JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Böbrek yapıları doku Mühendisliği zararlı etkileri diyaliz ve organ sıkıntısı için bir çözüm sağlar. Burada, bir protokol mikro tarif yalıtım kortiko-medüller segmentleri için fare böbrekler incelemek. Bu segmentler oluşturan böbrek organoids iskele-Alerjik Hücresel yapıları implante edilir.

Özet

Böbrek nakli şimdi son aşama böbrek hastalığı için genel kullanıma uygun bir tedavi yöntemidir. Ancak, bekleme listesi ve sadece dörtte biri ekimi ulaşmak bu hastaların yaklaşık 96.000 kişi ile alternatifler organları başarısız olanlar için korkunç bir ihtiyaç yoktur. Diyaliz bu maruz kalırsa genel olarak sağlık maliyetleri ile birlikte zararlı sonuçlarını azaltmak için etkin soruşturma organ nakli için alternatif çözümler arayışı içinde devam ediyor. İmplante edilebilir doku Mühendisliği böbrek hücresel kayıp böbrek işlevleri yerine bir tür uygun yaklaşım yapılarıdır. İlk kez açıklanan, burada yaşayan corticomedullary yalıtım için fare böbrekler mikrodiseksiyon böbrek kesimleri. Bu kesimler bir kez implante ana damarlara ile hızlı bağlantı sağlayan iskele-Alerjik endotel-fibroblast yapıları içinde hızlı birleşme yeteneğine sahiptirler. Yetişkin fare böbrek böbrek kesimleri çapı 200-300 µm elde etmek için stereoscope mikrodiseksiyon ardından yaşam bağışçılardan tedarik. Birden fazla böbrek yapıları kullanarak tek bir böbrek hasat birincil böbrek kesimleri fabrikasyon. Bu yöntem aksi takdirde iptal edilecek organların fonksiyonel böbrek dokusundan kurtarmak bir işlem gösterilmektedir.

Giriş

Kronik böbrek hastalığı (CKD) geçerli büyük halk sağlığı sorunları dünya çapında1biridir. Amerika Birleşik Devletleri'nde CKD yaygınlığı % 14'den fazla 600.000 Amerikalılar en şiddetli, son aşama böbrek hastalığı (ESRD)2acı ile toplam nüfusun bitti. Mevcut tedavi seçenekleri bu ESRD ile diyaliz ve böbrek nakli dahil. Her ne kadar yaklaşık 25.000 hastalar böbrek nakli her yıl geçmesi, her yıl o bir hayat kurtarıcı organ ve o alıcı nakli3bekleyen arasında büyük bir eşitsizlik önde gelen hastaların önemli bir sayı eklenir. Uzun ömürlü ve yaşam kalitesini ciddi olumsuz etkileri yanı sıra, diyaliz şaşırtıcı bir mali yük ile ilişkilidir. 2014 yılında Medicare iddiaları ödenen üzerinde 30 milyar dolar ESRD hastalar2için buldu. Bir sınırlı organ tedarik ve hastaların diyaliz gerektiren hiçbir belirgin düşüş trendi, diyaliz için alternatif çözümler belirleme araştırma çabalarına yönelik ve nakli şimdiye kadar önemlidir. Diyaliz ihtiyacını bile nispeten kısa bir gecikme diyaliz ile ilgili maliyeti4,5,6ertelenmesi ise kalite-düzeltilir ömrü yıl ve verimlilik bir hastanın sayısını önemli ölçüde artırır.

Böyle ESRD, fonksiyonel doku kaybı için çözümler şu anda doku Mühendisliği ve rejeneratif tıp laboratuvarları, iskele tabanlı organoid imalat bütün organ mühendislik kullanmaya kadar yaygın olarak çeşitli yaklaşımlarla incelendiği organ yapıları hücresel implantasyon7,8,9,10,11decellularized. Marjinal veya gözardı edilen böbrek böbrek karmaşık yapıları recapitulating kısmen soruşturma. Aslında, neredeyse böbrek nakli için tedarik % 20'si çeşitli nedenlerle12,13için atılır. Bu sözde Greftler fonksiyonel böbrek dokusundan kullanılmaktadır ve bir veya daha fazla doku mühendislik yapıları dahil. Önceki çalışmalar atılan bu organlar, böbrekler doku mühendislik amaçlı14,15ekstra hücresel matris için kullanan çalışma fizibilite göstermiştir. Ancak, az sağlıklı böbrekler birincil nephronal dokudan doku Mühendisliği amacıyla16,17,18için kullandık.

Bir yöntem daha önce Kim vd tarafından açıklanan dan sonra üzerinde Poliglikolik asit (PGA) İskele yapı imalat16numaralı seribaşı sağlıklı sıçan böbrek, böbrek "parçaları" yalıtım içerir. Ancak, tam diseksiyon metodoloji ile ilgili çok az bilgi verilir ve kesimleri iyi kıyma ve filtrasyon bileşiminden elde edilmiştir. Benzer şekilde sağlam nephronal mimarisi ile ayrık böbrek segmentleri oluşturur, ancak yerine mikrodiseksiyon teknikleri üzerinde dayanır bu iletişim kuralı bir değişiklik açıklar. Nephrectomies sonra böbrekler nerede renal kapsül kaldırılır ve doku daha fazla disseke diseksiyon mikroskop aktarıldığı yaşam yetişkin fareler üzerinde gerçekleşir. Küçük 30½ G iğneler kesme aletleri kullanılır ve ayrıca diseksiyon içinde yardım kılavuzları gibi iğne çapı böbrek kesimleri hedef çapı eşittir. İzole, bu durumda fare, böbrek kesimleri canlılığı kültür korumak ve İskele-Alerjik endotel-fibroblast Hücresel yapıları19ile birleştirmek. Bu yapıları daha önce bir biyo-yapay pankreas20de dahil olmak üzere diğer organlara Mühendisi için kullanılmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan cerrahi işlemler aşağıda açıklanan kurumsal hayvan bakım ve Komitesi (IACUC), tıbbi University of South Carolina herhangi bir hayvan ameliyat öncesinde kullanın veya herhangi bir hayvan doku kullanımı tarafından kabul edildi.

1. fare nefrektomi

  1. Don bir ameliyat maskesi ve kabarık kapağı bulaşma riskini en aza indirmek için. Kısırlık cerrahi alan kurulum sırasında korumak.
    1. Delikli sigara cerrahi perdeler ameliyat masasında yerleştirin.
    2. Autoclaved aletleri steril örtüler üzerine Çantayı aç. Nefrektomi için gerekli aletleri 3 küçük hemostats dahil, iyi Forseps ile dişler, diş ve düz Iris makas olmadan iyi forseps.
    3. Başka bir delikli sigara cerrahi örtüsü ameliyat masasının ortasına yerleştirin.
    4. 5 mL, Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) kalsiyum ve magnezyum, % 1 penisilin/streptomisin bir 15 mL steril konik tüp ile takıma hazırlayın. Bu çözüm buz ameliyat masasının yanındaki yerleştirin.
  2. Bir 8-12 haftalık C57BL/6 fare (erkek veya kadın) hayvan konut kompleksi edinin.
  3. Bir anestezi indüksiyon odası içinde fareyi getirin ve inhale % 3,5 isoflurane ile teşvik. Bakım anestezi için % 2 isoflurane kullanarak fare, bir burun konisi yerleştirin.
    1. Anestezi pedal refleks (firma ayak tutam) değerlendirilmesi tarafından düzenli olarak cerrahi işlem boyunca yeterli derinliği için monitör.
  4. Tüm saç saç dökücü krem kullanarak ventral gövde kaldırmak. Bu alan tüm saç karından kaldırıldığından emin olmak için distile su ile durulayın.
  5. Fare steril ameliyat masasının en iyi sigara delikli örtü altında sırtüstü pozisyonda aktarın. Sadece fare karın örten örtüsü içinde 2 x 2 cm2 fenestrasyon kesip.
  6. Povidone-iyot steril gazlı bez veya pamuk topları kullanarak karın % 70 etanol tarafından takip uygulanır.
  7. Diş ve iris ile iyi forseps kullanarak makas, 3-4 cm dikey karın cilt kesi orta hat, orta hat solundaki 0.5 cm paralel yapmak
    Not: Sağ böbrek kaldırmaya çalışan, bu bir kesik orta hat sağındaki 0.5 cm olacaktır.
    1. Diş olmadan iyi Forseps ile karın zarını kavramak ve karın boşluğuna girmek için Iris makasla deşmek. Hemostats üst ve AST yan kenarları deri ve gerginlik yanal yerleştirin ve pozlama geliştirmek için karın zarını için geçerlidir.
    2. Bağırsak içeriği ince sol böbrek ortaya çıkarmak için karın sağ tarafına kayması. Yavaşça dışarı karın yükseltmek için böbrek çekiş yerleştirin.
    3. Bir hemostat sol böbrek hilusu arasında yerleştirin. Iris makas Üreter ve böbrek damarlarının transect için kullanın.
    4. Sol böbrek % 1'yer penisilin/streptomisin DPBS çözüm buz üzerinde.
    5. Steril doku kültürü hood için böbrek içeren tüp aktarın. Böbrek 15 mL konik tüp sizden bir 60 mm petri kabına (şekil 1) aktarın. Durulama iki kez 5 mL DPBS kalsiyum ve magnezyum ile kullanma. 5 ml DPBS 60 mm tabak içinde askıya böbrek tutun.
      1. Bir ek 60 mm petri kabına 5 mL mikrodiseksiyon iletişim kuralı sırasında kullanılmak üzere DPBS ile hazırlayın.
    6. Fareyi Torakotomi ve böbrek, ihale takip kan kaybı tarafından onaylanmış bir IACUC hayvan protokole göre ötenazi.

2. fare böbrek mikrodiseksiyon böbrek Segment yalıtım için

  1. Steril eldiven, cerrahi maske, dahil olmak üzere iletişim kuralı, bu kısmı için steril tekniği kullanmaya devam etmek ve kabarık bulaşma riskini en aza indirmek için.
    1. De sadece sol alanları ve aletler için steril bir alanınız için mikroskop sağ stereo mikroskop platformda yer steril perdeler. Mikroskop odak kolları plastik yapışkan levhalar yerleştirin ve % 70 etanol ile sprey. Sahne ışığı çift boynu ışığı açın.
    2. (İyi forseps olmadan diş, neşter kolu, #15 neşter bıçak, iki düz hemostats, iki 30½ içi boş-geçişli iğneler ölçmek) açık steril aletler steril örtüler üzerine. Yer #15 bıçak neşteri üzerine baş ve bir hemostat her iğne adaptör/iğne diseksiyon aletleri daha sonra kullanmak, şekil 1' de gösterildiği gibi oluşturmak için hub ekleyin.
  2. 60 mm petri yemekler, bir böbrek DPBS ve doku kültürü hood mikroskop alanına gelen diğer tek DPBS içeren taşımak.
    1. Amaç altında 60 mm petri kabına yerleştirin ve böbrek ortaya çıkarmak için kapağı kaldırın. DPBS içeren çanak tarafına daha sonra kullanmak için steril alanına bırakın.
    2. Sadece ön veya arka yüzey böbrek görünümünde (Yani, böbrek, büyük düz yüz çanak alt dokunmadan diğer yüzü) çanak taşımak. Yordamı bu kısmı için 3.2-4 x zoom. Sigara dominant el kullanarak, diş olmadan iyi forseps işlemek ve böbrek böbrek inferior ve superior yakın çanak karşı pin için kullanın.
    3. Sigara dominant el böbrek yıkmaya tutmak. Dominant el ile yarı saydam fibröz kapsül katman maruz yüzeyden kaldırmak için #15 bıçak kullanın. Böbrek kapsülü kalanı kaldırmak için maruz yüzeyinden en yüzeysel 0,5 mm tıraş.
    4. #15 bıçak doku decapsulated bölgeden yaklaşık 2 mm3 ' te boyutu bir ters piramit incelemek için kullanın. Sadece DPBS içeren 60 mm yemek almak ve doku piramit temiz tabak yerleştirin. Böbrek kalanını atmak.
    5. 1.5-2.0 x diseksiyon kalanında büyütmeyi azaltma. Doku parçaları veya iğne ipuçları çapı eşit olana iki hemostat iğneli aracı kesme aletleri kullanarak, doku parçası giderek daha küçük parçalar halinde dilim. Bir böbrek doku 2 mm3 ' te boyutu 50'den fazla segmentleri bir kez tamamen disseke üretecektir.
    6. Böbrek kesimleri ile 60 mm çanak için doku kültürü hood taşıyın. DPBS 1000 µL pipet ile kaldırın. 5 mL DMEM, % 10 Fetal sığır Serum (FBS) ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş ekleyin.
    7. Kültür için bir kuluçka makinesi veya cep içine implant 37 ° C'de 3 gün hemen oluşturur.

3. böbrek Segment hücresel yapı imalat

  1. Kültür normal insan dermal fibroblastlar (NHDF) ve insan yağ mikrovasküler endotel hücreleri (HAMEC) 7.2 x 105 fibroblastlar ve 1.8 x 10 istenen yapı başına5 endotel hücre elde etmek birkaç hafta için. Doku kültürü başlık, fibroblastlar endotel hücreleri (4: çubuk şeklinde kuyu 1) daha önce Czajka tarafından açıklandığı gibi önceden iskele-Alerjik damar endotel fibroblast yapıları (SPEC) oluşturmak için özel kalıplar uygun oranını tohum ve ark 19.
  2. Steril bir hemostat, 30½ G iğne ve yassı ucuyla steril bir spatula elde edilir.
    1. Medya çoğunluğu renal kesimleri değil Aspire edin ve böbrek parçalarını kaldırmak için dikkatli olmak, içeren 60 mm plaka kaldırmak.
    2. Segmentleri implantasyonu görselleştirmek için cerrahi büyüteçler donatmak.
    3. Spatula yavaşça boyunca 10-15 parçaları elde etmek için spatula çok uç eşit olarak yayılmış için 60 mm çanak alt sonu kazı. Spatula ucu nerede SPEC seribaşı iyi dudak mümkün olduğunca yakın yerleştirin.
    4. Bir hemostat-30½ G iğne aleti diğer elinde her bireysel segmenti spatula ucundan kuyu kenarına taşımak için kullanın. Yavaşça her kesimi de biraz daha önce numaralı seribaşı hücresel süspansiyon batık kadar iğne ucu kullanarak içine aşağı taşıyın.
    5. Kültür böbrek segment-SPEC 2:1:1 oran FGM-2/EGM-2/DMEM orta (2.5 mL cilt toplam). Kültür medya her 24 h 3 gün boyunca değiştirin. 72 h kalıpları yapıları kaldırmak ve tamir veya flash-işleme için dondurma.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Açıklanan protokol piramit 2 mm3 bölüm böbrek dokusunun başına yaklaşık 50 böbrek kesimleri üretir. İşlenmiş ve yansıma böbrek kesimleri (bkz. Şekil 2) farklı oranlarda borulu ve glomerular bileşenleri var. Sağlam kesimleri bir tahlil için üç gün boyunca farklı kesimleri bir kez her 24 h canlılığı belirlemede tabi tutuldu. Yeşil-floresan calcein-AM ile hücre içi Esteraz etkinliğini, canlı hücreler gösterge mevcut...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Böbrek doku yapıları hücrelerin ve Biyomalzeme kullanılan ve birçok durumda, her iki türü ile ilgili olarak değişkenlik yaşayan mühendis için kullanılan bir yöntem modası geçmiş ya da iyi edebiyat7karakterize. Çok kök hücre yaklaşımlar kullanıyorsanız veya böbrek mimarisinin izolasyon bireysel bileşenlerine recapitulating, yapay olarak hücresel kullanılamaz hale gelen 26 farklı farklı hücre tipleri ile tüm organ yeniden olasılığı sırasında 2...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

NIH kurumsal doktora sonrası eğitim desteği, NIH-HL-007260

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Non-fenestrated Sterile FieldBusse Hospital Disposables696
Fenestrated Sterile FieldBusse Hospital Disposables697
Halsted Mosquito Forceps 5 CurvedMiltexMil-7-4"Hemostat" in manuscript
Extra Fine Graefe Forceps, Curved with teethFine Science Tools11155-10Fine forceps with teeth
Extra Fine Graefe Forceps, Serrated (without teeth)Fine Science Tools11152-10Fine forceps without teeth
Fine Scissors - Tungsten CarbideFine Science Tools14568-09Iris Scissors
Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5%Purdue Products L.P.67618-151-17
Sterile Cotton Gauze Pad (4" x 4")Fisher Healthcare22-415-469
Dulbecco's Phosphate Buffered SolutionCorning21-030-CV
Penicillin/Streptomycin Solution, 100XCorning30-002-Cl
Isoflurane, USPManufacturer: Piramal, Distributor: McKesson2254845
Nair Hair RemoverNair22600-23307Hair Removal Cream in text
200 Proof EthanolDecon Laboratories2705Diluted to 70% Ethanol Solution
BioLite 60mm Tissue Culture DishThemo-Scientific130181
Press'n SealGlad12587-70441Applied to Stereoscope
SZX16 Stereo MicroscopeOlympusSZX16
Fiber Optic IlluminatorCole Parmer41720-20
Self-Supporting Dual-Light Pipe, 23" L GooseneckCole ParmerEW-41720-60
Scalpel Handle #3MiltexMil-4-7
Sterile Rib-Back Carbon Steel Blade, Blade Size 15Bard-Parker371115
31 1/2 Gauge NeedleThermoFisher Scientific14-826FBecton Dickinson 305106
Dulbecco's Modified Eagle's MediumCorning10-017-CV
Fetal Select 100% Bovine SerumAtlas BiologicalsFS-0500-AD
Normal Human Dermal FibroblastsLonzaCC-2511
Human Adipose Microvascular Endothelial CellsSciencell Research Laboratories7200
Surgical Loupes (2.5x)Orascoptic(N/A) Custom Order
FGM-2 (Fibroblast Basal Medium with FGM-2 SingleQuots Added)LonzaCC-3131, CC-4126
EGM-2 (Endothelial Basal Medium with EGM-2 SingleQuots Added)LonzaCC-3156, CC-4176
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for Mammalian CellsThermoFisher ScientificL3224
Anti-Cytokeratin-18 AntibodyAbcamab668
Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 633ThermoFisher ScientificA-21052
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546ThermoFisher ScientificA-11010
Anti-Von Willebrand Factor AntibodyAbcamab6994
Albumin, Fluorescein isothiocyanate ConjugateSigma AldrichA9771-50MG
Hoescht 33342BD Pharmingen561908
Background BusterInnovex BiosciencesNB306

Referanslar

  1. Jha, V., et al. Chronic kidney disease: global dimension and perspectives. Lancet. 382 (9888), London, England. 260-272 (2013).
  2. 2016 USRDS Annual Data Report: Epidemiology of Kidney Disease in the United States. U.S.R.D. , Available from: https://www.usrds.org/2016/download/v2_ESRD_16.pdf (2016).
  3. Hart, A., et al. OPTN/SRTR 2015 Annual Data Report: Kidney. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 17, Suppl 1 21-116 (2017).
  4. de Vries, E. F., Rabelink, T. J., van den Hout, W. B. Modelling the Cost-Effectiveness of Delaying End-Stage Renal Disease. Nephron. 133 (2), 89-97 (2016).
  5. Lefebvre, P., Duh, M. S., Mody, S. H., Bookhart, B., Piech, C. T. The economic impact of epoetin alfa therapy on delaying time to dialysis in elderly patients with chronic kidney disease. Disease management : DM. 10 (1), 37-45 (2007).
  6. Mennini, F. S., Russo, S., Marcellusi, A., Quintaliani, G., Fouque, D. Economic effects of treatment of chronic kidney disease with low-protein diet. Journal of renal nutrition : the official journal of the Council on Renal Nutrition of the National Kidney Foundation. 24 (5), 313-321 (2014).
  7. Moon, K. H., Ko, I. K., Yoo, J. J., Atala, A. Kidney diseases and tissue engineering. Methods. 99, San Diego, Calif. 112-119 (2016).
  8. Wobma, H., Vunjak-Novakovic, G. Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2015: A Year in Review. Tissue engineering. Part B, Reviews. 22 (2), 101-113 (2016).
  9. Langer, R., Vacanti, J. Advances in tissue engineering. Journal of pediatric surgery. 51 (1), 8-12 (2016).
  10. Jakab, K., et al. Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 022001(2010).
  11. Fisher, M. B., Mauck, R. L. Tissue engineering and regenerative medicine: recent innovations and the transition to translation. Tissue engineering. Part B, Reviews. 19 (1), 1-13 (2013).
  12. Stewart, D. E., Garcia, V. C., Rosendale, J. D., Klassen, D. K., Carrico, B. J. Diagnosing the Decades-Long Rise in the Deceased Donor Kidney Discard Rate in the United States. Transplantation. 101 (3), 575-587 (2017).
  13. Mohan, S., et al. The weekend effect alters the procurement and discard rates of deceased donor kidneys in the United States. Kidney international. 90 (1), 157-163 (2016).
  14. Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34 (24), 5915-5925 (2013).
  15. Katari, R., et al. Renal bioengineering with scaffolds generated from human kidneys. Nephron. Experimental nephrology. 126 (2), 119(2014).
  16. Kim, S. S., Park, H. J., Han, J., Choi, C. Y., Kim, B. S. Renal tissue reconstitution by the implantation of renal segments on biodegradable polymer scaffolds. Biotechnology letters. 25 (18), 1505-1508 (2003).
  17. Guimaraes-Souza, N. K., Yamaleyeva, L. M., AbouShwareb, T., Atala, A., Yoo, J. J. In vitro reconstitution of human kidney structures for renal cell therapy. Nephrology, dialysis, transplantation : official publication of the European Dialysis and Transplant Association - European Renal Association. 27 (8), 3082-3090 (2012).
  18. Kelley, R., et al. Tubular cell-enriched subpopulation of primary renal cells improves survival and augments kidney function in rodent model of chronic kidney disease. American journal of physiology. Renal physiology. 299 (5), 1026-1039 (2010).
  19. Czajka, C. A., Drake, C. J. Self-assembly of prevascular tissues from endothelial and fibroblast cells under scaffold-free, nonadherent conditions. Tissue engineering. Part A. 21 (1-2), 277-287 (2015).
  20. Rhett, J. M., Wang, H., Bainbridge, H., Song, L., Yost, M. J. Connexin-Based Therapeutics and Tissue Engineering Approaches to the Amelioration of Chronic Pancreatitis and Type I Diabetes: Construction and Characterization of a Novel Prevascularized Bioartificial Pancreas. Journal of diabetes research. 2016, 7262680(2016).
  21. Al-Awqati, Q., Oliver, J. A. Stem cells in the kidney. Kidney international. 61 (2), 387-395 (2002).
  22. Aboushwareb, T., et al. Erythropoietin producing cells for potential cell therapy. World journal of urology. 26 (4), 295-300 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendisliksay 133mikrodiseksiyonb brekdoku M hendisli i yapb brek yapiskele Alerjikdoku M hendisli ibirincil b brek doku

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır