JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

İki farklı 3' hızlı amplifikasyon cDNA biter (3' yarış) protokolleri açıklanan burada yapmak açık okuma çerçevesi (ORF), kodonu ve tüm 3' UTR RNA kullanarak bir transkript, bir parçasını içeren dizileri iki farklı DNA polimerazlar kullanımı farklı kanser hücre satırlarından elde.

Özet

Ökaryotik mRNA'ların olgunlaşma Poli(a) kuyruğu ilavesi içerir 3' son oluşumu içerir. Bir gen 3' sonu eşlemek için geleneksel seçim 3' hızlı amplifikasyon cDNA biter (3' yarış) yöntemidir. İletişim kuralları için 3' yarış dikkatli tasarım ve ilgi hedef gen 3' Çevrilmeyen bölgesi (3' UTR) içinde iç içe geçmiş astar yelpazesi gerektirir. Ancak, bir kaç değişiklik ile protokol tüm 3' UTR ve dizileri ORF ve 3' UTR ilişkisi, daha kapsamlı bir görünümünü sağlayan açık okuma çerçevesi (ORF), içinde eklemek için kullanılabilir. Bu Poliadenilasyon sinyal (PAS), yanı sıra yanı sıra geleneksel 3' tarafından yarış sağlanan dilinim ve Poliadenilasyon site kimliğidir. Genişletilmiş 3' yarış alışılmadık 3' UTRs içinde 3' UTR, gen füzyon dahil olmak üzere, algılayabilir ve sırası bilgi AU transkript kararlılığını etkileyebilir öğeleri istikrarsızlaştırıcı zengin yanı sıra potansiyel miRNA bağlayıcı siteleri tahmin etmek için kullanılabilir.

Giriş

3' ucu oluşumu pre-mRNA aşağı Poli(a) kuyruğu1,2olun ~ 250 untemplated adenines ilavesi ve ardından bir pas bölünme oluşur mRNA olgunlaşma önemli bir adım var. Poli(a) kuyruğu Poli(a) bağlayıcı protein (PABP) bağlanır ve bu mRNA transkript bozulma korur ve çeviri1kolaylaştırır.

Mevcut tahminlere insan genlerinin % 70'i birden çok giriş ve böylece alternatif Poliadenilasyon, birden fazla 3' biter3' te sonuçlanan geçmesi öneririz. Böylece, nerede Poli(a) kuyruğu kalan 3' UTR verdiği tanımlamak gibi PAS tarafından verilen herhangi bir transkript kullanılan belirlemek önemlidir. Yeni nesil sıralama gelişiyle 3' eşzamanlı kimliği içinde UTRs ve genler binlerce PASs sonuçlandı. Bu artış sıralama özelliği, 3' uç alternatif Poliadenilasyon içeren verileri çözümlemek için bioinformatic algoritma geliştirme gerektirmiştir. De novo algılama veya PAS doğrulanmasını ve dolayısıyla 3' ucu bireysel genlerin büyük ölçekli sıralama veri eşleme için 3' yarış yönteminin seçimi4,5kalır. Normalde, 3' yarış cDNA ürünleriyle birlikte sıraları yalnızca bir bölümünü 3' Poli(a) kuyruğu, bölünme sitesi, PAS ve akıntıya karşı dizisi PAS içerir UTR'nin içerir. Tasarım ve gen belirli ileriye ve geriye doğru astar kullanımını gerektiren PCR 3' yarış sadece iki gen belirli iç içe ileri astar gerektirir. Dolayısıyla, PCR nükleotid dizisi güçlendirilmiş4,6olmak gen büyük bir bölgeye ilişkin daha ayrıntılı bir bilgi gerektirir. 3' yarış başlandığından beri aynı Poli(a) kuyruğu poliadenile RNA transkriptlerinizin için hedefleri, yalnızca ileri astar gen belirli, böylece, yalnızca mRNA önemli ölçüde daha küçük bir bölge bilgisi gerektiren gerekir astar ters. Bu kimin dizileri değil tam olarak karakterize4,7olan bölgelerdeki amplifikasyon sağlar. Bu 3' yarış sadece bir gen 3' sonu belirlemek için aynı zamanda belirlemek ve büyük bölgelerinde akıntıya karşı önemli bir kısmını 3' UTR formu PAS karakterize için kullanılmak üzere izin verdi. 5' ile değiştirilmiş 3' büyük bazı bölümleri 3' UTR ve kanat bölgeleri içeren yarış yarış birleştirerek, tamamen sıra ya da onun 3' son85' uç üzerinden tüm bir mRNA transkript klon mümkündür.

Son kimliği roman CCND1-MRCK füzyon gen transkript Mantle hücreli Lenfoma hücre satırlarından ve kanser hastaları bu uygulanması değiştirilmiş 3' yarış bir örnektir. 3' UTR üzerinden CCND1 ile MRCK gen dizilerinin oluşuyordu ve miRNA Yönetmeliği9' a inatçı. İki iç içe geçmiş CCND1 belirli ileri astar hemen bitişik ve CCND1 kodonu aşağı bölgeye tamamlayıcı. Her ne kadar bütün transcriptome sıralama belirli bioinformatic araçları ile birlikte gene füzyon103' UTR içinde algılamak için kullanılan, birçok labs mali kaynak veya yapmak için bioinformatic uzmanlık eksikliği bu teknoloji kullanın. Bu nedenle, 3' yarış de novo tanıma ve onaylama 3' UTR içeren roman füzyon genlerin yerine kullanılabilir. Köklü bildirilen füzyon genlerin sayısını artırmak gibi transkript okuma göz önüne alındığında, 3' yarış gen dizileri11,12karakterize güçlü bir araç haline gelmiştir. Buna ek olarak, son yıllarda yapılan çalışmalarda bu farklı diziler içinde 3' UTR yanı sıra uzunluğu 3' UTR mRNA transkript istikrar, yerelleştirme, translatability ve işlev13etkileyebilir göstermiştir. Kısmen artan ilgi nedeniyle transcriptome eşleme, orada laboratuar olarak kullanılmak üzere geliştirilen farklı DNA polimerazlar sayısındaki bir artış olmuştur. Ne tür değişiklikler 3' için DNA polimerazlar kullanılabilir repertuar yararlanmak için sipariş yarış protokolünde yapılabilir belirlemek önemlidir.

Bu eser 3' tüm 3' UTR eşlemek için yarış uyum raporları, PAS ve 3' sonu bölünme bir site kullanarak ANKHD1 transkript astar transkript ve iki farklı DNA polimerazlar ANKHD1 bölümünde iç içe geçmiş.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Önlük, eldiven ve koruyucu gözlük bu protokol için tüm yordamları gerçekleştirirken her zaman giymek. Konteyner/tüpler fenol ve guanidin isothiocyanate reaktif içeren yalnızca bir Sertifikalı hood ve dispose fenol atık belirlenmiş bir kap içinde açılan emin olun. Dnaz/RNAse-Alerjik steril tüpler, ipuçları ve Kimyasalları kullanın.

1. hücre kültürü

  1. HeLa hücre satır ve iki süspansiyon manto hücre Lenfoma hücre hatları, Granta-519 ve Jeko-1, % 10 içeren DMEM büyümek FBS ve 100 U/mL penisilin/streptomisin 37 ° C'de % 5 CO2 ile oksijen bir kuluçka Hücreleri 1:10 sulandırmak ve parçacık sayaç14kullanarak say.
  2. RNA çıkarma için 500.000 hücreler/iyi 6 iyi plaka (2 mL medya iyi başına) plaka. 24 h için kuluçka sonra RNA hücrelerden toplamak.

2. RNA çıkarma

  1. Hücre hasat
    Not: Santrifüjü adım dışında bir doku kültürü hood kısırlık korumak için listelenen adımları gerçekleştirin.
    1. Süspansiyon hücreleri (Jeko-1 ve Granta-519):
      1. Hücreleri (birlikte medya 2 mL) 15 mL tüp için transfer ve 5 dk. aspiratı medya 1,725 x g, santrifüj kapasitesi ve hücre Pelet tüpün dibinde bırakın.
      2. Hücre Pelet 1 fosfat Buffered Saline (PBS) x 50 µL resuspend. Monophasic fenol ve guanidin isothiocyanate reaktif 500 µL 1.5 mL microcentrifuge tüp her örnek ekleyin. Mix iyi ve her 1 dk. terk microcentrifuge tüp ters çevirme sırasında oda sıcaklığında (RT) 5 min için.
    2. (HeLa) yapışık hücreleri için:
      1. Her şey hücre kültür ortamından Aspire edin. Enkaz yıkamak için her şey için PBS 1 mL ekleyin.
      2. PBS kaldırın ve her şey için monophasic fenol ve guanidin isothiocyanate reaktif 500 µL ekleyin.
      3. RT hafif sallanan ile 5 min için kuluçkaya. 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.
  2. Hücre lizis
    1. Fenol ve guanidin isothiocyanate hücre karışımı 1 h için-20 ° C'de dondurmak.
      Not: Mix-20 ° c gece veya ihtiyaç kadar bırakılabilir.
    2. Fenol ve guanidin isothiocyanate hücre karışımı buz çözme. Kloroform 100 µL PCR başlıklı microcentrifuge tüp ekleyin. Girdap karışımı pembe ve opak kadar 10-15 s için örnek. Örnek 15 dakika (4 ° C'de) buz üzerinde kuluçkaya.
    3. Örnek 20,800 x g ve 4 ° c de 15 dakika santrifüj kapasitesi Dikkatli bir şekilde çıkarın üst renksiz sulu faz (~ 200 µL) ve yeni bir 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarmak.
  3. RNA Yağış
    1. İsopropanol eşit bir hacmi her örnek için ekleyin. Coprecipitant 1 µL ekleyin (her bir taşıyıcı RNA olarak davranmaya örnek ve sonraki adımda RNA görselleştirmek yardımcı Malzemeler tablobkz:). Örnek-80 ° c en az 4 h için kuluçkaya. En iyi sonuçlar için gecede-80 ° C'de kuluçkaya
    2. Örnek için soğutmalı santrifüj aktarın. 20,800 x g, 35 dk santrifüj / 4 ° C; RNA tüp altındaki mavi bir nokta görünür. Dikkatli bir şekilde alınan örneğin isopropanol çıkarın. 500 µL % 80 etanol ekleyin ve kısa bir süre için 3 vortexing tarafından Pelet resuspend s.
    3. 5 dakika süreyle santrifüj örneği de RT 20,800 x g ' örnek tüm etanol kaldırın. Let örnek kuruması için RNAse free su 35 µL içinde örnek yaklaşık 10 dk. Resuspend. RNA tam çözümde olduğundan emin olmak 5 min için bir ısı blok (65 ° C) yerleştirin ve hemen tüp Buza koyun.
    4. Toplam RNA daha önce açıklanan, RNA Örnek 1,5 µL yerine 1 µL15kullanmak dışında bir Spektrofotometre kullanarak konsantrasyonu belirlemek. İsteğe bağlı olarak, toplam RNA'ın 1 µg RNA bütünlük belirlemek için % 1'özel jel üzerinde çalıştırın.

3. Dnaz tedavi

  1. Sonra miktar RNA'ın Dnaz tedavi genomik DNA aşağılamak için toplam RNA üzerinde gerçekleştirin. Her örnek için bir ayrı microcentrifuge tüp içinde karıştırın bir 20 µL Toplam tepki yapmak RNAse free Dnaz Takımı'ndan aşağıdaki reaktifler ekleyin:
    1. Mix 2 µL Dnaz 10, reaksiyon arabellek X 4,4 µg toplam RNA ile. Su ile 14 µL toplam getirmek.
    2. Dnaz RNase free 2 µL ekleyin. RNase inhibitörü (ters transkripsiyon takımı)'ndan 30 dakika 2 µL huzurunda 37 ° C'de kuluçkaya.
    3. Dnaz enzim devre dışı bırakabilirsiniz için 70 ° c 10 min için bir ısı blokta 2 µL çözüm durdurmak ve ısı ekleyin.
      Not: Dnaz tedavi seçime bağlıdır.

4. cDNA sentezi

50 µL son tepki hacmi için:

  1. 50 µL son tepki hacmi için: Transfer 22 µL Dnaz, yeni tüp veya transfer 4 µg yeni bir tüp için 22 µL toplam hacmiyle ekledi su ile toplam RNA'ın RNA tedavi. T7 oligo dT25 astar 2 µL 10 µM astar çözümden ekleyin. 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 sırasıdır T7 oligo dT25 astar için '.
  2. Ters transkripsiyon teçhizat--dan 2 µL RNase inhibitörü (20 U/µL), 5 x reaksiyon arabelleğinin 8 µL, 10 mM dNTPs 4 µL ve transkriptaz (200 U/µL) 2 µL ekleyin.
    Not: bir tepki ters transkriptaz olmadan bir negatif kontrol hareket için ayarlayın.
  3. 42 ° c için 1 h. Transfer doğrudan buz kuluçkaya. Tüp 5 min için 75 ° C'de ısı ve tüp Buza koyun.

5. Astar arama Fusion Gene transkript için

  1. Astar tasarım
    1. CDNA sıra Ensemble genom tarayıcı (ENST00000360839.6/NM_017747) indirmek ve hedef transkript (ANKHD1) akıntıya karşı kodonu ORF içinde bir bölge tanımlar. Kopyalama ve yapıştırma dizisi akıntıya karşı kodonu içine astar tasarım yazılımı sıra giriş bölgesi içeren tüm bölgenin (700 nukleotid) (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>).
    2. Göster özel tasarım seçeneğini seçip 10 astar sayısı için sistem (sonuçlar dönmek için) üretmek ve tüm diğer parametreleri ayarla varsayılan olarak bırakın.
    3. Beş ileri astar ve örtüşmeyen iki ters astar seçin. Astar sipariş ve RNAse/Dnaz-ücretsiz su 10 µM son bir konsantrasyon ile yeniden oluşturma. PCR için genel astar tasarım hakkında daha fazla bilgi başka bir yerde kaplıdır16.
  2. PCR kullanılmak üzere sonraki 3' yarış potansiyel astar tanımlamak için
    Not: tepki olarak kullanmak için son ileri astar, tasarlanmış astar PCR başlıklı düzenli PCR ileriye ve geriye doğru astar farklı birleşimlerini ayarlayarak sınayın.
    1. CDNA (2 µL) taze 0.5 mL PCR tüp aktarın. 1 µL ileri astar ve 1 µL ters astar (bir çözümden 10 mM astar) ekleyin. İlâ 12.5 µL 8,5 µL nükleaz ücretsiz su ekleyerek getirin. 12.5 µL PCR jel Master Mix x 2 ekleyin.
    2. Aşağıdaki PCR termal bisiklet koşullarını kullanın: 95 ° C için 2 dk ardından 29 devredir 30 95 ° c s, 30 60 ° C s ve 72 ° C 1 dk. için 7 dk. 68 ° C'de son döngüsü ayarlamak.
    3. PCR sonra ürünler arasında etidyum bromür ile lekeli bir % 1'özel jel çalıştırın. Elektroforez ayrıntılarını daha önce bir kaç değişiklik17ile açıklanmıştır.
      1. Özel Tris-asetat (TAE) arabellekte bir 250 mL şişe 100 ml 1 g geçiyoruz. Bir mikrodalga fırında kaynatın.
      2. 1 dakika serin ve etidyum bromür çözüm (10 mg/mL stok) 7.5 µL duman mahallede eklemek için izin. De şişeye dönen tarafından mix ve bir yatay jel aparatı dökün. RT duman mahalle kuvvetlendirmek jel izin vermek en az 30 dk için bırakın.
      3. Jel 1 x TAE arabellek ile kapak ve 10 µL PCR ürünü özel jel ile birlikte 3-5 µL DNA molekül ağırlığı merdivenin üzerine yükleyin. 10 dk. görselleştirmek için bir görüntüleyici kullanarak ürün 175 V çalıştırıyorsa ve daha fazla ürün ayrılması gerekiyorsa, ek bir 5-10 dk için jel.
  3. İç içe geçmiş astar için 3' ırk seçimi
    1. Farklı, güçlü ve tek PCR müzik grubunuz mu var astar seçmek için PCR özel jel sonuçlarını çözümlemek. 5'-en astar kullanmak (ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3') ile birlikte çalıştırmak ilk PCR T7 oligodT25 astar.
    2. Nehrin aşağısında bulunduğu ilk astar iç içe geçmiş astar seçin (ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3') ve T7 astar ile kullanabilirsiniz (5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3') PCR reaksiyonları ikinci kümedeki.

6. 3' yarış 3' UTR iki farklı enzimler kullanarak eşleştirmek için en iyi duruma getirme

Not: PCR için kullanılan DNA polimerazlar çeşitliliği bir artış olmuştur; Bu nedenle, farklı enzimler 3' için yarış PCR reaksiyonları kullanırken bile uygulanan standart koşullar belirlemek istedim. Herhangi bir transkript için ters astar sabit tutulur; Tek değişiklikler için hedef transkript özgü iç içe ileri astar bulunmaktadır.

  1. 1:3 protokol ' den Pyrococcus furiosus (Pfu) değiştirilmiş DNA polimeraz kullanarak yarış
    1. İlk PCR
      1. CDNA 1 µL PCR tüp aktarmak ve 10 x Pfu tepki arabelleği 5 µL ekleyin. İlk iç içe ileri astar 1 µL, 1 µL T7 oligodT25 astar ve dNTPs 1 µL (10 mM eriyik--dan) ekleyin.
      2. 49 µL Toplam hacim 40 µL su ekleyerek getirin. Pfu DNA polimeraz 1 µL ekleyin ve iyice karıştırın. Tablo 1' de PCR profili kullanarak PCR çalıştırın.
    2. İkinci PCR
      1. 2 µL ürünlerin ilk PCR yeni bir PCR tüp aktarmak ve 10 x PfuUltra II tepki arabellek 5 µL ile karıştırın. İkinci iç içe geçmiş PCR astar 1 µL, 1 µL T7 astar ve dNTPs (10 mM çözüm) 1 µL ekleyin.
      2. 49 µL toplam reaksiyon cilt 39 µL su ekleyerek getirin. Pfu DNA polimeraz 1 µL ekleyin. PCR ilk PCR kurulum (Tablo 1) aynı PCR profili kullanarak çalıştırın.
  2. 2:3 protokol ' için Pyrococcuserimiş bir DNA bağlayıcı etki oluşan chimeric DNA polimeraz kullanarak yarış-polimeraz PCR ana mix yazım denetleme gibi
    1. İlk PCR
      1. CDNA 1 µL PCR tüp aktarın. 1 µL ilk iç içe ileri astar ve T7 oligodT25 astar 1 µL ekleyin. En çok 25 µL 22 µL su ekleyerek getirin.
      2. 25 µL PCR Master Mix x 2 ekleyin ve iyice karıştırın. Tablo 2' de açıklanan PCR bisiklet koşullarını kullanın.
    2. İkinci PCR
      1. 2 µL ürünlerin ilk PCR yeni bir PCR tüp aktarın. İkinci iç içe geçmiş PCR astar 1 µL T7 ters astar ile birlikte 1 µL ekleyin.
      2. En çok 25 µL 22 µL su ekleyerek getirin. 25 µL PCR Master Mix X 2 ekleyin. PCR ilk PCR kurulum (Tablo 2) aynı PCR profili kullanarak çalıştırın.

7. ikinci PCR ürünü olan 3' yarış doğrulayın.

  1. Almak 5-10 µL ikinci PCR ürünü (yanı sıra ürün Eğer transkript bol ifade PCR ilk turda) ve bir özel jel kaçıyor. Jel ayarla ve daha önce açıklandığı gibi Elektroforez (Adım 5.2.3.1-5.2.3.3) çalıştırın. Bir Imager sonuçlarına görselleştirin.

8. ürün arıtma ve sıralama

  1. Jel ve PCR parçası DNA temizleme sistemi başı olarak üreticinin iletişim kuralını kullanarak ikinci PCR jel PCR Urun arındırmak.
  2. Sanger gerçekleştirmek sıralama (alternatif olarak, jel saf PCR ürün örnekleri ve uygun sıralama astar bir sıralama laboratuara gönder). Sanger sonra sıralama verileri analiz sıralama.
  3. Sıra analiz yazılımı indirmek ( Tablo malzemelerigörmek) ve izleme dosyaları yazılım alın. Kullanım bireysel saf Bankası QVs (Kalite Bankası elde etmek için değerler) bilgi18ara. Kromatografik ile yüksek kaliteli izlemeler görüntülemek için indirin.
    İsteğe bağlı: Jel arıtılmış ürün uygun bir klonlama kiti ve Sanger için gönderilen izole klonlar kullanma klonlanmış sıralama.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

İç içe geçmiş ileri astar arama:

Özel jel Şekil 1 , hangi kullanım aynı ama farklı ters astar astar ileri iki ayrı PCR jel ürün (şerit 1 ve 2) gösterir. Lane 3 ayrı bir PCR ürünü ve farklı ileriye ve geriye doğru astar vardır. Dayalı PCR reaksiyon için kullanmak için ideal astar bir ayrı PCR ürün (Lane 3) vermek bunlar. Şerit 1 ve 2 kullanılan ileri astar ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bir gen gen olarak büyük paralel sıralama teknolojileri gelişiyle rağmen 3' yarış PAS ve nükleotid Poli(a) kuyruğu bitişik tanımlamak için en kolay ve en ekonomik yöntem kalıyor. Burada açıklanan adaptasyon kullanarak 3' yarış hem yükseltmek ve ORF, kodonu ve tüm 3' UTR ANKHD1 mRNA transkript, bir bölümünü içeren dizileri eşlemek için genişler. 3' yarış bir büyük avantajı birkaç küçük uyarlamalar ile diğer vektörel çizimler aşağı akım sorgulama işlevinin miRNA hedefle...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Bettine Gibbs teknik yardım kabul etmek istiyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
HeLa cellsATCCCCL-2Cervical cancer cell line.
Jeko-1 cellsATCCCRL-3006Mantle cell lymphoma cell line.
Granta-519 cellsDSMZACC-342Mantle cell lymphoma cell line.
Fetal Bovine SerumSigma AldrichF6178Fetal bovine serum for cell culture.
Penicillin/StreptomycinThermoFisherScientific15140122Antibiotic and antimycotic.
GlycoBlueAmbionAM9545Coprecipitant.
DMEMThermoFisherScientific10569044Gibco brand cell culture media with GlutaMAX.
Nuclease Free-WaterThermoFisherScientificAM9938Ambion DNase and RNAse free water(non DEPC treated).
Dulbecco’s Phosphate-Buffered SolutionCorning21-0301X PBS.
ChloroformSigma  AldrichC7559-5VL
2-propanolSigma AldrichI9516
Reagent AlcoholSigma Aldrich793175Ethanol
Ethidium Bromide solutionSigma AldrichE1510
TRIzol ReagentThermoFisherScientific15596026Monophasic phenol and guanidine isothiocyanate reagent.
2X Extender PCR-to-Gel Master MixAmrescoN8672X PCR-to-Gel Master Mix  containing loading dye used in routine quick PCR assays and primer search.
10mM dNTPAmrescoN557
RQ1 RNase-Free DNasePromegaM6101Dnase treatment kit.
Gel Loading Dye Orange (6X)New England BioLabsB7022S
2X Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF bufferThermoFisherScientificF531S2X PCR MasterMix containing a chimeric DNA polymerase consisting of a DNA binding domain fused to a Pyrococcus-like proofreading polymerase and other reagents.
PfuUltra II Fusion HS DNA polymeraseAgilent Technologies600670Modified DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus (Pfu).
RevertAid RT Reverse Transcription KitThermo FischerK1691Used for  reverse transcription of mRNA into  cDNA synthesis. Kit includes  Ribolock RNAse inhibitor, RevertAid M-MuLV reverse transcriptase and other reagents listed in manuscript.
Pefect size 1Kb ladder5 Prime2500360Molecular weight DNA ladder.
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage IIIAlpha InnotechUsed to visualise ethidium bromide stained agarose gel.
Low Molecular Weight LadderNew England BioLabsN3233LMolecular weight DNA ladder.
Vortex MixerMidSciVM-3200
Mini CentrifugeMidSciC1008-R
Dry BathMidSciDB-D1
NanoDrop 2000CThermoFisherScientificND-2000CSpectrophotometer.
Wide Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis SystemBioRad1704469Electrophoresis equipment-apparatus to set up gel
PowerPac Basic Power SupplyBioRad1645050Power supply for gel electrophoresis.
AgaroseDot ScientificAGLE-500
Mastercycler GradientEppendorf950000015PCR thermocycler.
CentrifugeEppendorf5810 R
CentrifugeEppendorf5430R
Wizard SV Gel and PCR Fragment DNA Clean-Up SystemPromegaA9281
Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit, with One Shot  TOP10 Chemically Competent E. coli cellsThermoFisherScientificK280020
MyPCR Preparation Station MystaireMidSciMY-PCR24Hood dedicated to PCR work.
Hamilton SafeAire II fume hoodThermoFisherScientificFume hood.
Beckman Coulter Z1 Particle CounterBeckman Coulter6605698Particle counter. For counting cells before plating  for RNA extraction.
Applied Biosystems Sequence Scanner Software v2.0Applied Biosystems (through ThermoFisherScientific)Software to analyze Sanger sequencing data.

Referanslar

  1. Mandel, C., Bai, Y., Tong, L. Protein factors in pre-mRNA 3'-end processing. Cell Mol Life Sci. 65 (7-8), 1099-1122 (2008).
  2. Danckwardt, S., Hentze, M., Kulozik, A. 3' end mRNA processing: Molecular mechanisms and implications for health and disease. EMBO J. 27 (3), 482-498 (2008).
  3. Derti, A., et al. A quantitative atlas of polyadenylation in five mammals. Genome Res. 22 (6), 1173-1183 (2012).
  4. Sambrook, J., Russell, D. W. Rapid amplification of 3′ cDNA ends (3′-RACE). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
  5. Masamha, C. P., et al. CFIm25 regulates glutaminase alternative terminal exon definition to modulate miR-23 function. RNA. 22 (6), 830-838 (2016).
  6. Rodu, B. Molecular Biology in Medicine: The polymerase chain reaction: the revolution within. Am J Med Sci. 299 (3), 210-216 (1990).
  7. Bertioli, D. Rapid amplification of cDNA ends. PCR Cloning Protocols: Methods in Molecular Biology. White, B. A. 67, Humana Press. 233-238 (1997).
  8. Freeman, L. A. Cloning full-length transcripts and transcript variants using 5' and 3' RACE. Lipoproteins and Cardiovascular Disease: Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). Freeman, L. 1027, Humana Press. 3-17 (2013).
  9. Masamha, C. P., Albrecht, T. R., Wagner, E. J. Discovery and characterization of a novel CCND1/MRCK gene fusion in mantle cell lymphoma. J Hematol Oncol. 9 (1), 1-5 (2016).
  10. Parker, B. C., et al. The tumorigenic FGFR3-TACC3 gene fusion escapes miR-99a regulation in glioblastoma. J Clin Investig. 123 (2), 855-865 (2013).
  11. Prakash, T., et al. Expression of conjoined genes: Another mechanism for gene regulation in eukaryotes. PLOS ONE. 5 (10), e13284(2010).
  12. Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T., Mitelman, F. The emerging complexity of gene fusions in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (6), 371-381 (2015).
  13. Mayr, C. Evolution and biological roles of alternative 3'UTRs. Trends Cell Biol. 26 (3), 227-237 (2016).
  14. International Committee For Standardization In, H., et al. Protocol for evaluation of automated blood cell counters. Clin Lab Haematol. 6 (1), 69-84 (1984).
  15. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565(2010).
  16. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998(2012).
  17. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923(2012).
  18. Curtis, P. C., Thomas, J. L., Phillips, N. R., Roby, R. K. Optimization of primer specific filter metrics for the assessment of mitochondrial DNA sequence data. Mitochondrial DNA. 21 (6), 191-197 (2010).
  19. Letowski, J., Brousseau, R., Masson, L. Designing better probes: Effect of probe size, mismatch position and number on hybridization in DNA oligonucleotide microarrays. J Microbiol Methods. 57 (2), 269-278 (2004).
  20. Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
  21. Singh, V. K., Govindarajan, R., Naik, S., Kumar, A. The effect of hairpin structure on PCR amplification efficiency. Mol Biol Today. 1, 67-69 (2000).
  22. Kalle, E., Kubista, M., Rensing, C. Multi-template polymerase chain reaction. Biomol Detect Quant. 2, 11-29 (2014).
  23. Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. The landscape of kinase fusions in cancer. Nat Commun. 5, 4846(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Genetiksay 133transkript3 u3 h zl amplifikasyon cDNA biter 3 yarPolimeraz zincir reaksiyonuPoliadenilasyon sinyal PASPoliadenilasyon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır