Modüle ve kök hücre sunmak için elektriksel olarak iletken iskele

Özet

Bu iletişim kuralı bir iletken polimer iskele vitro elektriksel stimülasyon ve kök hücre numaralı seribaşı iskele kullanarak sonraki vivo içinde implantasyon için üzerinde kök hücrelerin tohum izin vermek için bir hücre kültür sistemi imalatı açıklar bir minimal invaziv tekniği.

Özet

Kök hücre tedavisi heyecan verici bir kontur olarak terapötik çıkmıştır ama en uygun Teslimat yöntemi belirsizdir. Mikroenjeksiyon tekniği kök hücre kontur modellerinde sunmak için yıllardır kullanılan iken, bu teknik enjeksiyon önce kök hücre işleme yeteneği eksikliği ile sınırlıdır. Bu kağıt bir elektriksel olarak iletken polimer iskele kök hücre teslim için kullanma yöntemi ayrıntıları. Bir iletken polimer iskele kullanarak kök hücrelerin elektriksel stimülasyon kök hücrenin genler hücre hayatta kalma, inflamatuar yanıt ve sinaptik remodeling yer değiştirir. Elektrik Önkoşullanma sonra iskele üzerinde kök hücre intracranially distal orta serebral arter tıkanıklığı sıçan modelinde nakledilen. Bu iletişim kuralı bir iletken polimer iskele üzerinden kök hücre işlemek için güçlü bir teknik anlatılmaktadır ve daha fazla kök hücre tabanlı terapisi geliştirmek için yeni bir araç oluşturur.

Giriş

İnme dünyada ölüm ikinci önde gelen nedenidir ve ölüm beşinci önde gelen nedenidir Amerika Birleşik Devletleri olduğunu. Bu yüksek ölüm oranlarını rağmen tedaviler inme kurtarma için şu anda bir sorun yok uygun tıbbi seçenekler mevcut¹kalır. Orada şu anda yaklaşık 300 klinik çalışmalarda hangi kök hücreler sadece 40 kullanmak iskemik inme ile ilgili. Önceki çalışmalarda kök hücre tedavileri kontur onarım^2,3üzerinde yararlı bir etkisi olduğunu ortaya koymuştur. Parakrin faktörler beyin kaynaklı Nörotrofik faktör (BDNF) ve Transplante insan nöral progenitör hücre (hNPCs) yayımlanan trombospondin-1 (THBS-1) gibi bir artış ile ilgili mekanizmalar yoluyla geliştirilmiş fonksiyonel iyileşme göstermiştir oluşumu, anjiogenez, dendritik dallanma ve yeni aksonal projeksiyonlar sinaps gibi bağışıklık sistemi^4,5,6modülasyonlu. Ancak, kök hücrelerin en uygun teslimat yöntemlerinin zor kalır.

Başarılı kök hücre teslim beyin için bir meydan okuma olarak kalır. Şu anda, enjekte edilebilir hidrojel ve polimerik İskele sistemleri kök hücre sunmak için getirilmiştir. Bu teslim yöntemi kök hücre nakli sırasında korumak hem de ana bilgisayarın inflamatuar yanıt ve hipoksik koşullar^7,8,9 gibi sert inme sonrası çevre koruma ^{, 10}. ancak, en yaygın olarak kullanılan malzemeler hangi hücreleri¹¹sürekli Modülasyon (Yani, elektriksel stimülasyon) kısıtlar etkisiz,. Elektriksel stimülasyon farklılaşma, iyon kanal yoğunluğu ve kök hücre¹²neurite akıbet etkiler bir ipucudur. İnert polimerler ile karşılaştırıldığında, elektriksel stimülasyon ve kök hücre²manipülasyon için geçerli bir izin iletken polimerler taşıyabilir. Ancak, hangi tarafından Nörotrofik faktör sürümü (Yani, BDNF ve THBS-1) elektriksel stimülasyon modüle kesin mekanizması hala tam keşfedilmeden.

Bu protokol için bir iletken polimer iskele, vitro için elektriksel stimülasyon sağlar polypyrrole (PPy), oluşan bir hücre kültür sistemi oluşturmak için adımları açıklar. Hangi hücre kültür sistemi fabrikasyon olduğunu şekilde nedeniyle, peri-enfarktüsü korteks üzerine kök hücre numaralı seribaşı iskele sonraki implantasyonu mümkündür. Bu sistem için biz elektrikle kök hücre iskele üzerinde kısa bir süre önce implantasyon için yaygõn. Elektriksel stimülasyon hücreleri taşıyan iletken polimer iskele intracranially minimal invaziv bir yöntem kullanarak başarılı bir şekilde yerleştirilir.

Protokol

Tüm kök hücre ve hayvan yordamlar Stanford'un kök hücre araştırma Gözetim Komitesi tarafından ve laboratuvar hayvan bakım (SCRO-616 ve APLAC-31909) Stanford Üniversitesi'nin Yönetim Panel tarafından kabul edildi.

1. gravür Ito cam

1. İndiyum kalay oksit (ITO) hazırlamak-cam iletken yan tarafa bir maskeleme ajanı yerleştirerek kaplı cam kaymak.
   Not: Çoğu ticari şeffaf bantlar bir maskeleme ajanı olarak kullanılabilir.
   1. Bir bıçak kullanarak aşırı maskesi kaldırmak için yalnızca istediğiniz şekli son ITO tasarım bırakarak cam kaplı.
2. Nitrik asit (v/v) %5 ve % 45'i (v/v) HCl bir duman başlık içinde bir cam ölçek büyütme çözüm hazırlamak için birleştirir.
   1. Çözüm aşındırma sıcaklık 70 ° C'de korunur emin olmak için elektrikli Ocak ve bir termometre kullanın
3. 70 ° C Dağlama çözüm ulaştıktan sonra maskeli-ITO cam slayt 2 dakika fazla ITO kat kaldırmak çözüm içine yerleştirin.
   Not: Bant maskeleme asit solüsyonu maruz ITO katman korur.
4. Slayt çözümden kaldırmak ve deiyonize (DI) H₂ile O. durulayın
5. Kalan ITO sağlam olduğundan emin olmak için bir multimetre kullanarak maske ve ölçü direnç dikkatli bir şekilde çıkarın. Sonuçlar istenilen kazınmış alanının yaklaşık 0 Ω olmalıdır.

2. Pyrrole çözüm hazırlanması

1. 1000 mL cam şişe 70 g sodyum dodecylbenzenesulfonate (NaDBS) 600 mL DI H₂O. geçiyoruz.
2. Bir kez NaDBS çözülür, 14 mL 0,2 M pyrrole ve DI H₂O 386 mL ekleyin.
3. Alüminyum folyo ile çözüm kapak ve 4 ° C'de depolayın

3. galvanik Polypyrrole ITO camına,

1. NaDBS tamamen redissolved kadar oda sıcaklığında pyrrole çözümünü sıcak.
   Not: Bu yaklaşık 15-20 dakika sürer.
2. 25 mL pyrrole çözeltisi bir kabı dökün.
3. Kazınmış ITO cam için bir multimetre bağlanmak ve slayt pyrrole çözüm içine daldırın.
   1. 0 Ω direnci ile yüzün Platin kafes referans elektrot doğru dönük olduğundan emin olun.
4. Bir elektrik akımı bir multimetre (3 mA/cm² ' de 4 saat boyunca kontrollü akım) kullanarak ITO yüzeyinde PPy galvanik başlatmak için geçerlidir.
5. ITO cam multimetre ve yıkama alaşımlı-PPy kalan yüzey aktif kaldırmak için DI H₂O kaldırın.
6. Yavaşça bir jilet kullanarak ITO cam alaşımlı PPy tabaktan ayırın.
   1. PPy plaka oda sıcaklığında saklayın.

4. Polydimethylsiloxane (PDMS) hazırlanması

1. Bir spatula ve tartmak çanak kullanarak, temel Aracısı 18 g kür Ajan 2 g ile mix ve iki 10 cm x 8 cm cam kalıpları içine karışımı dökün.
2. Kabarcıklar vakum odası 15-20 dakika kullanarak kalıplar kaldırın.
3. Kalıpları 3 h 70 ° C fırında yerleştirin.
4. Soğutmalı sonra düz bir spatula PDMS kalıpları kaldırmak için kullanabilirsiniz.

5. Vitro elektriksel stimülasyon odası imalatı

1. Otoklav metal levhalar (WxL, 2.5 cm x 12,5 cm) ve akışı vanalar 120 ° C'de 1 saattir.
2. Odası slayt şablon olarak kullanıp, iki adet PDMS kesti.
   Not: Tek parça PDMS hücre odası çevre kesik iki bitişik kareler içinde hücre odası ile hizmet vermektedir. Diğer PDMS odası 's çevre bir taslağını parçasıdır.
   1. Kesmek iç hücre odası böylece kare şeklinde ve hücre odası şeklinde eşleşir. PDMS iki adet genel şekli dikdörtgen ve odası slayt uygun emin olun.
3. Malzeme--dan dip aşağıdakine üst olarak katman: (1) Metal plaka, (2) PDMS (olmadan kesik), (3) PPy plaka (PDMS için dikey), PDMS (4) (ile kesik) ve (5) hücre odası.
4. Bir kez tam olarak hizalanır aparatı birlikte kelepçe.
5. Bir metal tel iki 60 cm parçalar koparıp ve gümüş hamur odası dışarıdan protrudes PPy plaka her sonu için bir kablo bağlamak için kullanın. Teller cihaz bir kuluçka dışa doğru genişletmek yeterince uzun olduğundan emin olun.
6. Bir kez gümüş Yapıştır tedavi güçlendirmek ve epoksi ile tel bağlantı mühür.
   1. Direnç uygulanan alanını her odasında aynı olduğundan emin olmak için bir multimetre kullanarak kaydedin.
   2. İmplantasyon için kabloları çıkarın; hücre odaları unclamp ve iletken iskele PDMS ve sonra onları ayrı. İmplante iskele yaklaşık 1 x 3 x 0,25 mm boyuttur.

6. insan nöral progenitör hücre (hNPCs) PPy kaplama

1. UV ışık altında birleştirilmiş chambers sterilize etmek için 2 saat.
   1. 1 saat sonra monte döndürün 90 ° Odaları.
2. Sterilizasyon sonra PPy odası alt kaplama substrat 800 µL ile yüzey kat ve 1 h için % 5 CO₂ 37 ° C'de bir kuluçka PPy tabakta kuvvetlendirmek belgili tanımlık substrate sağlar.
3. 1 saat sonra süpernatant odaları kaldır ve yavaşça DPBS + Ca + Mg 1 mL de başı ile durulayın.
   Not: Bu kaplama substrat dekolmanı neden olur gibi zorla PPy yüzey yıkama kaçının.
4. Taze hücre medyayı kullanarak, mekanik olarak kültürlü hücreler nazik pipetting ile doku kültürü plaka chambers ile kullanmak için ayırmak.
   Not: Hücreleri % 90-100 birleşmesi ayrılma üzerine olmalıdır.
5. Santrifüjü kullanarak de 8000 x g 5 dakika hNPC granül toplamak.
6. Bir hemasitometre kullanarak, say ve hücreleri 100.000 hücreler/cm²ses seviyesinde resuspend.
7. Her odaya iyi (100.000 hücreler/cm² ' medya 1 mL) 100.000 hücreleri plaka.
8. Kuluçka makinesi %5 37 ° C'de Chambers dönmek CO_2.

7. elektrik hNPCs uyarılması

1. Bir gün chambers, hücrelerdeyse tohum sonra bir dalga formu jeneratör elektrik stimülasyonu hücrelere uygulamak için kullanın.
2. Stimülasyon önce eski medya de her odasından kaldırın ve taze medya 800 µL ile doldurmak.
3. Medya değiştirildikten sonra odaları da kuluçka yerleştirin, kuluçka makinesi dışında teller genişletmek ve onları bir dalga formu jeneratör takmak
4. Bir kare dalga sinyali için 1 h 100 Hz ile ±400 mV, hücrelerle stimülasyon uygulanır.
5. Stimülasyon sonra kabloları çıkarın ve odaları ile % 5 CO₂37 ° C'de ayarla bir kuluçka başka bir gün için kuluçkaya.
6. Hücre canlılığı ve nicel gerçek zamanlı Polimeraz zincir tepkimesi (PCR qRT) üreticinin protokol sonrası dahil olmak üzere sonraki biyolojik çözümlemesi gerçekleştirin.

8. içinde Vivo PPy implantasyon

1. Distal orta serebral arter (dMCA) tıkanıklığı felç modelleri T hücre eksikliği üzerinde gerçekleştirmek yetişkin erkek çıplak rats (NIH-RNU 230 ± 30 g) olarak açıklanan daha önce². İmplantasyon bir hafta sonrası dMCA tıkanıklığı gerçekleştirin.
2. Bir gün önce ameliyat, onların kafes suda sıçanlar için Ampisilin (1 mg/mL) ver.
3. Fareyi kullanarak bir indüksiyon odası içinde anestezi 0.5 - % 3 mg/kg isoflurane inhalasyon yolu ile yönetilen.
4. Anesthetization farenin burun çimdik refleks yanıt alınamaması tarafından onaylayın.
   1. Hayvan anestezi altında olmakla birlikte, onun membran renk, nefes desen ve rektal sıcaklık 15 dakikada izlemeye devam edin.
5. Anesthetization onayladıktan sonra suni gözyaşı kuruluğu önlemek için fare gözünü uygulanır.
6. Aseptik teknik steril eldiven ve steril cerrahi örtüsü¹³kullanarak bu yordamı sırasında korunur emin olun. Steril cerrahi aletlerin steril alan içinde tutun.
7. Fareyi anestezi altında olmakla birlikte, kraynektomi yukarıda sol korteks matkap. Beyin zarı açın.
   1. Dura mater beyin cerrahi mikro-ince iğne kullanarak kaldırın.
8. Sıçan korteks vitro sisteminden iletken iskele implant.
   Not: bizim deneyler için iskele vitro gün 3 hNPC kaplama sonra implante.
   1. İmplant öncelikle halkalı korteks üzerinde medial kontur lezyon için yerleştirin.
9. İskele yerleştirildikten sonra surgicel hareket cilt kapatma ile önlemek için implant üzerine getirin.
10. Yara kapa ve subkutan buprenorfin SR, stereotaksik cerrahi ve dMCA tıkanıklığı ile ilgili ağrı yönetmek için 1 mg/kg doz ile farelere enjekte dikiş.
11. Bilinci yerine gibi fare kurtarma kafese koyun.
    1. Asla baygın durumdayken hayvan çalıştırın.
    2. O tamamen bilinç kazanmıştır kadar başkaları ile hayvan koymayın.
12. Hayvanlar günlük vücut kilo kaybı, düşük gıda/su alımı, azaltılmış bakım/dağınık ceket, spontan aktivite azaldı/arttı, anormal postür, dehidratasyon/cilt çadır, batık gözler, gizleme, öz sünneti de dahil olmak üzere ağrı belirtileri için izlemek, Hızlı solunum, açık ağızlı nefes, seğirmesi, titreyen, tremor ve seslendirme.
    1. Onlar yeme, içme, damat ve kilo olduğunu görünene kadar hayvanlar her gün izlemek; ve sonra haftalık sonra kilo.
13. CO₂ inhalasyon ve euthanization (hayvan değil normal oksijen kaynağı yazı CO₂ inhalasyon nedeniyle canlandırmak sağlamak için) bir ikincil onay ile erken euthanization içme yemek değil, görünür herhangi bir hayvan gerçekleşir ve ilk cerrahi işlem sonrası kilo; acı içinde görünür; veya davranış testleri büyük bir motor korteks açığı beklenenden daha nedeniyle tamamlayamadı görünür.

Sonuçlar

Şekil 1 ' de gösterilen şematik genel iş akışını hNPCs ve potansiyel aşağı akım uygulamaları elektriksel stimülasyon ve temsil eder. Bir geçerli kök hücre tedavisi, kök hücre iltihabı ve iskemik koşulları gibi sert bir sonrası nakli ortamına maruz kısıtlamadır. Bu zor koşullar büyük olasılıkla onların tedavi edici etkinliği^14,15sınırlayın. Bu ortamdan hNPCs korumak...

Tartışmalar

Kanıt büyüyen kök hücre vaadi bir roman kontur terapi olarak göstermiştir. Bu söz kök hücre therapeutics yatağımın en az 40 tamamlanmış veya devam eden klinik çalışmalar ile ilerlemek için önemli bir çalışma sonuçlandı. Kontur patoloji çünkü akut hakaret sonra kurtarma engelleyen hiçbir nörodejeneratif işlem ödünç vermek kendisi için kök hücre tedavisi benzersiz bir nörolojik bozukluk sunmaktadır. Kök hücre gelişmiş inme kurtarma tam mekanizmasının belirsizdir. Anjiogenez, syn...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
FGF-Basic	Invitrogen	CTP0261	20 ng/mL for working media
Matrigel	Corning	cb40234a	1:200 dilution
LIF Protein, Recom. Hum. (10 µg/mL)	EMD Millipore	LIF1010	10 ng/mL for working media
Sylgard 184 silicone 3.9 kg	Fisherbrand	NC0162601
Hydrochloric acid	Fisherbrand	SA56-4
Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical	Fisherbrand	SA95
ITO Glass	Delta Technologies	CG-40IN-0115
Sodium dodecylbenzenesulfonate	Sigma	289957-1KG
Pyrrole	Sigma	131709-500ML	Protect pyrrole solution from light and room temperature
8 well glass slide chambers	Thermo Sci Nuc	125658	Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions
Flat-Surface Bracket, 3"x1"	McMaster-Carr	1030A4
TWO PART SILVER PAINT 14G	Electron Microscopy Sciences	1264214	Mix two parts (1:1) in plastic plate
DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red	Genesse	25-508C
AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit	Aruna Biomedical	ABNS7013.2
hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit	Aruna Biomedical	hNP7013.1
Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32" to 5/8" Tube OD	McMaster-Carr	5330K22
Multimeter	Keysight	E3641A
Wavefoam generator	Keysight	33210A-10MHz
Pt meshes	Sigma-Aldrich	298107-425MG	Reference electrode with dimensions, 1x1 cm
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells	Thermo Fisher Scientific	L3224
BDNF	Thermo Fisher Scientific	Hs02718934_s1
THBS1	Thermo Fisher Scientific	Hs00962908_m1
GAPDH	Thermo Fisher Scientific	Hs02758991_g1
RNeasy Mini Kit (250)	Qiagen	74106
QIAshredder (250)	Qiagen	79656
RNase-Free DNase Set (50)	QIAGEN	79254
iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 µL rxns	BIORAD	1708891
TaqMan Gene Expression Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4369510
7-8 Week Old, male, RNU Rats	NCI-Frederick
4-0 Ethicon Silk Suture	eSutures.com	683G
Isoflurane	Henry Schein	29405
V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System	VetEquip	901806
Surgicel Original Absorbable Hemostat	Ethicon	1952
Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat	Stoelting	51600
Kimberly-Clark Professional Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves	Fisherbrand	19-063-130
Sterile Drape	Medline	DYNJSD1092
Thermo Scientific Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades	Fisherbrand	53-34
Walter Stern Scalpel Blade Series 300	Fisherbrand	17-654-456
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	4484642
Frazier Micro Dissecting Hook	Harvard Apparatus	52-2706