektroporasyon15,16, mikroenjeksiyon17,18ve polietilen glikol tabanlı (PEG)4,5,19 yöntemleri içerir. Türlerin geniş bildirilmiştir protoplast yalıtımı, narenciye20, Brassica21, Solanaceae22 ve diğer süs bitki aileler23,24gibi başarılı. Çeşitli doku tipleri çeşitli türler ise, Arabidopsis mesophyll işgal (TEAMP) geçici ifade Arabidopsis thaliana modeli bitki yapraklarından izole bir sistem iyi kurulmuş25 oldu ve çeşitli uygulamalar için yaygın olarak kabul edilen.

Soya (Glycine max (L.) Merr'e.) bir en önemli protein ve yağ26kırpar. Arabidopsis ve pirinç aksine, transgenik soya bitkiler elde etmek oldukça zor ve düşük verimlilik olduğu bilinmektedir. Agrobacterium tumefaciens-aracılı infiltrasyon halk kullanılan tütün27 ' deki epidermal hücrelerin ve fidan Arabidopsis28,29, geçici gen ifade araştırmaları için ise Agrobacterium rhizogenes kıllı soya30kökleri dönüştürme için kullanılmıştır. Virüs kaynaklı gene yaklaşımlar susturmak için hedef genlerin31,32 ve geçici ifade33 downregülasyon sistemik bir şekilde kullanılmıştır. Önceki bu yaklaşımlar için değerli ve çok yönlü bir alternatif sağlar. Önceki soya'nın yerüstü malzemelerden elde edilebilir ve hızlı ve senkronize transgene ifade sağlar. Ancak, soya önceki341983 yılından bu yana ilk başarılı yalıtım sınırlı rapor edilmiştir önceki soya35,36,37, ve uygulamaya 38, öncelikle soya önceki nispeten düşük verimleri nedeniyle.

Burada, soya önceki yalıtım için basit ve etkili iletişim kuralı ve uygulama geçici gen ifade Etütler açıklayın. Soya fidan genç unifoliate yaprakları kullanarak, biz büyük miktarda hayati önceki birkaç saat içinde elde edebildik. Buna ek olarak, basit ve düşük maliyetli DNA soya önceki yüksek verimlilik ile teslim etmek PEG-kalsiyum-aracılı dönüşüm yöntemi optimize.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. bitkilerin büyüme

  1. 5-10 soya tohumları (Williams 82) özel toprak karışımı üzerinde 25 ° c (16 h 1500 µmol m-2 s-1ışık) uzun günlük koşullarda sera içinde 13 cm tencerede soya için ekmek (1:1:1 oran toprak, perlit ve torpido kum).

2. plazmid DNA hazırlanması

  1. Steril pipet ucu veya kürdan kullanarak, bir koloni veya faiz gen içeren plazmid taşıyan E. coli donmuş gliserol hisse senedi almak ve 20 mL Luria-Bertani (LB) sıvı ortamda bir 50 mL şişe olarak uygun antibiyotik aşılamak.
  2. Gecede bir shaker olarak 37 ° C'de şişeye kuluçkaya. Bakteri süspansiyon 12.000 x g 5 min için oda sıcaklığında, centrifuging ve süpernatant atarak toplamak. Hulâsa ve plazmid hazırlık seti üreticinin prosedürü takip plazmid arındırmak.

3. protoplast yalıtım

  1. 10 - gün eski soya fidan (şekil 1) yeni genişletilmiş unifoliate yaprakları kesti.
    Not: Yaprakları uygun bir gelişimsel aşamada başarının anahtarı soya protoplast hazırlık için seçimdir. Sadece sadece genişletilmiş yaprakları aşamalarında erken gelişimsel kullanın. Olgun yaprakları, hücre duvarları daha zor sindirmek için hale gelir.
  2. Taze bir tıraş bıçağı ile midrib unifoliate yaprak ve kalıntıları içine 0,5-1 mm şeritler kes çıkarın.
    Not: iki unifoliate yaprakları 10 mL enzim çözümde sindirmek için 10'dan fazla dönüşümleri yeterli önceki verecektir.
  3. Forseps, transfer bir çift kullanarak yaprak 10 mL taze hazırlanmış enzim çözeltisi (Tablo 1) bir 15 mL tüp içine hemen ve yavaşça şeritler. Vakum infiltrat yaprak 15 dakika oda sıcaklığında şeritler.
  4. Yaprak şeritler ile nazik ajitasyon (40 d/d) düşük ışık altında oda sıcaklığında 4-6 h için enzim çözümde kuluçkaya. Önceki yayımlanan olarak enzim çözüm sarı-yeşil döner emin olun. Enzim/önceki çözüm (X10) mikroskop altında denetleyin.
    Not: Yayımlanan önceki küresel şeklinde, sindirilmemiş hücreler düzensiz veya oval şekli varken.
  5. Yavaşça dökerek enzim/protoplast çözüm bir 50 mL tüp 10 mL transfer ve hazım durdurmak için oda sıcaklığında 10 mL W5 çözeltisi (Tablo 1) ekleyin. Yavaşça tüp birkaç kez tersine çevirin. Yavaşça sindirilmemiş yaprak dokuları kaldırmak için 50 mL tüp üzerine yerleştirilen bir temiz 75 µm naylon mesh üzerinde enzim/önceki solüsyonu dökün.
  6. 100 x g oda sıcaklığında 1-2 dk 50 mL tüp, akışı sayesinde enzim/önceki çözüm santrifüj kapasitesi. Yavaşça protoplast Pelet bozmadan bir 10 mL serolojik pipet kullanarak süpernatant çıkarın.
  7. Önceki resuspend ve (x10) mikroskop altında bir hemacytometer numaralı protoplast sayarak 2 x 105 mL-1 4 ° C'de soğutulmuş W5 çözümde bir konsantrasyon sulandırmak. Önceki 30 dk için buz üzerinde tutun.
  8. 100 x g oda sıcaklığında 1-2 min için de süspansiyon santrifüj kapasitesi ve 1 mL pipet protoplast Pelet bozmadan kullanarak W5 çözüm yavaşça çıkarın. 2 x 105 mL-1 oda sıcaklığında bir konsantrasyon, MMG çözüm (Tablo 1) önceki resuspend.

4. protoplast dönüştürme

  1. 100 µL aliquots önceki (2 x 104 önceki vasıl 2 x 105 mL-1), 1.5 mL düşük yapışma microcentrifuge tüplere kesilmemiş 200 µL pipet ipuçlarını kullanarak olun. Negatif denetimi hizmet için bir aliquot bir kenara koyun. Plazmid (10-20 µg) 10 µL her önceki dinlenme aliquot içine ekleyin.
  2. Yavaş taze hazırlanmış PEG çözüm (Tablo 1) 110 µL 1.5 mL microcentrifuge tüp iç duvarında ekleyin ve sonra yavaşça tersine çevirin ve çözüm homojen hale gelinceye kadar tüp döndürün.
  3. Dönüştürme karışımı 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
  4. Dönüşümün durdurmak için yavaş yavaş 1,5 mL tüp, oda sıcaklığında 400 µL W5 çözüm ekleyin ve çözüm homojen hale gelinceye kadar tüpü yavaşça tersine çevirin. Tüp 100 gr oda sıcaklığında 1-2 min için santrifüj kapasitesi ve bir pipet kullanarak süpernatant atın.
  5. WI çözüm (Tablo 1) 1 mL tüp ekleyin ve hafifçe 1 - 2 defa pipetting tarafından resuspend. 1 mL % 5 (vol/vol) steril buzağı serum her şey yüzey kat ve önceki plakasına yapışmasını önlemek için 6-iyi doku kültürü plaka ekleyin.
  6. Birkaç saniye sonra bir pipet kullanarak buzağı serum atmak. Resuspended önceki kültür plaka bir kuyunun içine aktarın. Bir kapak ile plaka kapak.

5. protoplast kuluçka ve hasat

  1. 1-2 gün içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında önceki kuluçkaya.
    Not: Bulduğumuz iki günde kuluçka genel olarak bir günlük kuluçka için karşılaştırıldığında güçlü floresan protein sinyali verir ve floresan protein sinyal 3-4 güne kadar sürebilir.
  2. Protoplast çözüm 1.5 mL düşük yapışma microcentrifuge tüp aktarın. Önceki hasat için oda sıcaklığında 1-2 min için 100 x g de tüp santrifüj kapasitesi. Bir pipet kullanarak süpernatant kaldırmak ve 10 µL önceki bir cam slayt üzerine aktarın.
  3. Floresan veya confocal mikroskobu altında floresan sinyal gözlemlemek. Sigara dönüştürülmüş önceki (sinyal yok dikkat edilmelidir) negatif kontrol kullanın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

10 - gün eski soya fasulyesi farklı organları işgal hazırlık (şekil 1) için test edildi ve verimleri (Şekil 2) mikroskop altında gözlendi. Hücre duvarları hypocotyl ve epicotyl zor sindirmek ve bazı hücreler birbirine (2B şekil, 2 C) bağlı kaldı. Cotyledon (şekil 2B) ve kök (şekil 2A), hücre duvarları...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu iletişim kuralı soya önceki ve geçici ifade çalışmaları uygulama yalıtım için kapsamlı biçimde sınanmış ve çok iyi bizim laboratuarında çalışıyor. Yordamlar basit ve kolay ve sıradan ekipman ve minimum maliyet gerektirir. Bizim protokol Tekdüzen, yüksek kaliteli önceki daha önce bildirilen yöntemler34,35,36,37,38için karşılaş...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Teşekkürler

Bu eser bitki genom araştırma programı Ulusal Bilim Vakfı (NSF-PGRP-IOS-1339388) tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
MESSigma AldrichM8250-100G
Cellulase CELFWorthington Biological CorporationLS002611
Pectolyase Y-23BioWorld9033-35-6
CELLULASE "ONOZUKA" R-10yakult10g
MACEROZYME R-10yakult10g
MannitolICN Biomedicals152540
CaCl2FisherC79-500g
BSANEBR3535S
DTTSigma AldrichD5545-5G
NaClSigma AldrichS7653-1kg
KClFisherP217-500g
MgCl2Sigma AldrichM8266-100g
PEG4000Fluka81240
nylon meshcarolina652222N
Tissue Culture PlatesUSA ScientificCC7682-7506
Razor BladesFisher12-640
hemacytometerhausserscientific1483
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27104
EZNA plasmid miniprep kitOmegaD6942-01
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermo ScientificK0502
Centrifuge 5810eppendorf5811000827
Centrifuge 5424eppendorf22620401
Jencons Powerpette Plus Pipet ControllerJencons14526-202
Zeiss 710 Confocal MicroscopeZeissN/A
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mLAmbionAM12450
15 mL Centrifuge TubesDenvilleC1018-P
50 mL Centrifuge TubesDenvilleC1060-P
Newborn Calf SerumThermo Scientific16010159
SoilIngram's Nursery
perliteVigoro100521091
Torpedo SandJKS Ventures
LB Broth, Lennox (Powder)FisherBP1427-500

Referanslar

  1. Melchers, G., Labib, G. Somatic hybridisation of plants by fusion of protoplasts. Mol. Gen. Genet. 135 (4), 277-294 (1974).
  2. Gresshoff, P. M. In vitro culture of white clover: callus, suspension, protoplast culture, and plant regeneration. Bot. Gaz. 141 (2), 157-164 (1980).
  3. Lörz, H., Baker, B., Schell, J. Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation. Mol. Gen. Genet. 199 (2), 178-182 (1985).
  4. Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
  5. Koop, H. -U., et al. Integration of foreign sequences into the tobacco plastome via polyethylene glycol-mediated protoplast transformation. Planta. 199 (2), 193-201 (1996).
  6. Hrazdina, G., Wagner, G. J., Siegelman, H. W. Subcellular localization of enzymes of anthocyanin biosynthesis in protoplasts. Phytochemistry. 17 (1), 53-56 (1978).
  7. Lin, W., Wittenbach, V. A. Subcellular localization of proteases in wheat and corn mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 67 (5), 969-972 (1981).
  8. Vögeli-Lange, R., Wagner, G. J. Subcellular localization of cadmium and cadmium-binding peptides in tobacco leaves. Plant Physiol. 92 (4), 1086-1093 (1990).
  9. Chen, S., et al. A highly efficient transient protoplast system for analyzing defence gene expression and protein-protein interactions in rice. Mol. Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).
  10. Wu, F. -H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich-a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant methods. 5 (1), 16(2009).
  11. Christensen, A. H., Sharrock, R. A., Quail, P. H. Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mol. Biol. 18 (4), 675-689 (1992).
  12. Marcotte, W. R., Bayley, C. C., Quatrano, R. S. Regulation of a wheat promoter by abscisic acid in rice protoplasts. Nature. 335 (6189), 454-457 (1988).
  13. Dron, M., Clouse, S. D., Dixon, R. A., Lawton, M. A., Lamb, C. J. Glutathione and fungal elicitor regulation of a plant defense gene promoter in electroporated protoplasts. P. Natl. A. Sci. USA. 85 (18), 6738-6742 (1988).
  14. Cocking, E. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles. Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).
  15. Zhang, H., et al. Transgenic rice plants produced by electroporation-mediated plasmid uptake into protoplasts. Plant Cell Rep. 7 (6), 379-384 (1988).
  16. Fromm, M., Taylor, L. P., Walbot, V. Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. P. Natl. A. Sci. USA. 82 (17), 5824-5828 (1985).
  17. Crossway, A., et al. Integration of foreign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts. Mol. Gen. Genet. 202 (2), 179-185 (1986).
  18. Holm, P. B., Olsen, O., Schnorf, M., Brinch-Pedersen, H., Knudsen, S. Transformation of barley by microinjection into isolated zygote protoplasts. Transgenic Res. 9 (1), 21-32 (2000).
  19. Schapire, A. L., Lois, L. M. A simplified and rapid method for the isolation and transfection of Arabidopsis leaf mesophyll protoplasts for large-scale applications. Plant Signal Transduction: Methods and Protocols. 1363, 79-88 (2016).
  20. Niedz, R. P. Regeneration of somatic embryos from sweet orange (C. sinensis) protoplasts using semi-permeable membranes. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 84 (3), 353-357 (2006).
  21. Sheng, X., et al. Protoplast isolation and plant regeneration of different doubled haploid lines of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis). Plant Cell Tiss. Org. 107 (3), 513-520 (2011).
  22. Grun, P., Chu, L. -J. Development of plants from protoplasts of Solanum (Solanaceae). Am. J. Bot. 65 (5), 538-543 (1978).
  23. Davey, M. R., Anthony, P., Power, J. B., Lowe, K. C. Plant protoplasts: status and biotechnological perspectives. Biotechnol. Adv. 23 (2), 131-171 (2005).
  24. Pitzschke, A., Persak, H. Poinsettia protoplasts-a simple, robust and efficient system for transient gene expression studies. Plant methods. 8 (1), 14(2012).
  25. Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565(2007).
  26. Sedivy, E. J., Wu, F., Hanzawa, Y. Soybean domestication: the origin, genetic architecture and molecular bases. New Phytol. 214 (2), 539-553 (2017).
  27. Yang, Y., Li, R., Qi, M. In vivo analysis of plant promoters and transcription factors by agroinfiltration of tobacco leaves. Plant J. 22 (6), 543-551 (2000).
  28. Marion, J., et al. Systematic analysis of protein subcellular localization and interaction using high-throughput transient transformation of Arabidopsis seedlings. Plant J. 56 (1), 169-179 (2008).
  29. Wu, H. -Y., et al. AGROBEST: an efficient Agrobacterium-mediated transient expression method for versatile gene function analyses in Arabidopsis seedlings. Plant methods. 10 (1), 19(2014).
  30. Govindarajulu, M., Elmore, J. M., Fester, T., Taylor, C. G. Evaluation of constitutive viral promoters in transgenic soybean roots and nodules. Mol Plant Pathol. 21 (8), 1027-1035 (2008).
  31. Nagamatsu, A., et al. Functional analysis of soybean genes involved in flavonoid biosynthesis by virus-induced gene silencing. Plant Biotechnol. J. 5 (6), 778-790 (2007).
  32. Juvale, P. S., et al. Temporal and spatial Bean pod mottle virus-induced gene silencing in soybean. Mol. Plant Pathol. 13 (9), 1140-1148 (2012).
  33. Zhang, C., Bradshaw, J. D., Whitham, S. A., Hill, J. H. The development of an efficient multipurpose bean pod mottle virus viral vector set for foreign gene expression and RNA silencing. Plant Physiol. 153 (1), 52-65 (2010).
  34. Lin, W. Isolation of mesophyll protoplasts from mature leaves of soybeans. Plant Physiol. 73 (4), 1067-1069 (1983).
  35. Yi, J., et al. A single-repeat MYB transcription factor, GmMYB176, regulates CHS8 gene expression and affects isoflavonoid biosynthesis in soybean. Plant J. 62 (6), 1019-1034 (2010).
  36. Faria, J. A., et al. The NAC domain-containing protein, GmNAC6, is a downstream component of the ER stress-and osmotic stress-induced NRP-mediated cell-death signaling pathway. BMC Plant Biol. 11 (1), 129(2011).
  37. Kidokoro, S., et al. Soybean DREB1/CBF-type transcription factors function in heat and drought as well as cold stress-responsive gene expression. Plant J. 81 (3), 505-518 (2015).
  38. Sun, X., et al. Targeted mutagenesis in soybean using the CRISPR-Cas9 system. Sci Rep-UK. 5, 10342(2015).
  39. Karimi, M., Inzé, D., Depicker, A. GATEWAY™ vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation. Trends Plant Sci. 7 (5), 193-195 (2002).
  40. Xia, Z., et al. Positional cloning and characterization reveal the molecular basis for soybean maturity locus E1 that regulates photoperiodic flowering. P. Natl. A. Sci. USA. 109 (32), E2155-E2164 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

H cresel biyolojisoyasay 131Protoplast Glycine maxunifoliatege ici gen ekspresyonuprotein yerelle tirme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır