JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu yazıda, Xenopus laevis Kurbağa yavrularını retinotectal devre eğitim için tüm cep telefonu yama kelepçe kaydetmek için kullanılan üç beyin hazırlıkları görüşmek. Kendi belirli avantajları ile her hazırlık Xenopus iribaş deneysel tractability nöral devre işlevi incelemek için bir model olarak katkıda bulunmaktadır.

Özet

Hangi formu synapses doğrudan üzerine nöronlarda optik tectum göz retina ganglion hücrelerinin (RGCs) oluşan Xenopus iribaş retinotectal devre nasıl sinir devreleri çalışma popüler modelidir kendini topla. Bütün taşıma yeteneği yama kelepçe kayıtları tectal nöronlar ve RGC uyarılmış yanıt, ya da içinde vivo hücre veya tüm beyin hazırlık kullanarak büyük bir vücut, normal yatan mekanizmaları yüksek çözünürlüklü verilerin üretti ve anormal, devre oluşumu ve işlev. Burada nasıl vivo içinde hazırlık, özgün tüm beyin hazırlık gerçekleştirileceğini açıklar ve daha yakın zamanda yatay beyin dilim hazırlık tectal neurons tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları elde etmek için geliştirilmiştir. Her hazırlık benzersiz deneysel avantajları vardır. Vivo hazırlık tectal nöronlar doğrudan yanıt göz yansıtılan görsel uyaranlara karşı kayıt sağlayan. Tüm beyin hazırlık için son derece kontrollü bir şekilde var olmak harekete geçirmek RGC akson, ve yatay beyin dilim hazırlık kaydından tectum tüm katmanları arasında sağlar.

Giriş

Retinotectal devre amfibi görsel sisteminin önemli bileşenidir. Hangi onların aksonlar optik tectum nerede postsinaptik tectal nöronlar ile sinaptik bağlantıları oluşturmak için proje RGCs gözünde, oluşur. Xenopus iribaş retinotectal devre nöral devre oluşumu ve işlev eğitim için popüler bir gelişim modelidir. Bu kurbağa'nın retinotectal devrenin bir güçlü deneysel model1,2,3render birçok özniteliği vardır. Bir büyük öznitelik ve odağı bu makalenin tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları tectal nöronlar, içinde VIVO veya tüm beyin hazırlık kullanarak yürütmek için yeteneği var. Gerilim ve akım kayıt modları kelepçe destekler bir amplifikatör ile donatılmış bir Elektrofizyoloji sondaj platformu ile tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları bir nöron'ın Elektrofizyoloji yüksek çözünürlükte karakterize edilebilir izin verir. Sonuç olarak, tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları tectal nöronlar retinotectal devre oluşumu temel aşamaları boyunca geliştirme detaylı ve kapsamlı bir anlayış ve plastisite içsel4,5 hazırladık , 6 , 7 ve sinaptik8,9,10,11 özellikleri. Tüm cep telefonu yama kelepçe tectal nöron kayıtları birleştirerek, genlerin veya morpholinos bu nöronların12ve kurulan görsel kaçınma testi13 ile görsel destekli davranışını değerlendirmek için bir yöntem ilgi ifade yeteneği teşvik molekülleri, devre fonksiyon ve davranışı arasındaki bağlantıları tanımlaması.

Tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları elde veri çünkü genetik kalsiyum göstergesi GCaMP6, gibi daha yeni görüntüleme yaklaşımları kullanarak mümkün değildir yüksek çözümleme türü bulunmakla birlikte kalsiyum göstergeler kullanarak görüntüleme verir unutmamak gerekir Kalsiyum dynamics büyük popülasyonlarda nöronların arasında aynı anda, orada hayır doğrudan veya özel elektrik parametreleri somata delta Floresans ölçerek elde edilebilir ve gerilim bir yolu yoktur belirgin şekilde kelepçe ölçmek için nöron akım-gerilim ilişkileri. Açıkça bu ayrı iki yaklaşım, Elektrofizyolojik kayıtlar ve kalsiyum görüntüleme, üst üste güçlü sahip ve farklı veri oluşturmak. Bu nedenle, en iyi yaklaşım belirli deneysel soru ele alınmaktadır bağlıdır.

Burada, biz tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları bir vivo içinde hazırlık, tüm beyin hazırlık, kullanarak iribaş optik tectum nöronlar edinme için bizim yöntem tanımlamak ve daha yeni bir14 bizim laboratuarımızda geliştirildi tüm beyin hazırlık modifiye . Temsilcisi sonuçları bölümünde her hazırlık ve elde edilebilir veri farklı türde deneysel avantajları göstermektedir. Sınırları ve güçlü ipuçları sorun giderme, yanı sıra farklı ürünleri bir tartışma bölümünde dahil edilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Wyoming Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Elektrofizyolojik kayıtlar da dahil olmak üzere tüm yordamları oda sıcaklığında yaklaşık 23 ° c yapılmaktadır Tüm yöntem tanımlamak burada tectal Kurbağa yavrularını gelişimsel sahne 42 ve (Neiuwkoop ve Faber15göre sahnelenen) 49 arasında neurons kaydetmek için optimize edilmiştir.

1. Vivo içinde hazırlık

  1. İribaş anestezi.
    1. İribaş % 0,01 ile Steinberg'ın solüsyon içeren küçük bir Petri kabına yerleştirin MS-222 yaklaşık 5 min için.
      Not: Ortak bir balık ve amfibi anestezik MS-222 aka "Tricaine" dır. Kurbağa yavrularını mM Steinberg'ın çözümde yetiştirilir: 0.067 KCl, 0,034 Ca (NO3)2•4H2O, 0,083 MgSO4•7H2O, 5.8 NaCl, 4.9 HEPES.
    2. Adım 2 için devam etmeden önce derin anaesthetized (non-yanıt veren ve artık yüzme) iribaş olduğundan emin olun.
  2. Anatomi/kayıt çanak yere batık silikon bloğu için imzalat iribaş güvenli.
    1. Harici kayıt solüsyon içeren bir diseksiyon/kayıt yemek anaesthetized kurbağa taşımak için tek kullanımlık transfer pipet kullanın (115 mM NaCl, KCl, 2 mM CaCl23 mM, 3 mM MgCl2, HEPES, glikoz; 1 mM 5 mM ayarlamak 7,25 kullanarak pH 10 N NaOH, Osmolarite 255 mOsm).
      1. Spontan kas en aza indirmek için twitches, asetilkolin reseptör engelleyici, tubocurarine (100 µM) harici çözüm için ekleyin. (Genellikle, bu bir 10 mM tubocurarine stokunun 100 µL harici çözüm 10 mL için eklemek için 200 µL pipet kullanarak yapılır).
    2. Böcek iğne kullanarak, kurbağa, dorsal tarafta, silikon elastomer batık bir blok için güvenli (Sylgard 184 gibi Malzemeler tablo Ayrıntılar için bakınız), hangi-var yapıştırılmış diseksiyon çanak yere.
      Not: Pimleri yerleşimini önemlidir: Proje göz beyin, afferent RGC akson impaling önlemek için yeterince Kaudal her iki tarafında yer onları ve optik tectum (şekil 1A) anterior beyin girin.
  3. Orta çizgi boyunca beyin fileto.
    1. Beyin net görebilmek için steril 25-G iğne kullanarak orta çizgi boyunca yüzeysel bir kesi yaparak beyni örten cilt kaldırın.
    2. İğne Nöral tüp içine yerleştirip hafifçe yukarı doğru (dorsally) öyle ki tüp dorsal kısmı temiz bir şekilde yere plaka sağlam (şekil 1B) bırakarak (parçalanmış) kesilir çekerek aynı orta çizgi ekseni boyunca beyin fileto.
      Not: Afferent duyusal girdiler tectum kat plaka girin çünkü Nöral tüp zemin plakası olduğu gibi bırakılması önemlidir.
  4. Tectal nöronlar kapakları şeffaf ventrikül membran kaldırın.
    1. Kayıt çanak Elektrofizyoloji teçhizat taşımak ve bir kırık cam pipet ucu tectal nöron hücre organları örten ventrikül membran kaldırmak için kullanın. Ucunu hafifçe narin görev silecek arasında sürükleyerek kır.
    2. Pipet pipet yuvasına vida ve optik tectum micromanipulator üzerinden aşağı indir.
    3. Tectum uzak ventrikül membran soyma için kırık pipet kullanın.
      Not: Membran tüm tectum kaldırmak için gerekli değildir. küçük bir pencere yeterli ve nöronlar bol erişim sağlar.
  5. Tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları elde etmek.
    Not: Bu aşamadan itibaren Segev, et al. açıklandığı gibi fare beyin dilimleri tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları taşımaya benzer bir yaklaşımdır 16 (Şekil 1C).
  6. Retina yansıtılan ışık tüm alanı parıltısı tectal nöron yanıtlarını kaydetmek.
    1. Tüm alan flaş ışık retina proje için bir optik fiber kurbağa'nın göz bitişik yerleştirin. Optik fiber diğer ucunda bir LED ışık parlaklığı denetlenmesini sağlar bir değişken direnç doğrultusunda olduğunu. Tetikleyici LED Dijital çıkış ile amplifikatör. Bu şekilde, tüm alanı değişen şiddetlerde ışık yanıp söner olabilir (şekil 4A) kaydedildi.

2. tüm beyin hazırlık

  1. 1.1-1,3 adımları gerçekleştirin.
    Not: Bu hazırlık için dış çözümde tubocurarine gereği yok.
  2. Beyin izole et.
    1. 25-G iğne (Şekil 2A) arka beyin sever için kullanın.
    2. İribaş bütün beyninden izole etmek için hafifçe beyinde tüm yanal ve ventral bag doku ve sinir lifleri koparmaya Kaudal-için-rostral bir yön altında iğne çalıştırın.
  3. Beyin silikon elastomer bloğu için güvenli.
    1. Tamamen serbest geldiğinde, silikon elastomer bloğu için beyin yanında duvar ilanı olfaktör ampuller biri aracılığıyla bir PIN ve arka beyin (Şekil 2B) aracılığıyla başka bir PIN güvenli. Bu kayıt tectal nöronlar için en uygun yapılandırmadır.
  4. Diseksiyon kapsamdan sabitlenmiş tüm beyin hazırlık Elektrofizyoloji teçhizat için içeren yemek taşımak. 1.4. adımda açıklandığı gibi bir kırık cam pipet kullanarak ventrikül membran kaldırın.
  5. İki kutuplu bir uyarıcı elektrot optik hemisferlerine (nerede her Eye'dan axon yolları orta çapraz) doğrudan RGC akson etkinleştirmek için yerleştirin.
    1. İki kutuplu uyarıcı elektrot rostral ve hemen hemen bitişiğinde, büyük orta ventrikül yerleştirin. Optik hemisferlerine hemen rostral büyük orta ventrikül (Şekil 2B) için yer alır.
      1. Böyle küçük bir göçük dokusunda oluşan yavaşça uyarıcı elektrot optik hemisferlerine indirin. İki kutuplu elektrot stimülasyon tam olarak kontrol edilebilir gücünü sağlayan bir darbe uyarıcı tarafından tahrik edilmektedir.
  6. Segev, et al. tarafından açıklandığı gibi bütün hücre yama kelepçe kayıt (Şekil 2C) gerçekleştirmek 16

3. yatay beyin dilim hazırlık

  1. 2.1-2,3 adımları gerçekleştirin.
  2. (Hangi vivo içinde karşılık gelen en dorsal dördüncü) en yanal dördüncü bir yüzünün bir optik tectum tüketim için jilet kullanın. # Bu parçayı şekil 3' teAgösterilen Kaudal rostral uçağa paralel yapılmıştır.
  3. Silikon elastomer ile dilimlenmiş tarafına beyin yeniden pin yukarı bakacak şekilde (somata ve neuropil doğrudan kayıt için erişilebilir böylece) ve silikon elastomer blok (şekil 3 uzak bakan beyin ventrikül yüzeyine yan B) böylece (İki kutuplu bir elektrot optik hemisferlerine üzerinde yerleştirilebilir).
  4. Segev, et al. açıklandığı gibi tüm cep telefonu yama kelepçe veya yerel dosyalanmış potansiyel kayıt (şekil 3C) yerine getirmek 16

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Tüm alan flaş ışık ışık uyarılmış yanıt-e doğru kaydetmek için elde edilen yanıt bireysel tectal neurons (şekil 4A) kaydedilir iken retina tahmin edilmektedir. Bu belirli iletişim kuralı her iki nöron (yanıt "On") açma ve 15 off dönüm ışığa tepki ölçmek için tasarlanmıştır daha sonra "Off yanıt." ölçmek için s Tectal nöronlar genellikle sağlam ve yanıt kapalı sergi (nöron gösterilen burada içinde k...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu çalışmada açıklanan tüm yöntemleri tectal Kurbağa yavrularını gelişimsel sahne 42 ve (Neiuwkoop ve Faber15göre sahnelenen) 49 arasında neurons kaydetmek için optimize edilmiştir. Sahne 42 ile Kurbağa yavrularını yeterince büyük ve yeterince gelişmiş böylece böcek pimleri beyin vivo kayıtları için ve tüm beyin diseksiyon taşımak için her iki tarafında yerleştirilebilir. Daha önceki aşamalarında, Kurbağa yavrularını aslında iki boyutlu olduğunda (...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

SBC COBRE 1P20GM121310-01 NIH grant tarafından desteklenen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Stemi Stereo 508Zeiss495009-0006-000 Dissecting microscope
MS-222 "Tricane"FinquelARF5GAmphibian general anesthetic
Sodium Chloride (NaCl)Fisher ScientificS271-3Used to prepare Stienberg's solution and external solution
Potassium Chloride (KCl)Fisher ScientificP217-500Used to prepare Stienberg's solution and external solution
HEPESSigma-AldrichH3375-1KGUsed to prepare Stienberg's solution and external solution
Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O)Sigma-Aldrich237124-500GUsed to prepare Stienberg's solution  
Magnesium Sulfate (MgSO4)Mallinckrodt Chemicals6066-04Used to prepare Steinberg's solution
Calcium Chloride (CaCl2)Sigma-AldrichC5080-500GUsed to prepare external recording solution
Magnesium Chloride (MgCl2)J.T. Baker2444-01Used to prepare external recording solution
D-glucose AnhydrousMallinckrodt Chemicals6066-04Used to prepare external recording solution
Tubocurarine hydrochloride pentahydrateSigmaT2379Nicotinic acetylcholine receptor antagonist
Insect PinsFine Science Tools26002-100.1mm diameter stainless steel pins
Sylgard 184 Silicone Elastomer KitDow Corning761028Preweighed monomer and curing agent kit
Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mmFisher ScientificAS4052Small petri dishes
PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm)BD305122Syringe needles
1mL Slip Tip Tuberculin Syringe BD309659Disposable, sterile syringes
Borosilicate pipette glassSutter InstrumentBF150-86-10HPPulled to desired specifications using pipette pulling machine
Flaming/Brown Micropipette PullerSutter InstrumentsP-97Fabricates micropipettes for electrophysiology recording
Kimwipes Kimtech wipesKimberly-Clark34120Delicate task lint-free wipers
Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7BMolecular Devices1-CV-7BCurrent clamp and voltage clamp headstage
MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop ControllerSutter InstrumentMP-285/TControl for headstage on electrophysiology rig
Fiber-Coupled LED (Green)ThorlabsM530F2Fiber optic cable paired with green LED
Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter)FHC30207Bipolar stimulating electrode
ISO-Flex StimulatorA.M.P.I. (Israel) Contact manufacturerFlexible stimulus isolator
Axon Instruments 700B Multipatch AmplifierMolecular Devices2500-0157Amplifier for voltage- and current-clamp recording 
Digidata 1322A digitizerMolecular Devices2500-135Data acquisition system for electrophysiology recording
Axio Examiner.A1Zeiss491404-0001-000 Microscope for electrophysiology
Micro-g Lab TableTMC63-533Air table for electrophysiology microscope
Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bitDellD06D001Computer running electrophysiology software
c2400 CCD cameraHamamatsu70826-5Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging
7 O'Clock Super Platinum Stainless RazorbladesGilletteCMM01049Platinum-coated stainless razor blades
Transfer PipetsFisher Scientific13-711-7MDisposable Polyethylene transfer pipets

Referanslar

  1. Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
  2. Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
  3. Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
  4. Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).
  5. Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
  6. Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351(2015).
  7. Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
  8. Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
  9. Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).
  10. Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).
  11. Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
  12. Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705(2008).
  13. Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
  14. Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).
  15. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland. New York. (1994).
  16. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024(2016).
  17. Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).
  18. Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).
  19. Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).
  20. Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Neurosciencesay 133B t n h cre yama kelep e kay tXenopus Kurba a yavrular nretinotectal devrebeyin haz rl klarsinirsel devre i leviElektrofizyoloji

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır