Jel-seq: DNA ve RNA hidrojel matrisleri kullanarak eşzamanlı sıralama kitaplığı hazırlanması için bir yöntem

Özet

Jel-seq kitaplıkları için her iki DNA - ve RNA-seq basit hidrojel aygıtı kullanarak 100-1000 hücreden başlayarak ihmal edilebilir ek maliyetle aynı anda hazırlamak araştırmacılar sağlar. Bu kağıt eşleştirilmiş kitaplıkları oluşturmak için biyolojik Protokolü yanı sıra cihazın imalatı için detaylı bir yaklaşım sunar.

Özet

Yükseltmek ve DNA veya RNA küçük başlangıç örnekleri sıra yeteneği sadece son beş yıl içinde elde edilmiştir. Ne yazık ki, genomik oluşturmadan veya transcriptomic kütüphaneler için standart protokolleri uyumsuzdur ve araştırmacılar DNA veya RNA belirli bir örnek için sıralamak seçmeniz gerekir. Jel-seq aynı anda DNA ve RNA bir basit hidrojel aygıtı kullanarak 100-1000 hücrelerle başlangıç için kitaplıklarına hazırlamak araştırmacılar sağlayarak bu sorunu çözer. Bu kağıt eşleştirilmiş kitaplıkları oluşturmak için biyolojik Protokolü yanı sıra cihazın imalatı için detaylı bir yaklaşım sunar. Biz jel-seq araştırmacılar tarafından kolayca uygulanabilecek tasarlanmıştır; birçok genetik labs zaten jel-seq cihaz imalat çoğaltmak gerekli donanımları var. Bizim iletişim kuralı her iki bütün-transkript amplifikasyon (WTA) için yaygın olarak kullanılan kitleri istihdam ve de zaten araştırmacılar için tanıdık olması olasıdır Kütüphane hazırlık kitaplıkları genomik üreten ve transcriptomic usta. Bizim yaklaşım araştırmacılar DNA ve RNA sıralama gücünü ihmal edilebilir maliyet ve yarma olmadan tek bir örnek üzerinde ayı getirmek için sağlar.

Giriş

Yeni nesil (NGS) sıralama genetik araştırma yaptı yolda derin bir etkiye sahip oldu. Araştırmacılar bir kez tüm türlerin genom sıralama üzerinde duruldu nerede, şimdi tek bir tümör veya bir deneyde bile tek bir hücre genomu sıralamak mümkündür. ¹ NGS, aynı zamanda maliyet etkin hücre, transcriptome bilinen veriler topluluğu içindeki bulundu RNA transkript sıralamak için sağlamıştır. Yükseltmek ve DNA veya RNA küçük başlangıç örnekleri sıra yeteneği sadece son beş yıl içinde elde edilmiştir. ^{2 , 3 , 4} ne yazık ki, standart protokolleri uyumsuzdur ve araştırmacılar DNA veya RNA belirli bir örnek için sıralamak seçmeniz gerekir. Başlangıç bir örnek yeterince büyük olduğunda, ikiye bölünebilir. Daha küçük ölçeklerde ancak, malzeme örnekleri bölme nedeniyle kaybı Kütüphane kalitesini etkileyebilir ve örnekleri havuzu hücreler arasında ilginç varyasyonlar dışarı ortalama olabilir. ⁵ Ayrıca, araştırmacılar, tek hücre veya küçük heterojen tümör biyopsi gibi bölünemez örnekleri inceleyerek giderek ilgilendi. ⁶

Bu sorunu çözmek için üç Protokolü son zamanlarda aynı başlangıç örneğinden DNA ve RNA sıralamak için geliştirilmiştir: jel-seq⁷, G & T-seq⁸ve DR-seq⁹. Bu makale aynı anda gelen önemsiz eklenen maliyet 100 hücreler olarak az DNA ve RNA kitaplıkları oluşturmak için kullanılan jel-seq için detaylı bir protokolü sunar. Roman jel-seq DNA ve RNA sadece düşük maliyetli hidrojel matrisleri kullanarak boyutuna göre ayırmak için yetenek yönüdür. RNA fiziksel ayrılması DNA'ın jel-Seq protokolünün çekirdek yeniliktir. Bu ayrılık electrophoretically bu moleküller arasındaki boyut farkları yararlanmak polyacrylamide membranlar kullanarak elde edilir. Bu boyut farkları bağlamda koymak için nasıl DNA ve RNA görüntüsü göz önünde bulundurun: DNA mikron ölçekte var ve geleneksel mikroskoplar kullanılarak görüntülenebilir, RNA nanometre ölçeğinde var ve cryo-elektron gibi karmaşık teknikleri kullanarak yansıma gerekir mikroskobu. ¹⁰

DNA ve RNA bu protokol için ayırmak için yaklaşım şekil 1' de gösterilen. Sol panelde çözüm bir membran yakın yüzen DNA ve RNA ücretsiz gösterir. Elektrik alan, sağ panelde gösterildiği gibi uygulandığında, DNA ve RNA membran aracılığıyla geçiş indükler bir elektroforetik güç deneyim. Membran özelliklerini ayarlama tarafından biz DNA RNA--dan ayıran yarı geçirgen bir zar oluşturduk. DNA molekülleri membran karşı itti ama kenarındaki büyük boyutlarından dolayı dolaşmış oldu. Küçük RNA molekülleri, öte yandan, yeniden yapılandırabilir ve membran yollarını örgü. Reptation bilinen bu işlem bir yılan çim hamle yol benzer. Sonunda bu RNA molekülleri daha küçük polimerler için çok zor bir ikinci, yüksek yoğunlukta membran tarafından durdurulur (> 200 baz çifti) aracılığıyla sıyrılmak için. Bir kez fiziksel olarak ayrılmış, DNA ve RNA getirilebilir kurtarıldı ve genom ve transcriptome hakkında bilgi oluşturmak için işlenmiş. DNA ve RNA ayırabilirsiniz, biz RNA cDNA ayırma önce transkripsiyonu ters ise daha iyi sonuçlar elde edilen bulduk. CDNA/RNA melez RNA yalnız daha stabildir ve hala düşük yoğunluklu membran geçebilir.

Resim 1 . Jel-seq çalışma prensibi. Fiziksel olarak DNA ve RNA ayırmak için kullanılan temel prensip. Uygulamalı elektrik alan, küçük RNA molekülleri düşük yoğunluklu membran geçiş ama büyük DNA molekülleri yüzeyde sıkışıp kalırlar. Bu rakam Ref. 7 Kimya Royal Society izniyle yeniden. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bu kağıt jel-seq cihazın her iki fabrikasyon ayrıntılı olarak açıklar ve DNA ve RNA kitaplıkları oluşturmak için biyolojik Protokolü eşleştirilmiş. Her ikisi de genel bir bakış Şekil 2' de gösterilmiştir. Cihazın katmanlama üç farklı yoğunluk polyacrylamide jeller üst üste çift yığın jelleri oluşturmaya benzer bir işlemde tarafından imal edilmiştir. ¹¹ biyolojik Protokolü PBS içinde askıya 100-1000 hücreleri ile başlar. Hücreleri lysed ve cihazın genomik DNA cDNA/RNA melez ayırmak için kullanılmadan önce RNA cDNA dönüştürülür. Ayrılık ve kurtarma, genomik ve transcriptomic sonra kitaplıkları standart bütün-genom kitaplığı hazırlık seti Protokolü yakından takip eden bir işlem kullanılarak hazırlanır. Geliştirme ve jel-seq doğrulama hakkında daha fazla ayrıntı üzerinde bir çip yayın laboratuarında okumak "jel-seq: Bütün-genom ve yarı geçirgen hidrojel engelleri kullanarak eşzamanlı düşük-girdili DNA ve RNA Kütüphane hazırlık tarafından transcriptome sıralama ." ⁷

Resim 2 . Jel-seq protokolü. Sonrasında tamamlanması jel-seq aygıt ve iletişim kuralı oluşturulan eşleştirilmiş DNA ve RNA kitaplıklarına imal etmek. Bu rakam bölümlerini Ref. 7 Kimya Royal Society izniyle çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

DNA ve RNA kitaplıkları tek hücreler üretmek için araştırmacılar G & T-seq ya da DR-devamı G & T-Seq, jel-seq gibi kullanmayı dikkate almanız gerekir, genomik DNA RNA'ın fiziksel bir renk kullanır. Bu yaklaşım mesajcı RNA üzerinde'nın (mRNA) dayanır 3'poliadenile kuyruk aşağı açılır hedef olarak. MRNA üzerinde bir manyetik boncuk biotinylated oligo-dT astar kullanarak yakalanır. MRNA yakalandıktan sonra boncuklar bir mıknatıs ile yerde tutulur ve genomik DNA içeren süpernatant kaldırıldı ve olması için başka bir tüp transfer. Bu fiziksel ayırma tamamlandıktan sonra mRNA ve DNA ayrı kütüphaneleri oluşturulabilir. ⁸ çalışan bu yaklaşım de ilgi RNA poliadenile ise, ancak bu poliadenile transkript, ribozomal RNA, tRNA veya RNA prokaryot üzerinden gibi çalışmak için kullanılamaz.

DR-seq DNA ve RNA türetilmiş cDNA aynı tüp nerede güçlendirilmiş bir öncesi amplifikasyon adım kullanır. Örnek sonra ikiye bölünmüş ve DNA ve RNA seq kütüphaneleri hazırlanmak için paralel olarak işlenebilir. Genomik DNA ve RNA türetilmiş cDNA arasındaki farkı anlamak, DR-seq Hesaplamalı bir yaklaşım. Bu DNA veya RNA kökenli gibi dizileri ekzonlar sadece mevcut nerede hesaplama açısından genomik DNA veri görüntülenmez. ⁹ cDNA/RNA ve DNA fiziksel olarak jel-seq ve G & T-seq. tamamlandý olarak ayrılması değil ki bu yaklaşımın bir avantajı olduğunu Dezavantaj, ancak, DR-seq genom ve transcriptome (Yani, ekzonlar intron karşı) bir temanın bilgi gerektirir ve çekirdekleri içinde birçok transkript henüz tam değildir, sıralama gibi uygulamalar için ideal olmayabilir olduğunu spliced ve hala intron içeriyor. ¹²

Roman jel-seq DNA ve RNA hücre sadece boyutuna göre yüzlerce ayırmak için yetenek yönüdür. Bu yöntem hiç bir priori bilgi genom veya transcriptome, eksik Uçbirleştirme karşı sağlamdır ve poli-adenylated transkript için sınırlı değildir gerektirir. Bir araştırmacı en az 100 hücrelerle başlayabileceğiniz uygulamalarda, jel-seq ucuz ve yaygın olarak kullanılan malzemeler kullanılarak basit bir yaklaşım sağlar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. kimyasal çözüm hazırlık

Not: Sonraki adımda gerekli kimyasal çözümleri hazırlamak için aşağıdaki adımları vardır. Bunlar toplu olarak yapılan ve birkaç ay için depolanan.

1. Başlamak için 254 nm UV crosslinking fırında 15 dakika (15 mJ/cm² toplam pozlama) herhangi bir bulaşıcı DNA nötralize etmek sterilize tarafından 50 mL saf, deiyonize su hazırlamak. Aşağıdaki adımları kullanmak için 37 ° c ısı.
2. 10 mL % 40 toplam (T) ve % 3.3 crosslinker (C) (29:1) yapmak polyacrylamide öncü çözüm. 3.867 g Akrilamid monomer ve BIS-Akrilamid monomer 0,133 g ağırlığında. Birleştirmek ve birim getirmek ilâ 10 mL sıcak saf su ve eriyene kadar girdap ile. Mağaza oda sıcaklığında ışık korunuyorsunuz.
   Not: Premix T % 40, ticari olarak % 3.3 C (29:1) polyacrylamide çözümleri satın alınabilir.
3. 10 mL % 50 T, % 5 C jel çözüm yapmak. 4.750 g Akrilamid monomer ve BIS-Akrilamid monomer 0.250 g ağırlığında. Birleştirmek ve birim getirmek ilâ 10 mL sıcak saf su ve eriyene kadar girdap kullanarak. Mağaza oda sıcaklığında ışık korunuyorsunuz.
4. 10 mL % 50 (w/v) Sükroz çözeltisi olun. 5 g Sükroz için mezun bir silindir eklemek ve toplam hacmi 10 mL kadar sıcak saf su ekleyin. Eriyene kadar girdap ve mağaza oda sıcaklığında.
5. 10 mL % 10 yapmak APS (w/v). 1 g amonyum persülfat (APS) mezun silindir için ekleyin. Soğuk (~ 4 ° C) saf eklemek toplam hacmi 10 mL ve eriyene kadar girdap kadar su. Hemen 200 µL aliquots içinde dondurmak.

2. jel-seq kaset imalat

Not: Jel-seq was orijinal gelişmiş-dik kaset (daha fazla bilgi için bkz: Malzemeler tablo ) ile; Ancak, bu iletişim kuralını herhangi bir standart Jel Elektroforez kaset ile çalışmaya adapte edilebilir.

1. Jel öncüleri üç ayrı plastik tüpler Tablo 1 aşağıda gösterildiği gibi ayıraçlar ekleyerek hazırlayın. Yok APS veya Tetramethylethylenediamine (TEMED) aşağıdaki adımlarda yönetmen kadar ekleyin. Girdap malzemeyi iyice karıştırın.

Dolgu jel habercisi		Yüksek yoğunluklu jel habercisi		Düşük yoğunluklu jel habercisi
40 %T, 3.3%C Akrilamid Bisacrylamide çözüm	1.6 mL	50 %T, 5 %C Akrilamid Bisacrylamide çözüm	2.4 mL	40 %T, 3.3%C Akrilamid Bisacrylamide çözüm	0.6 mL
Deiyonize su	10.2 mL	Deiyonize su	1.0 mL	Deiyonize su	4.8 mL
Sükroz çözüm (% 50 w/v)	2.6 mL	Sükroz çözüm (% 50 w/v)	0.6 mL
10 X Tris-Bor-EDTA	1.6 mL			10 X Tris-Bor-EDTA	0.6 mL
Amonyum persülfat (% 10 w/v)	104.0 ΜL	Amonyum persülfat (% 10 w/v)	50.0 ΜL	Amonyum persülfat (% 10 w/v)	39.0 ΜL
TEMED	6.0 ΜL	TEMED	1.0 ΜL	TEMED	2.2 ΜL
Toplam hacim	16.1 mL	Toplam hacim	4.1 mL	Toplam hacim	6.0 mL

Tablo 1. Jel sentez reaktifler. Polyacrylamide jel habercisi reaktifler 2 kaset imalatı için yeterli.

2. Jel monomer çözümleri de-gaz tüp kap bir iğne ekleme ve bu iğneyi bir ev vakum hattına bağlayarak. Bu derlemede bir ultrasonik Banyo Seti yüksek olarak daldırın ve sıvıdan bir sonraki adıma geçmeden önce ortaya çıkan kabarcıklar durdurana kadar bekleyin (~ 60 saniye / tüp).
   Not: çözüm ortaya çıkan kabarcıklar görülebilir sürece vakum kalitesini ve ultrasonik banyo gücünü kritik değildir.
3. TEMED ve APS dolgu jel habercisi ve girdap kısaca ekleyin. Hemen dolgu jel habercisi 6 mL her jel kaset kaset üst içine belgili tanımlık eriyik pipetting tarafından ekleyin. 1 mL micropipette habercisi dökülmesini önlemek için altı artışlarla eklemek için kullanın. Bu adım için toplam süre 3 dakikadan az olmalıdır.
4. Sıvı düzey kasetleri bir düzey tablo dik konumlandırma tarafından olduğundan emin olun. Kasedi geri kalanı degassed, deiyonize su ile doldurun. 1 mL aralıklarla, yavaş yavaş karıştırma en aza indirmek için kaset Merkezi kullanarak yeniden su pipette. En az bir saat kadar bir gecede tedavisi polimer izin.
5. Polimer tedavi vardır sonra jel kaset su yer paylaşımı kaldırmak için bir lavabo üzerinde tersine çevirin. Basınçlı hava silah yavaşça arabirimi 6 inç mesafeden kaset üst açıklıklı havada esen kuru için kullanılabilir.
6. TEMED ve APS yüksek yoğunluklu jel habercisi ve girdap kısaca ekleyin. Hemen yüksek yoğunluklu habercisi 320 µL kullanarak yeniden 1 mL pipet kaset için ekleyin. Sıvı eşit kat dolgu jel katman kasedi ileri geri yaklaşık 3 kat rock yaparak emin olun. Bu adım daha az üç dakika sürer.
7. Kasedi geri kalanı degassed, deiyonize su ile doldurun. Yavaş yavaş 1 mL pipet ile karıştırma en aza indirmek için kaset ortasına pipet. En az on beş dakika, tercihen bir saat için tedavi polimer izin.
8. Yine, su yer paylaşımı kaldırmak için jel kaset tersine çevirin. Basınçlı hava arabirimi hafifçe kurumasýný kullanılabilir. TEMED ve APS düşük yoğunluklu jel habercisi ve girdap kısaca ekleyin. Hemen kaset (~1.65 mL) geri kalanı ile düşük yoğunluklu jel habercisi doldurun ve jel tarak ekleyin.
9. Polimerizasyon sırasında absorbe edilebilir gibi rezerv habercisi tarak üstündeki aşırı pipette. En az 4 saat, tercihen gece tedavisi polimer izin. Jelleri bir hafta veya daha fazla Tris-Bor-Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) (TBE tampon) arabellekte depolanabilir.

3. numune hazırlama ve ters transkripsiyon

1. Faiz hücrelerinin bir süspansiyon ile başlayan ve Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) laminar akış mahallede çalışma bir hemasitometre veya bir otomatik hücre sayaç hücre toplama hesaplamak için kullanın. Bir konsantrasyon µL serum fosfat tamponlu (PBS) içinde başına 100-1000 hücrelerin hücrelere sulandırmak.
   Not: Bu protokol PC3, HeLa ve fare karaciğer hücreleri gibi hücreler aralığına doğrulandı.
2. WTA içinde sağlanan reaktifler kullanarak (bakınız Tablo malzemeler), mix 19 µL lizis arabelleği kiti ve 10 X hazırlamak için RNase inhibitörü 1 µL stok çözüm tepki arabelleği. Yeterli hacim tepki arabelleği 0.5 µL ve her örnek için nükleaz boş su 2.75 µL içeren lizis ana karışımı oluşturun.
3. Yukarı ve aşağı kapatılan hücreleri yeniden askıya almak ve sonra örnek 1 µL UV steril bir 200 µL nükleaz ücretsiz şerit tüp içine pipet 5 kez hücre süspansiyon pipette. Örnek sayısına bağlı olarak gerektiği gibi tekrarlayın. Pipetting 1 µL nükleaz ücretsiz su yerine bir reaksiyon için hücreleri tarafından bir negatif kontrol eklediğinizden emin olun. Ardından, 3.25 µL lizis ana karışımı her örnek için ve hafifçe yukarı ve aşağı 5 kere pipetting tarafından karıştırın.
4. (Kapaklı ısıtmalı) bir termal cycler 72 ° c Onceden 1 µL RT astar ve 20 µM rasgele hexamer 1 µL WTA adaptörü (5 '-AAGCAGTGGTAT-CAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3 ') ile her örnek için ekleyin. GDNA Kütüphane hazırlık için pozitif kontrol olarak en az bir tüp rezerv ve 2 µL astar yerine su ekleyin.
   Not: WTA adaptörü ile rastgele hexamer isteğe bağlıdır ve sıralama sonuçları üzerinde çok az etkisi vardır.
5. Örnekleri hücreleri parçalayıcı için Önceden ısıtılmış termal cycler 3 dakika 72 ° C'de kuluçkaya. Hücreleri termal cycler ve buz üzerinde yer 2 dakika süreyle kaldırın. 4 ° C'de olumlu denetim 5 adım kadar saklayın.
6. Hücreleri lysing iken, ters transkripsiyon ana Mix aşağıdaki reaktif oranları içeren tüm RNA örnekleri için yeterli bir birim oluşturmak: 2 µL ilk strand arabelleği, şablon anahtarı Oligonükleotid (TSO), 0,25 µL RNase inhibitörü ve 1 µL 0.5 µL ters transkriptaz (100 U/µL).
7. Termal cycler 42 ° c Onceden Toplam numune hacmi 10 µL. için getirmek kalan örnekleri, ters transkripsiyon ana Mix 3.75 µL eklemek yukarı ve aşağı 5 kere pipetting tarafından Mix.
8. Ters transkripsiyon örnekleri içinde önceden ısıtılmış bir termal cycler getirdikten hemen gerçekleştirmek. Aşağıdaki programı çalıştır: 90 dk, 70 ° C 10 dk, sonsuza dek 4 ° C için 42 ° C. Bu güvenli durdurma noktadır.

4. jel ayırma ve örnek kurtarma

1. Dikkatli bir şekilde DNA kaldırma ürün kullanarak bir Jel Elektroforez odası temiz. Birkaç mL sıvı Temizlik maddesi odası tüm yüzeyler arasında bir tek kullanımlık tüysüz ücretsiz silme ve temizleme işlemi uygulamak ve sonra odası temiz 0,5 ile doldurun x TBE. En iyi sonuçlar için tüm cihazları bir 254 nm UV crosslinking fırında yerleştirin ve 15 dakika (15 mJ/cm²) sterilize.
2. Jel-seq kaset Jel Elektroforez odanın içine yerleştirin ve yerine kilitlemek. Yavaş yavaş jel tarak düz yukarı çekerek çıkarın. Jel yırtılma veya herhangi bir silah kopyalama önlemek yavaş hareket edin.
3. Adım 3 buz üzerinde örnekleri alıkoyan, en az bir örnek olumlu bir denetim cDNA Kütüphanesi üretimi için saklıdır. Bu denetim 4 ° C'de adım 6 kadar saklayın. Toplam hacim ~ 12 µL. iyice getirmek yukarı ve aşağı 5 kere pipetting tarafından mix örnekleri, boya kalan örnekleri için yükleme X 6 2 µL ekleyin.
4. Bir DNA merdivenin 1 µL boya ve su 7 µL yükleme x 6 2 µL ile birleştirir. Bu karışım jel-seq Kaset 1 şeride bir Elektroforez denetimi olarak pipette. Jel-seq kaset ayrı şerit içine önceki adımdaki örnekleri pipette. Pipet tamamen her kuyuya ekleyerek ve yalnızca dikey bir hareket kullanarak kaldırma kuyular arasında kirlenmesini önlemek için dikkatli olun.
5. Bir standart Jel Elektroforez Güç kaynağı kullanarak, bir elektrik alanı 250 V jel-seq kaset cDNA/RNA melez gDNA ayırmak 30 dakika boyunca uygulayın. Kez ayrılmış, jel-seq kaset Jel Elektroforez odasından kaldırın ve kazıma bir araç ile kenarları gözetleyen tarafından kaset iki yarısı açın.
6. Bir neşter kullanarak, jel yüksek yoğunluklu katmanın altında ikiye böldüm. Eldivenli elini ile alacak tarafından dolgu jel içeren yarım atmak. Yavaşça kalan jel boya sıyırıcı veya başka benzer alet ile kazıma kaset kapalı soyma. Bu bölümde jel ~ 30 mL 0.5 içeren bir tabak yerleştirin jel leke 3 µL ile x TBE.
7. Photobleaching en aza indirmek ve jel kapsayıcı için 5 dakika hafifçe sallayarak süre emmek için konteyner kapağı. Jel üzerinde plastik wrap yerleştirin ve bir jel dokümantasyon sistemi (daha fazla ayrıntı için bkz: Ref. 13) kullanarak bir UV görüntü almak. Bir 30 saniye pozlama genellikle net görüntüler üretir. Ayrılık meydana geldiğini doğrulayın.
8. Jel görselleştirme Nükleik asitlerin kolaylaştırmak için bir UV transilluminator taşıyın. Uygun UV gözlük takan, jel dokümantasyon sistemi sonuçlarından onaylayın. GDNA düşük yoğunluklu jel ve cDNA düşük yoğunluklu ve yüksek yoğunluklu bölgelerde arabirimi, başında bulunduğu olmalıdır.
9. Bir neşter kullanın, gDNA ve cDNA içeren jel bölgeleri keser. Örnekleri en iyi jel 10 mm dikdörtgen bölüm 4 mm kesim tarafından kurtarılan; Ancak, tam geometri kullanılan Jel Elektroforez Sistemi üzerinde bağlıdır. Ayrıca negatif kontrol ile dolu lane kesmek hatırlıyorum.
10. Jel bir şerit tüp içine çıkarılan her bölümünün künt son cımbız bir çift kullanarak yerleştirebilirsiniz. Jel birden çok parçaya ayrılmış veya çok fazla kuvvet uygulamak değil dikkatli olun. Bu olur, sadece her parça almak ve tüp ekleyin.
11. Pipet ucu tüp alt karşı dairesel şekilde hareket ettirerek bir pipet (200 µL pipet ipuçları çalışma iyi) ucu kullanarak her tüp jel eziyet. Nükleaz boş su (gDNA örnekleri içine 40 µL ve cDNA örnekleri içine 80 µL) örnek kaybı en aza indirmek için jel öğütmek için kullanılan pipet ucu kaldırmadan önce her tüp için ekleyin.
12. Şerit tüpler 37 ° C İnkübatör içinde bir girdap Mixer yerleştirin ve 8-12 saat için çalkalanır. Bu jel dışında yaygın nükleik asitleri sağlar ve doğal bir noktası bu çok gün protokol durduruluyor.
13. Örnekleri bir 8 µm gözenekli filtre plaka pipette ve jel parçaları dışarı zorlanma 5 dakika plaka 2600 x g de spin. Gözenekli filtre plaka konut plaka uzak kaldırın ve jel içermeyen su örnekleri bir yeni 200 µL şerit tüp pipette.
14. GDNA, iyi tarafından yukarı ve aşağı, pipetting karışımı içeren her örnek proteaz (0.9 AU/mL) 1 µL ekleyin ve 15 dakika 15 dakika 70 ° C'de ısı inactivation ardından 50 ° C'de kuluçkaya. Bu adım oluşturarlar tüketen için önemlidir ve gDNA sonraki tepki adımlar için erişilebilir yapar.
15. Bir 18 gauge iğne kullanarak, tüm örnek tüplerinin kapaklar delik poke. Örnekleri sıvı sesi azaltmak için bir vacufuge yerleştirin. gDNA örnekleri 5 µL ve cDNA örnekleri için 10 µL azaltılmış azaltılmalıdır.
16. Vacufuge ve örnek sayısına bağlı olarak, toplam buharlaşma süresi 30 ile 60 dakika arasında değişir. Numune hacmi hedef birimin düşerse, nükleaz boş su numune hacmi artırmak için eklemeniz yeterli olacaktır.

5. gDNA Kütüphane hazırlık

1. Bir yer veya benzer teknoloji kullanarak, her gDNA örnek adım 4 hem de Adım 3 pozitif denetiminden DNA toplama ölçmek. Detaylı bir iletişim kuralı için yer başvuru kılavuzuna bakın. ¹⁴
2. 0.2 ng/µL DNA örnekleri sulandırmak. Başlangıç hücre tipi ve gerekli sonuçları kalitesine bağlı olarak, düşük konsantrasyonlarda hala kalıcı kitaplıklar oluşturabilir. Bazı deneyler-ecek var olmak gerekli; Ancak, yazarlar kitaplıkları 0.1 ng/µL düşük ile başarılı oldu.
3. GDNA Kütüphane hazırlama adım 7 Kütüphane hazırlık yarım tepki birim protokolünde izleyerek tamamlayın.

6. cDNA Kütüphanesi hazırlık

1. 10 µL cDNA örnekleri ve olumlu adım 4 denetiminden ile başlayan, 12.5 µL 2 X qPCR mix, 0.5 µL cDNA PCR astar ve 2 µL nükleaz ücretsiz su ekleyin.
2. PCR aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak bir gerçek zamanlı thermocycler gerçekleştirmek: 3 dk 98 ° c 20-30 devredir 10 ardından 95 ° c sıcak-başlangıç s, 65 ° C 30 s ve 72 ° C için 3 dk. Toplam numune hacmi 25 için µL. tepki eğrileri izleneceğini ve th önce amplifikasyon e reaksiyonlar (doğrusal sinyal artış karşı döngü sayısı) veya üssel faz PCR eserler overamplification nedeniyle önlemek için bırakın. Daha fazla bilgi için overamplification kaçınmak, bu kağıt gibi Ref. 15 tartışma bölümüne bakın.
3. Amplifikasyon sonra 8. adımda protokol sonrası katı faz ters çevrilebilir immobilizasyon (SPRI) boncuk kullanarak ürün temiz. Bir kez tam, sonraki adıma geçin.
4. Bir yer veya benzer teknoloji kullanarak, her cDNA örnek hem de Adım 4 olumlu denetiminden DNA toplama ölçmek. Örnekleri DNA'ın yaklaşık 0.2 ng/µL içerecek şekilde gerekirse sulandırmak. Biraz düşük konsantrasyonlarda hala kalıcı kitaplıklar üretmek. Bazı deneyler-ecek var olmak gerekli, ancak yazarlar kitaplıkları 0.1 ng/µL düşük ile başarılı oldu.
5. İsteğe bağlı adım: bir standart polyacrylamide Jel Elektroforez ayrılık üzerinde 1-2 µL her kitaplık üretimi tepki doğrulamak için qPCR ürün çalıştı gerçekleştirmek. Başarılı sonuç bir örnek görüntü şekil 4' te gösterilmiştir. Polyacrylamide Jel Elektroforez kuralları konusunda detaylı iletişim kuralı için bkz: Ref. 16.
6. CDNA Kütüphanesi hazırlama kitaplığı hazırlık seti yarım cilt reaksiyon Protokolü adım 7 izleyerek tamamlayın.

7. Kütüphane hazırlıkla yarım cilt reaksiyonları

1. Kütüphane hazırlık yarım cilt reaksiyonları kullanarak kütüphane hazırlık seti protokolü takip ediyor. ¹⁷ Protokolü'nün bu bölümünde başvurulan tüm reaktifler Kütüphane hazırlık vardır ( Tablo malzemelerigörmek) kit. UV tarafından şerit tüpler örnekleri sayısı için yeterli sayıda sterilize işlenmek üzere başlar.
2. Transposase reaksiyon 5 µL transposase arabellek assay olarak kullanılmak üzere her şerit tüp ekleyerek gerçekleştirin. Sonra 2.5 µL transposase tarafından takip 2.5 giriş µL DNA 0.2 ng/µL (0,5 ng toplam) ekleyin. Yukarı ve aşağı 5 kere pipetting karıştırın.
3. 55 ° C'de 5 dakika kuluçkaya, sonra 10 ° C'de basılı tutun Örnek 10 ° C ulaştıktan sonra thermocycler kaldırın ve hemen her örnek için 2.5 µL transposase dur arabellek ekleyin. Örnekleri oda sıcaklığında 5 dakika tutun.
4. 7.5 µL Kütüphane hazırlık PCR karışımı, bir dizin 1 astar 2.5 µL ve 2.5 µL bir dizin 2 astar ekleyerek tedavi sırasını değiştir örnek yükseltmek için PCR reaksiyon hazırlayın. Bu astar özeldir ve Kütüphane hazırlık seti üreticisi tarafından sağlanır. Yukarı ve aşağı 5 kez de pipetting tarafından karıştırın.
   Not: benzersiz astar bileşimleri her örnek için kullanıldığından emin olun. 12 farklı dizin 1 astar ve benzersiz olarak kadar 96 farklı örnekleri etiket edinerek 8 farklı dizin 2 astar vardır. Astar her örnek için benzersiz bir bileşimini seçin.
5. PCR aşağıdaki programı bir thermocycler kullanarak gerçekleştirin. 25 µL örnek birimdir.
   72 ° C için 1 dakika
   30 saniye için 95 ° C
   12 döngüleri:
   95 ° C 10 saniye
   30 saniye için 72 ° C
   30 saniye için 55 ° C
   5 dakika 72 ° C
   10 ° C'de tutun
6. 8. adımda protokol sonrası SPRI boncuklar kullanılarak hazırlanan kitaplıkları temiz. Kütüphaneler Jel Elektroforez veya benzer bir yöntemi kullanarak doğrulanması. Kütüphane hazırlık seti elkitabına kitaplıkları doğrulamak hakkında ayrıntılı bilgi için bakınız. ¹⁷

8. katı faz ters çevrilebilir immobilizasyon boncuk Kitaplığı Temizleme

1. Her kullanımdan önce oda sıcaklığına tersinir immobilizasyon (SPRI) boncuk 1.5 mL aliquots içinde muhafaza edilmelidir ve -meli var olmak sağlam aşama getirdi. Ayrıca taze % 80 etanol her deneme için hazırlamak için önerilir. Aşağıdaki adımlar, dayanır SPRI boncuk Protokolü WTA seti el kitabı. ¹⁸
2. 1 µl WTA kiti lizis arabelleği her PCR ürünü ekleyin. Girdap SPRI boncuk eşit kadar karışık, o zaman her örnek için 50 µl SPRI boncuk ekleyin. Yukarı ve aşağı 10 kez örnek pipetting tarafından mix ve 8 dakika oda sıcaklığında örnekleri kuluçkaya.
3. Kısa bir süre sıvı tüpler taraftan toplamak için örnekleri spin. Örnekleri bir manyetik ayırma aygıtta ~ 5 sıvı tamamen açık görüntüleninceye kadar dakika yerleştirin.
4. Örnekleri manyetik ayırma aygıtta olmakla birlikte, yavaş yavaş süpernatant ve atma pipet - tüp boncuk yüzük değil rahatsız etmek için dikkatli olun. Sonraki 200 µL % 80 etanol boncuk bozmadan her örnek için ekleyin. 30 saniye bekleyin ve daha sonra dikkatlice süpernatant pipet. (Etanol yıkama) bu adımı yineleyin sonra.
5. Örnekleri için 30 kuru izin s - 1 dak. Büyük parçaları kalıcı olarak boncuk için bağlı olmak gibi örnekleri aşırı kuru değil.
   Not: Kısa bir kuruma süresini etanol bütün izlerini kaldırıldı emin olmak için önerilir. Eser miktarda etanol geride kalması gereken onlar biraz aşağı akım reaksiyonlar inhibe olabilir.
6. Örnekleri manyetik ayırma aygıttan kaldırmak ve her örnek boncuk DNA'dan elute 15 µL su ekleyin. Yukarı ve aşağı pipet ve boncuk tüpler iki tarafından kaldırılır emin olun. Oda sıcaklığında 2 dakika süreyle kuluçkaya. Kısaca örnekleri spin ve onları manyetik ayırma aygıtta ~ 1 çözüm Açık görüntüleninceye kadar dakika yerleştirin.
7. Örnekleri manyetik ayırma aygıtta olmakla birlikte, yavaş yavaş süpernatant pipet ve temiz tüpler için transfer. Tüp boncuk yüzük bozmamaya dikkat edin. Boncuk tüplerini atmak.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

GDNA ve cDNA/RNA melez jel-seq cihazda fiziksel ayrılması ile floresan jel görüntüleme görüntülenmeyecektir; temsil edici bir sonuç şekil 3' te gösterilmiştir. Paneli A fabrikasyon jel-seq aygıt gösterir; yanlış renk farklı jel bölgeleri ayırmak için eklendi. Panel B dört farklı renk ayrımlarını doğrulamak için kullanılan yakın gösterir. Üçüncü lane, bir negatif kontrol, arka plan temsil eder ve hiçbir autoflourescence arabi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Jel-seq aygıt uydurma gibi protokol kendisi ile ilişkili çeşitli kritik adımlar vardır. İmalat sırasında jel çeşitli bölgeleri için öngörülen katman kalınlıkları ile başlayan öneririz. Önemli zaman farklı imalat seçenekleri test geçirdim ve en iyi cihazlar malzemeler tablo ve Kimyasallarılistelenen kaset için burada açıklanan protokol üretir. Araştırmacılar bir alternatif kaset sistemi kullanıyorsanız, onlar cihazlar oluştururken kullanılan birimleri tweak için gerek...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acrylamide Monomer	Sigma Aldrich	A8887-100G
Ammonium Persulfate	Sigma Aldrich	A3678-25G
Ampure XP Beads	Beckman Coulter	A63880	Referred to in the text as solid phase reversible immobilization (SPRI) beads
DNA Gel Loading Dye (6x)	ThermoFisher Scientific	R0611	Referred to in the text as 6X loading dye
Ethyl alcohol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR Kits	Kapa BioSystems	7959613001	Referred to in the text as 2X qPCR mix
N,N′-Methylenebis(acrylamide)	Sigma Aldrich	146072-100G	Also known as bis-acrylamide
NexteraXT DNA Library Preparation Kit (referred to in the text as library preparation kit)	Illumina	FC-131-1024	Includes: TD (referred to in the text as transposase buffer), ATM (referred to in the text as transposase), NT (referred to in the text as transposase stop buffer), and NPM (Referred to in the text as library prep PCR mix)
Nuclease Free Water	Millipore	3098
Protease	Qiagen	19155
SMART-Seq v4 Kit (referred to in the text as whole-transcript amplification (WTA) kit)	Takara/Clontech	634888	Includes: Lysis buffer, RNase inhibitor, 3’ SMART-Seq CDS Primer II A (referred to in the text as RT primer), 5X Ultra Low First Strand Buffer (referred to in the text as first strand buffer), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (referred to in the text as template switch oligonucleotide (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (referred to in the text as reverse transcriptase), and PCR Primer II A (referred to in the text as cDNA PCR primer)
Random hexamer with WTA adapter	IDT	n/a	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G
TEMED	Sigma Aldrich	T9281-25ML
DNA AWAY Surface Decontaminant	ThermoFisher Scientific	7010PK	Referred to in the text as DNA removal product
Tris-Borate-EDTA buffer (10X concentration)	Sigma Aldrich	T4415-1L
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO)	ThermoFisher Scientific	S11494	Referred to in the text as gel stain
Equipment
BD Precisionglide syringe needles, gauge 18	Sigma Aldrich	Z192554	Any equivalent hardware is acceptable
Branson CPX series ultrasonic bath	Sigma Aldrich	Z769363	Any equivalent hardware is acceptable
Empty Gel Cassettes, mini, 1.0 mm	ThermoFisher Scientific	NC2010	Any equivalent hardware is acceptable
Mesh Filter Plate - Corning HTS Transwell 96 well permeable supports - 8.0 µm pore size	Sigma Aldrich	CLS3374	Referred to in the text as 8 um mesh filter plate
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052	Any equivalent hardware is acceptable
Qubit Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33216	Any equivalent hardware is acceptable
Vacufuge Concentrator	Eppendorf	22822993	Any equivalent hardware is acceptable
XCell SureLock Mini-Cell system	ThermoFisher Scientific	EI0001	Any equivalent hardware is acceptable
Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	1855195	Any equivalent hardware is acceptable
Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker	GE Healthcare Life Sciences	UVC500-115V	Discontinued, any equivalent hardware is acceptable
Gel Doc XR+ Gel Documentation System	Bio-Rad	1708195	Referred to in the text as gel imager
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	DR89	Referred to in the text as UV transilluminator
Ultrasonic Bath	Bransonic	1207K35	Any equivalent ultrasonic bath is acceptable.