JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz Lambda seçin CII mutasyon tahlil transgenik kemirgenler kültürlü hücrelerdeki veya faiz kimyasal/fiziksel ajanı ile tedavi karşılık gelen hayvanlar için detaylı bir protokol tanımlamak. Bu yaklaşım yaygın kanserojen memeli hücreleri, mutagenisitesinin test etmek için kullanılmıştır.

Özet

Transgenik hayvan modelleri ve mutasyon tespit sistemleri bir dizi memeli hücreleri kanserojen mutagenisitesinin test için geliştirilmiştir. Bunlar transgenik fareler ve Lambda (λ) Select CII mutasyon tespit sistemi mutagenisitesinin deneyler için birçok araştırma grupları tarafından dünya çapında istihdam edilmiştir. Burada, biz transgenik fareler/fareler kültürlü hücrelere uygulanan Lambda seçin CII mutasyon tahlil için detaylı bir protokol tanımlamak veya faiz kimyasal/fiziksel Aracısı ile ilgili hayvan tedavi. Protokol aşağıdaki adımlardan oluşur: (1) yalıtım hücrelerden genomik DNA'ın veya organ/Transjenik hayvanlar dokuların vitro veya vivo içindesırasıyla, bir test karışımla; tedavi (2) (Yani, CII transgene) mutational muhabir gen genomik DNA taşıyan lambda Servisi vektör kurtarılması; (3) bulaşıcı bacteriophages içine kurtarıldı vektörlerin ambalaj; (4) bir ana bilgisayar bakteri hastalık ve seçici koşullar altında indüklenen CII mutasyonlar yayılmasını sağlamak için kültür; ve (5) skorlama CII-mutantlar ve DNA dizi mutasyon spektrum ve CII mutant sıklığı sırasıyla belirlemek için analizi.

Giriş

Transgenik hayvan modelleri ve mutasyon tespit sistemleri geniş bir memeli hücreleri kanserojen mutagenisitesinin test için geliştirilmiştir. Bunlar transgenik Big Blue (bundan sonra BB adlandırılır) fareler ve λ Select CII mutasyon tespit sistemi mutagenisitesinin deneyler için bu grup ve birçok diğer araştırma grupları dünya çapında1,2tarafından istihdam edilmiştir, 3,4,5,6,7,8,9. Son 16 yıldır, biz bu Transjenik hayvanlar kullanarak çeşitli kimyasal ve/veya fiziksel ajanların mutajenik etkileri araştırdık veya onların karşılık gelen embriyonik fibroblast hücre kültürlerinde bir test karışımı ile tedavi ve daha sonra analiz λ Select CII tahlil ve DNA sıralama, sırasıyla10,11,12,13,14 CII transgene genotip ve fenotip , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. bu Transjenik hayvanlar genom kromozom 4 Çoklu kopya kafa kuyruk concatemer1,2,25üzerinde entegre bir bakteriyofaj λ Servisi vektör (λLIZ) içerir. ΛLIZ Servisi vektör iki mutational muhabir gen taşır yani lacI ve CII transgenes1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45 , 46 , 47. λ Select CII tahlil λLIZ Servisi vektörel çizimler kurtarma organ/dokulardan Transjenik hayvanlar1,2,25 türetilmiş hücre genomik DNA dayanır . Kurtarılan λLIZ Servisi vektörel çizimler sonra bir göstergesi ana Escherichia colibulaşmasını yetenekli λ fajının zihinlerine paketlenmiştir. Daha sonra virüs bulaşan bakteriler puanlama ve CII transgene1,3mutasyon analizi için izin vermek için seçici koşullar altında yetiştirilmektedir.

Burada, biz hücreleri/Transjenik hayvanlar tedavi vitroorganlarının genomik DNA izolasyonu oluşur λ Select CII tahlil için detaylı bir protokol tarif /vivo λLIZ test bileşik, alımı ile olan yakındaki vektörel çizimler genomik DNA vektörler ambalaj içine bulaşıcı λ phages, bacteriophages, CIItanımlaması ile ana E. coli enfeksiyonu- CII mutant frekansını belirlemek için mutantlar seçici koşullar altında ve DNA dizi analizi CII mutasyon spektrum oluşturmak için. Protokol transgenik mouse/fare hücre kültürleri tedavi vitro ilgi bir kimyasal/fiziksel maddesi ile uygulanabilir veya doku/organ karşılık gelen hayvanların vivo içinde test kimyasal/ajan1ile tedavi, 2,4,48,49,50,51,52. λ Select CII tahlil şematik bir sunumunu şekil 1' de gösterilen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. fare embriyonik fibroblastlar genomik DNA izolasyonu

Not: Birincil fare embriyonik fibroblastlar göre yayımlanmış protokolü53C57BL/6 genetik arka plan ile BB transgenik fareler türetilen embriyo etkilenmezsiniz. Bu iletişim kuralı için başlangıç materyali 1 x 106 -bileşik karşı test denetimi ile tedavi 1 x 107 embriyonik fibroblast hücreleri oluşur. Hasat ve standart yöntemlerle bu hücrelerin sayma başvurular10,54,55açıklanmıştır.

  1. Hazırlamak bir (0,3 M Sükroz, 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0,5 mM spermidine, 0.15 mM spermine ve 2 mM EDTA) tampon, tampon B (150 mM NaCl ve 5 mM EDTA, pH 7.8) ve C (20 mM Tris-HCl, pH 8.0 arabellek 20 mM NaCl, 20 mM EDTA ve % 1 SDS) peşin ve en çok bir yıl54,55(RT) oda sıcaklığında koru.
  2. Geniş bir yelpazede kullanarak yukarı ve aşağı üst üste pipetting tarafından 15 mL konik santrifüj tüpü A 1000 µL pipet ucu delik 2-4 mL arabellek hücrelerde resuspend.
  3. Bir birim (2-4 mL) arabellek A içeren %1 octylphenoxypolyethoxyethanol (örneğin, Nonidet P40) ekleyin cam serolojik pipet kullanarak.
  4. Buz 5 min için tüp kuluçkaya.
  5. 1000 x g RT., 5 min için de tüp santrifüj kapasitesi
  6. Süpernatant atın ve Pelet 10-15 mL arabellek kullanarak bir cam serolojik pipet ile yıkayın.
  7. Pelet 2-4 mL arabellekte B. resuspend
  8. Bir birim (2-4 mL) arabellek C içeren 600 µg/mL İndinavir K. Ekle
  9. Tüp 37 ° C'de 3 h için kuluçkaya
  10. RNase A 100 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin.
  11. Tüp bir ek 1 h 37 ° C'de için kuluçkaya
  12. Bir birim (2-4 mL) fenol ekleyin (0.1 doymuş M Tris-HCl, pH 8.0):chloroform:isoamyl alkol (25:24:1 vol/vol).
    Not: Fenol ağır sağlık tehlike oluşturabilir ve olağanüstü dikkatle ele alınması gerekir. Fenol cilt için son derece korozif ve içinden kolayca emilir ve diğer efektler sergiler. Fenol, işleme her zaman kullandığınızda double gloving, koruyucu gözlük giymek ve kimyasal duman mahallede iş.
  13. İyi bir tüp rotator 4 ° C'de 5 min için tüp ters çevirme tarafından mix
  14. 1000 x g 4 ° C'de 5 min için de tüp santrifüj kapasitesi
  15. Sulu faz (üst katman) için yeni bir tüp cam serolojik pipet kullanarak kaldırın.
  16. Fenol: kloroform: izoamil alkol ayıklama 1-3 kat sulu faz açıktır ve arabirimidir artık bulanık kadar yineleyin.
  17. 1/10 birim (200-400 µL) 3 M sodyum asetat, pH 5.2 ekleyin.
  18. 2.5 hacmi (5-10 mL) % 100 etanol (soğuk) ekleyin ve 2-3 dakika için elle tüpü yavaşça tersine çevirin.
  19. Bir cam kanca ile DNA biriktirmek ve %70 1 – 5 mL içeren yeni bir tüp transferi etanol ve iyice yıkayın. Alternatif olarak, DNA cips ve %70 1 – 5 mL ile iyice yıkayın için 4 ° C yüksek hızda (3.500 x g) tüp santrifüj kapasitesi etanol.
  20. Yüksek hızda (3.500 x g) tüp RT santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak ve 10-15 dk için DNA kuruması.
  21. 10-100 µL TE arabellek (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) DNA'daki dağıtılması ve 4 ° c (için bir ay kısa depolama) veya (daha uzun süre depolama)-20 ° C'de depolayın. λ Select CII tahlil için DNA'ın konsantrasyonu en uygun olduğunu 0.5-1.0 µg/µL (TE arabellekte)56.

2. Vitro ambalaj tepki

  1. Bir ambalaj tepki ~ 5 µg genomik DNA ekleyin (son hacim: 8 – 12 µL, genomik DNA Bölüm 1 ' fare embriyonik fibroblastlar tedavi vitro bileşik bir testiyle veya denetiminden izole) ilk içeren bir microcentrifuge Tube reaksiyon mix (~ 10 µL).
    Not: İçinde-ev hazır veya piyasada bulunan λ ambalaj özleri farklı laboratuvarlarda kullanılır. Ticari ambalaj özü kiti burada56 kullanılan (bkz. Tablo reçetesi) kırmızı tüpler ilk tepki mix (~ 10 µL) ve mavi tüpler bulunan ikinci reaksiyon mix (en az 5 tepkiler ~ 70 µL).
  2. 30 ° C'de 90 dk için tüp kuluçkaya
  3. Gerekli birim (~ 12 µL) tüp ikinci reaksiyon karışımı ekleyin.
  4. Tüp bir ek 90 dk 30 ° C'de için kuluçkaya
  5. SM arabellek 1.1 mL tüp ekleyin.
    Not: Bu çözüm (Yani, ambalaj tepki karışımı) 1 mL λ CIIeleme için kullanılan-mutant. Geri kalan titering için kullanılır.
    1. SM arabellek 5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4.7H2O, 50 mL karıştırarak hazırlayın 1 M Tris-HCl (pH 7.5) ve 5 mL %2 (w/v) jelatin. DH2O son hacmi 1 litre, otoklav ilâ 1 yıl için oda sıcaklığında 30 dk. mağaza için ekleyin.
  6. Girdap 10 için paketlenmiş DNA örneği içeren tüp RT (dinç vortexing), s.
  7. Nabız microcentrifuge ve buz üzerinde mağaza tüpte kullanıma hazır kadar spin. Örnek ambalaj aynı gün içerisinde kullanılacak gitmiyor, kloroform mL paketlenmiş DNA'ın başına 50 µL ekleyerek her örnek, girdap yavaşça ve 2 hafta için 4 ° C'de depolayın.

3. E. coli G1250 bakteriyel kültür hazırlama

  1. En az iki gün önce kaplama, Escherichia coli (e.coli) G1250 TB1-sefaloridin agar Tabaklarda gelen birkaç bakteriyel çizgi plakaları olun.
    1. TB1-sefaloridin Ağar kaplamalar aşağıdaki gibi hazırlayın. 5.0 g NaCl, 10,0 g kazein pepton ve 12,0 g agar karıştırın. 800 mL dH2O. eklemek 1 mL %0.1 tiamin hidroklorür ekleyin. PH 7.0 NaOH veya HCl. Ekle ile ayarlamak dH2O son hacmiyle 1 litre.
    2. Mix iyi ve otoklav 30 dk. 55 ° C'ye soğutmak için izin ver 50.0 mg sefaloridin ekleyip karıştırın. Steril 100-mm petri yemekler (çanak başına 20-25 mL) içine dökün. Tabaklar 4 ° c ilâ iki hafta için saklayın.
  2. Bakteriyel çizgi plakaları bir sabit 30 ° C kuluçka için en az 24 saat kuluçkaya.
  3. Bir gün önce kaplama, TB1 sıvı orta 10 mL % 20 (w/v) maltoz-1 M MgSO4 çözüm bir steril 50 mL vidalı kapak konik tüp 100 µL ile birleştirir.
    1. TB1 sıvı orta şekilde hazırlayın. Mix 5.0 g NaCl ve 10.0 g kazein pepton, 800 mL dH2O, 1 mL %0.1 tiamin hidroklorür, ekleyebilir ve 7.0 NaOH veya HCl pH ayarlayabilirsiniz. Mix iyi ve otoklav 30 dakika süreyle RT orta üç aya kadar saklamak, sonra dH2O son hacmi 1 litre için ekleyin.
    2. %20 (w/v) maltoz-1 M MgSO4 aşağıdaki gibi hazırlayın. Mix 20.0 g maltoz ve 24.6 g MgSO4. 7H2O, o zaman 100 mL nihai bir birime dH2O ekleyin. Filtre sterilize ve 6 aya kadar 4 ° C'de depolayın.
  4. Sömürgeler steril inoculating döngü56kullanarak bakteriyel çizgi plaka ile sıvı orta aşılamak.
  5. Sıvı kültüründe gecede 30 ° C ile dinç (250 – 300 rpm) sallayarak kuluçka sallayarak kuluçkaya.
  6. Kaplama günde konik tüp G1250 sıvı kültür 1.500 x g RT bakteri hücreleri cips, 10 min için de içeren santrifüj kapasitesi.
  7. Süpernatant atın ve hücre Pelet 10 mL 10 mM MgSO4resuspend.
  8. 1:10 Absorbans ölçmek seyreltme hücre süspansiyon, bir UV-VIS Spektrofotometre (örneğin, 100 µL hücre süspansiyon + 900 µL 10 mM MgSO4)56kullanarak dalga boyu 600 nm.
  9. Hücre süspansiyon 0,5 ile 10 mM MgSO4son OD600 oranında seyreltin. G1250 E. coli OD600 ile hazırlanan süspansiyon = 0,5 'G1250 kaplama Kültür' adlandırılır.
  10. G1250 kaplama kültür buza kapaklarý takýlý içinde 1-2 h.

4. kaplama paketlenmiş DNA örnekleri

  1. Bir paket DNA örneği on altı steril 14 x 100 mm2 yuvarlak alt tüpler ve on altı TB1 Ağar kaplamalar hazırlayın. 10'dan her küme için tarama ve altı titering (titresi 20 3) ve üç titresi 100 için kullanılacaktır.
    1. TB1 Ağar kaplamalar aşağıdaki gibi hazırlayın. Mix 5.0 g NaCl, 10,0 g kazein pepton ve 12,0 g Agar, sonra 800 mL dH2O ve 1 mL %0.1 tiamin hidroklorür ekleyin. 7.0 NaOH veya HCl pH ayarlayabilir ve dH2O 1 L. son bir hacim için ekleyebilirsiniz
    2. Mix iyi ve otoklav 30 dk. 55 ° C-cool, sonra steril 100 mm Petri yemekler (çanak başına 20-25 mL) içine dökün karışımı sağlar. Plakayı 4 ° c ilâ iki hafta için saklayın.
      Not: En az 24 kullanılmadan önce s TB1 Ağar kaplamalar hazırlanmalıdır.
  2. Her yuvarlak alt tüpün içine G1250 kaplama kültürünün aliquot 200 µL.
  3. Titering için1: 100 seyreltme paketlenmiş DNA örneği yapmak ve de vortexing tarafından (Yani, 10 µL paketlenmiş DNA örneği + 990 µL SM arabellek) karıştırın.
  4. 1: 100 seyreltme 20 µL her üç titresi 20 tüpler için ekleyin.
  5. 1: 100 seyreltme 100 µL her üç titresi 100 borular için ekleyin.
  6. Tarama için100 µL Ekle 'su katılmamış ' her on tarama tüplerinin paketlenmiş DNA örneği.
  7. Tüm titering ve tarama tüpler işlemek (2 x 3 + 10 = 16 tüpler), aşağıdaki gibi: mix de tarafından yaklaşık 10 için vortexing s ve sonra ana bilgisayarın E. coli phages absorbe sağlamak 30 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
  8. Mikro dalgada erimiş TB1 kontör agar (55 ° C için soğutmalı) her titresi veya tüp, eleme hemen vortexing tarafından (), karışımı yavaşça 2.5 mL ekleyin ve uygun titresi dökme veya TB1 Ağar kaplamalar eleme.
    1. TB1 en iyi agar aşağıdaki gibi hazırlayın. Mix 5.0 g NaCl, 10,0 g kazein pepton ve 7.0 g Agar, sonra 800 mL dH2O. eklemek 1 mL %0.1 tiamin hidroklorür ekleyin, sonra 7.0 NaOH veya HCl pH ayarlama. Son olarak, dH2O son hacmi 1 litre için ekleyin.
    2. İyi ve otoklav 20-25 dk. mağaza oda sıcaklığında üç aya kadar karıştırın.
    3. Kullanım önce hazır TB1 en iyi agar bir mikrodalga eritmek, iyice karıştırın ve bir su banyosu içinde 55 ° C için soğumasını bekleyin.
      Not: Erimiş ve soğutulmuş TB1 üst her titresi veya tarama tüp içeriği eklenir ve karıştırma sonra uygun titresi veya tarama TB1 agar tabak dökülür.
  9. 15-30 dakika oda sıcaklığında, yoğunlaşma önlemek için Aralık kapaklı stand plakaları ver.
  10. Tabakları ters çevir ve sabit 24 ° C kuluçka makinesine on tarama tabak yerleştirin ve 46-48 h (Yani, seçici koşullar) ve sabit 37 ° C kuluçka altı titresi plakaları için kuluçkaya ve 24 saat kuluçkaya / (Yani, bir gecede Seçici olmayan koşullar).
    Not: kalite güvence ve sonuçları standardizasyonu için bilinen mutant frekans ile wildtype ve mutant CII karışımı içeren ticari olarak kullanılabilir denetim fajının çözümler paketlenmiş DNA örnekleri kaplama ve tüm tahlil56çalışır.

5. inceleme titresi ve eleme plakaları CII Mutant frekansı belirlemek için

  1. 37 ° C'de 24 h/gecede kuluçka sayısı plaklar sayısı her üç titresi 20 tabakalar ve titresi 100 tabak içinde oluşmuş. Plaklar daha kolay tanımlamak için plaka beyaz bir ışık kutusunun yanındaki ve karanlık bir arka plan (bkz. Şekil 2) kaldırıldı kapak ile tutun.
  2. Plaklar sayısı ortalama (ortalama) sayılan titresi 20 tabak ve titresi 100 tabak her kümede yapmak (her triplicate).
  3. Ortalama 50-200 plaklar plaka set başına dizi yakın düşüyor titresi plakaları kümesinden seçin.
  4. Aşağıdaki gibi on tarama levhalar yaylıdır ekranlı plaklar toplam sayısını hesaplar:
    Toplam ekranlı plaklar (ortalama sayısı plaklar titresi plakaları ÷ seyreltme µL sayısı seçilen titresi plaka kullanılan seçilen küme) = seyreltme faktörü x x µL plaka [100 µL/plaka] eleme başına paketlenmiş DNA örneği sayısı x tabak [10] tarama sayısı.
    Not: Örneğin, plaklar titresi 20 plakaların kümedeki plaka başına ortalama sayısı 128'dir ve 478 titresi 100 plakaların kümedeki karşılık gelen sayıdır, sayı 128 ekranlı plaklar toplam sayısı hesaplanması için kullanılır , aşağıdaki gibi:
    (128 ÷ 20) x 100 [µL/plaka] x 10 [plakaları] x 100 [seyreltme faktörü] 640.000 =
    Bu ortalama titresi 20 plakaları veya titresi 100 Kaplamalar, sayıları sırasıyla temel alıyorsa plaklar ortalama sayısı 5.000 veya 1.000, teksir makinesi için eşdeğerdir.
  5. 24 ° c 46-48 h kuluçka plaklar (Bölüm 5. 1'sağlanan yönergeleri izleyin) on tarama plakaları oluşan toplam sayısını saymak.
    Not: CII mutant frekans tarama levhalar yaylıdır oluşan plaklar ile ekranlı plaklar toplam sayısı toplam sayısı bölünerek hesaplanır. Yukarıdaki örnekte, sayılan plaklar toplam sayısı on tarama levha kullanarak 112, CII mutant frekans bu DNA örneği için 112 ÷ 640.000 = 17,5 x 10-5olacaktır.

6. Putative λ CII mutantlar doğrulanması, PCR güçlendirme ve DNA Sekanslama

  1. Steril, geniş-geçişli damlalıklı ucu ile söz konusu plak çekirdek ve bu 500 µL steril SM arabelleği içeren bir steril microcentrifuge tüpüne sınırdışı (yukarı ve aşağı pipetting tarafından).
  2. Oda sıcaklığında en az 2 h için kuluçkaya veya 4 ° C'de fajının parçacıklar agar elute izin vermek için bir gecede takın.
  3. Bir steril 14 x 100 mm2 yuvarlak alt tüp G1250 kaplama kültürünün 200 µL özlü fajının çözüm 1 µL ile karıştırın ve RT., 30 dk için kuluçkaya
  4. 2,5 mL 55 ° C erimiş TB1 üst agar kullanarak örnek plaka ve plaka 24 ° c 46-48 h (seçici koşulları), bölümler 4,8-4,10 içinde açıklandığı gibi kuluçkaya.
  5. İkincil plaklar oluşmuş bir pipet ucu bir tek iyi izole doğrulanmış λ CIIdikkatle almaya kılabilmesi-mutant plak (alt agar dokunmaktan kaçının).
    Not: sözde CII mutant plaklar Replating iki amaca hizmet eder: (i) eserler kaplama bazen yanlış olabilir küçük boyutlu plaklar için; ve (ii) bir tarama tabaktan alınan bir özel çekirdek mutant olmayan phage(s) ile birlikte bir mutant fajının içerebilir. Düşük yoğunluklu replating üzerinden ikincil plaklar PCR ve sonraki DNA dizi analizi için kirlenmemiş bir mutant şablonu sağlar.
  6. Plak yukarı ve aşağı pipetting tarafından 25 µL çift distile su içeren bir microcentrifuge tüp aktarın.
  7. Tüp 5 min için kaynar suda koyun.
  8. Maksimum hızda (18.000 x g) RT. 3 dakika santrifüj kapasitesi
  9. 10 µL süpernatant, hemen 40 µL PCR mastermix reaktifleri son konsantrasyonları olan 1 x Taq PCR tampon, 10 pmol her ileriye ve geriye doğru astar, her dNTP 12.5 nmol içeren yeni bir microcentrifuge tüp transferi ve 2.5 U Taq DNA polimeraz.
    Not: İleriye ve geriye doğru astar aşağıdaki gibidir: 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3' (-68 -50 CII göre için başlamak kodon pozisyonlar) ve 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3' (+345 365 CII başlama kodonu göre için sırasıyla pozisyonlar).
  10. Aşağıdaki Bisiklete binme parametrelerini kullanarak şablon yükseltmek: 3 dk denatürasyon 95 ° C'de 30 30 döngüsü tarafından takip s 95 ° c, 1 dk. 60 ° C'de ve uzantısına sahip bir son 72 ° C'de 10 dk 72 ° C'de 1 dk
  11. CII gen içeren ve piyasada bulunan PCR arıtma kitleri, kullanarak bölge kanat 432 bp PCR ürünü üreticinin yönergelerine göre arındırmak.
  12. DNA sıralama bir uygun sıralama platformu kullanarak gerçekleştirmek ve mutasyonlar CII transgene algılamak için elde edilen DNA dizilerinin analiz (aşağıdaki nota bakın).
    Not: Bu en iyi yazılım, web tabanlı T-kahve sıra hizalama server gibi kullanılarak başvuru CII sırası ile hizalama tarafından sağlanır. Program kullanımı hakkında yönergeler için ziyaret edin: http://tcoffee.crg.cat/

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Veri dağıtımı bağlı olarak, parametrik ya da non-parametrik testler (spontan mutant Frekanslar karşı indüklenenYani) tedavi ve kontrol grupları arasında CII mutant frekans farkı önemini belirlemek için kullanılır . İndüklenen CII mutant frekansları farklı tedavi grupları arasında karşılaştırılması yapılmış çeşitli tarafından (ikili) uygulanabilir istatistiksel testler. χ2 test veya Varyans analizi (ANOVA), gibi diğe...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

λ Select CII tahlil organ/dokulardan BB kemirgenler3türetilmiş hücre genomik DNA kurtarıldı CII transgene mutasyonların tespiti için kullanılır. Bu Transjenik hayvanlar genom CII taşıdığı genetik entegre λLIZ Servisi vektör, birden çok tandem kopyalarını içerir (294 bp) ve lacI (1,080 bp) transgenes, mutational muhabir gen1, 2 , 25. λ Select CI...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Tüm yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

Teşekkürler

Tüm meslektaşlarımızın katkıları ve ortak çalışanlar, sonuçlar için bu el yazması (görsel amacıyla) sevk edilmiştir orijinal çalışmalarımız için kabul etmek istiyoruz. Yazarların iş hibe Ulusal Enstitüsü diş ve ulusal sağlık Enstitüleri (1R01DE026043) AB için kraniyofasiyal araştırma ve California Tobacco-Related hastalığı araştırma programı için AB (Üniversitesi tarafından desteklenmektedir TRDRP-26IR-0015) ve ST (TRDRP-25IP-0001). Sponsorlar çalışmanın çalışma tasarım, veri toplama, veri analizi, veri yorumu, rapor yazma veya yayın için göndermek için karar herhangi bir rolü yoktu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
AgarMO Bio Laboratories, Inc.12112-05Bacteriological grade
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing KitThermo Fisher Scientific4337455None
Casein PeptoneAlfa AesarH26557None
GelatineJ. T. Baker2124-01Powder
GlycerolFisher ScientificBP 229-1 / M-13750None
LB AgarFisher ScientificBP 9724-500None
QIAquick PCR purification kitQiagen810450 PCR purification reactions
Sodium Acetate TrihydrateFisher ScientificM-15756None
Taq5000 DNA Polymerase Qiagen201207None
Thiamine HydrochlorideMacron Fine Chemicals2722-57None
Transpack Packaging ExtractStratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp.20022350 packaging reactions
Tris BaseFisher ScientificBP 152-1 / EC 201-064-4None
TryptonBiosciencesRC-110None

Referanslar

  1. Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (17), 9073-9078 (1996).
  2. Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. Detailed review of transgenic rodent mutation assays. Mutat Res. 590 (1-3), 1-280 (2005).
  3. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Investigating human cancer etiology by DNA lesion footprinting and mutagenicity analysis. Carcinogenesis. 27 (8), 1526-1537 (2006).
  4. Watson, D. E., Cunningham, M. L., Tindall, K. R. Spontaneous and ENU-induced mutation spectra at the cII locus in Big Blue Rat2 embryonic fibroblasts. Mutagenesis. 13 (5), 487-497 (1998).
  5. Erexson, G. L., Watson, D. E., Tindall, K. R. Characterization of new transgenic Big Blue(R) mouse and rat primary fibroblast cell strains for use in molecular toxicology studies. Environ Mol Mutagen. 34 (2-3), 90-96 (1999).
  6. Erexson, G. L., Tindall, K. R. Micronuclei and gene mutations in transgenic big Blue((R)) mouse and rat fibroblasts after exposure to the epoxide metabolites of 1, 3-butadiene. Mutat Res. 472 (1-2), 105-117 (2000).
  7. McDiarmid, H. M., Douglas, G. R., Coomber, B. L., Josephy, P. D. 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP)-induced mutagenesis in cultured Big Blue rat mammary epithelial and fibroblast cells. Environ Mol Mutagen. 39 (2-3), 245-253 (2002).
  8. Papp-Szabo, E., Douglas, G. R., Coomber, B. L., Josephy, P. D. Mutagenicity of the oral carcinogen 4-nitroquinoline-1-oxide in cultured BigBlue rat tongue epithelial cells and fibroblasts. Mutat Res. 522 (1-2), 107-117 (2003).
  9. Guichard, Y., et al. In Vitro Study of Mutagenesis Induced by Crocidolite-Exposed Alveolar Macrophages NR8383 in Cocultured Big Blue Rat2 Embryonic Fibroblasts. J Toxicol. , 323828(2010).
  10. Besaratinia, A., Bates, S. E., Pfeifer, G. P. Mutational signature of the proximate bladder carcinogen N-hydroxy-4-acetylaminobiphenyl: inconsistency with the p53 mutational spectrum in bladder cancer. Cancer Res. 62 (15), 4331-4338 (2002).
  11. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Enhancement of the mutagenicity of benzo(a)pyrene diol epoxide by a nonmutagenic dose of ultraviolet A radiation. Cancer Res. 63 (24), 8708-8716 (2003).
  12. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Weak yet distinct mutagenicity of acrylamide in mammalian cells. J Natl Cancer Inst. 95 (12), 889-896 (2003).
  13. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Biological consequences of 8-methoxypsoralen-photoinduced lesions: sequence-specificity of mutations and preponderance of T to C and T to a mutations. J Invest Dermatol. 123 (6), 1140-1146 (2004).
  14. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Genotoxicity of acrylamide and glycidamide. J Natl Cancer Inst. 96 (13), 1023-1029 (2004).
  15. Besaratinia, A., Bates, S. E., Synold, T. W., Pfeifer, G. P. Similar mutagenicity of photoactivated porphyrins and ultraviolet A radiation in mouse embryonic fibroblasts: involvement of oxidative DNA lesions in mutagenesis. Biochemistry. 43 (49), 15557-15566 (2004).
  16. Yoon, J. H., et al. DNA damage, repair, and mutation induction by (+)-Syn and (-)-anti-dibenzo[a,l]pyrene-11,12-diol-13,14-epoxides in mouse cells. Cancer Res. 64 (20), 7321-7328 (2004).
  17. Besaratinia, A., Synold, T. W., Xi, B., Pfeifer, G. P. G-to-T transversions and small tandem base deletions are the hallmark of mutations induced by ultraviolet a radiation in mammalian cells. Biochemistry. 43 (25), 8169-8177 (2004).
  18. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Investigating DNA adduct-targeted mutagenicity of tamoxifen: preferential formation of tamoxifen-DNA adducts in the human p53 gene in SV40 immortalized hepatocytes but not endometrial carcinoma cells. Biochemistry. 44 (23), 8418-8427 (2005).
  19. Kim, S. I., Pfeifer, G. P., Besaratinia, A. Lack of mutagenicity of acrolein-induced DNA adducts in mouse and human cells. Cancer Res. 67 (24), 11640-11647 (2007).
  20. Besaratinia, A., Kim, S. I., Bates, S. E., Pfeifer, G. P. Riboflavin activated by ultraviolet A1 irradiation induces oxidative DNA damage-mediated mutations inhibited by vitamin C. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5953-5958 (2007).
  21. Besaratinia, A., Kim, S. I., Pfeifer, G. P. Rapid repair of UVA-induced oxidized purines and persistence of UVB-induced dipyrimidine lesions determine the mutagenicity of sunlight in mouse cells. FASEB J. 22 (7), 2379-2392 (2008).
  22. Besaratinia, A., Kim, S. I., Hainaut, P., Pfeifer, G. P. In vitro recapitulating of TP53 mutagenesis in hepatocellular carcinoma associated with dietary aflatoxin B1 exposure. Gastroenterology. 137 (3), 1127-1137, 1137 e1121-1125 (2009).
  23. Besaratinia, A., et al. A high-throughput next-generation sequencing-based method for detecting the mutational fingerprint of carcinogens. Nucleic Acids Res. 40 (15), e116(2012).
  24. Tommasi, S., Bates, S. E., Behar, R. Z., Talbot, P., Besaratinia, A. Limited mutagenicity of electronic cigarettes in mouse or human cells in vitro. Lung Cancer. 112, 41-46 (2017).
  25. Dycaico, M. J., et al. The use of shuttle vectors for mutation analysis in transgenic mice and rats. Mutat Res. 307 (2), 461-478 (1994).
  26. Davies, R., et al. Mutational spectra of tamoxifen-induced mutations in the livers of lacI transgenic rats. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 430-433 (1996).
  27. de Boer, J. G., et al. Spectrum of spontaneous mutations in liver tissue of lacI transgenic mice. Environ Mol Mutagen. 30 (3), 273-286 (1997).
  28. de Boer, J. G., Mirsalis, J. C., Provost, G. S., Tindall, K. R., Glickman, B. W. Spectrum of mutations in kidney, stomach, and liver from lacI transgenic mice recovered after treatment with tris(2,3-dibromopropyl)phosphate. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 418-423 (1996).
  29. Dycaico, M. J., et al. Species-specific differences in hepatic mutant frequency and mutational spectrum among lambda/lacI transgenic rats and mice following exposure to aflatoxin B1. Carcinogenesis. 17 (11), 2347-2356 (1996).
  30. Skopek, T. R., Kort, K. L., Marino, D. R. Relative sensitivity of the endogenous hprt gene and lacI transgene in ENU-treated Big Blue B6C3F1 mice. Environ Mol Mutagen. 26 (1), 9-15 (1995).
  31. Skopek, T. R., et al. Mutagenic response of the endogenous hprt gene and lacI transgene in benzo[a]pyrene-treated Big Blue B6C3F1 mice. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 376-384 (1996).
  32. Erfle, H. L., et al. An efficient laboratory protocol for the sequencing of large numbers of lacI mutants recovered from Big Blue transgenic animals. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 393-396 (1996).
  33. Gu, M., Ahmed, A., Wei, C., Gorelick, N., Glickman, B. W. Development of a lambda-based complementation assay for the preliminary localization of lacI mutants from the Big Blue mouse: implications for a DNA-sequencing strategy. Mutat Res. 307 (2), 533-540 (1994).
  34. Harbach, P. R., Zimmer, D. M., Filipunas, A. L., Mattes, W. B., Aaron, C. S. Spontaneous mutation spectrum at the lambda cII locus in liver, lung, and spleen tissue of Big Blue transgenic mice. Environ Mol Mutagen. 33 (2), 132-143 (1999).
  35. Kohler, S. W., et al. Spectra of spontaneous and mutagen-induced mutations in the lacI gene in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (18), 7958-7962 (1991).
  36. Mittelstaedt, R. A., et al. Comparison of the types of mutations induced by 7,12-dimethylbenz[a]anthracene in the lacI and hprt genes of Big Blue rats. Environ Mol Mutagen. 31 (2), 149-156 (1998).
  37. Monroe, J. J., Kort, K. L., Miller, J. E., Marino, D. R., Skopek, T. R. A comparative study of in vivo mutation assays: analysis of hprt, lacI, cII/cI and as mutational targets for N-nitroso-N-methylurea and benzo[a]pyrene in Big Blue mice. Mutat Res. 421 (1), 121-136 (1998).
  38. Morrison, V., Ashby, J. A preliminary evaluation of the performance of the Muta Mouse (lacZ) and Big Blue (lacI) transgenic mouse mutation assays. Mutagenesis. 9 (4), 367-375 (1994).
  39. Okonogi, H., et al. Agreement of mutational characteristics of heterocyclic amines in lacI of the Big Blue mouse with those in tumor related genes in rodents. Carcinogenesis. 18 (4), 745-748 (1997).
  40. Provost, G. S., Mirsalis, J. C., Rogers, B. J., Short, J. M. Mutagenic response to benzene and tris(2,3-dibromopropyl)-phosphate in the lambda lacI transgenic mouse mutation assay: a standardized approach to in vivo mutation analysis. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 342-347 (1996).
  41. Shane, B. S., et al. LacI mutation spectra following benzo[a]pyrene treatment of Big Blue mice. Carcinogenesis. 21 (4), 715-725 (2000).
  42. Shane, B. S., Lockhart, A. M., Winston, G. W., Tindall, K. R. Mutant frequency of lacI in transgenic mice following benzo[a]pyrene treatment and partial hepatectomy. Mutat Res. 377 (1), 1-11 (1997).
  43. Shephard, S. E., Sengstag, C., Lutz, W. K., Schlatter, C. Mutations in liver DNA of lacI transgenic mice (Big Blue) following subchronic exposure to 2-acetylaminofluorene. Mutat Res. 302 (2), 91-96 (1993).
  44. Stiegler, G. L., Stillwell, L. C. Big Blue transgenic mouse lacI mutation analysis. Environ Mol Mutagen. 22 (3), 127-129 (1993).
  45. Walker, V. E., et al. Frequency and spectrum of ethylnitrosourea-induced mutation at the hprt and lacI loci in splenic lymphocytes of exposed lacI transgenic mice. Cancer Res. 56 (20), 4654-4661 (1996).
  46. Young, R. R., Rogers, B. J., Provost, G. S., Short, J. M., Putman, D. L. Interlaboratory comparison: liver spontaneous mutant frequency from lambda/lacI transgenic mice (Big Blue) (II). Mutat Res. 327 (1-2), 67-73 (1995).
  47. Zimmer, D. M., Zhang, X. B., Harbach, P. R., Mayo, J. K., Aaron, C. S. Spontaneous and ethylnitrosourea-induced mutation fixation and molecular spectra at the lacI transgene in the Big Blue rat-2 embryo cell line. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 325-333 (1996).
  48. Swiger, R. R., et al. The cII locus in the MutaMouse system. Environ Mol Mutagen. 34 (2-3), 201-207 (1999).
  49. Heddle, J. A., Martus, H. J., Douglas, G. R. Treatment and sampling protocols for transgenic mutation assays. Environ Mol Mutagen. 41 (1), 1-6 (2003).
  50. Thybaud, V., et al. In vivo transgenic mutation assays. Mutat Res. 540 (2), 141-151 (2003).
  51. Manjanatha, M. G., Cao, X., Shelton, S. D., Mittelstaedt, R. A., Heflich, R. H. In vivo cII, gpt, and Spi(-) gene mutation assays in transgenic mice and rats. Methods Mol Biol. 1044, 97-119 (2013).
  52. Swiger, R. R. Quantifying in vivo somatic mutations using transgenic mouse model systems. Methods Mol Biol. 1105, 271-282 (2014).
  53. Tommasi, S., Besaratinia, A., Wilczynski, S. P., Pfeifer, G. P. Loss of Rassf1a enhances p53-mediated tumor predisposition and accelerates progression to aneuploidy. Oncogene. 30 (6), 690-700 (2011).
  54. Saluz, H. P., Jost, J. P. A Laboratory Guide to Genomic Sequencing. , (1987).
  55. Wijnholds, J., Philipsen, J. N., Ab, G. Tissue-specific and steroid-dependent interaction of transcription factors with the oestrogen-inducible apoVLDL II promoter in vivo. EMBO J. 7 (9), 2757-2763 (1988).
  56. Agilent Technologies; Stratagene Products Division. λ Select-cII Mutation Detection System for Big Blue Rodents. INSTRUCTION MANUAL; Catalog #720120; Revision B.0. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/720120.pdf (2018).
  57. Adams, W. T., Skopek, T. R. Statistical test for the comparison of samples from mutational spectra. J Mol Biol. 194 (3), 391-396 (1987).
  58. Kim, S. I., Yoon, J. I., Tommasi, S., Besaratinia, A. New experimental data linking secondhand smoke exposure to lung cancer in nonsmokers. FASEB J. 26 (5), 1845-1854 (2012).
  59. Yoon, J. I., Kim, S. I., Tommasi, S., Besaratinia, A. Organ specificity of the bladder carcinogen 4-aminobiphenyl in inducing DNA damage and mutation in mice. Cancer Prev Res (Phila). 5 (2), 299-308 (2012).
  60. Boyiri, T., et al. Mammary carcinogenesis and molecular analysis of in vivo cII gene mutations in the mammary tissue of female transgenic rats treated with the environmental pollutant 6-nitrochrysene. Carcinogenesis. 25 (4), 637-643 (2004).
  61. Chen, T., et al. Mutations induced by alpha-hydroxytamoxifen in the lacI and cII genes of Big Blue transgenic rats. Carcinogenesis. 23 (10), 1751-1757 (2002).
  62. Chen, T., et al. 4-Aminobiphenyl induces liver DNA adducts in both neonatal and adult mice but induces liver mutations only in neonatal mice. Int J Cancer. 117 (2), 182-187 (2005).
  63. Crabbe, R. A., Hill, K. A. Heart tissue of harlequin (hq)/Big Blue mice has elevated reactive oxygen species without significant impact on the frequency and nature of point mutations in nuclear DNA. Mutat Res. 691 (1-2), 64-71 (2010).
  64. Hernandez, L. G., Heddle, J. A. A carcinogenic western diet does not induce somatic mutations in various target tissues of transgenic C56BL/6 mice. Mutat Res. 570 (2), 185-196 (2005).
  65. Manjanatha, M. G., et al. Dose and temporal evaluation of ethylene oxide-induced mutagenicity in the lungs of male big blue mice following inhalation exposure to carcinogenic concentrations. Environ Mol Mutagen. 58 (3), 122-134 (2017).
  66. Manjanatha, M. G., et al. Evaluation of mutagenic mode of action in Big Blue mice fed methylphenidate for 24 weeks. Mutat Res. 680 (1-2), 43-48 (2009).
  67. McDaniel, L. P., et al. Mutagenicity and DNA adduct formation by aristolochic acid in the spleen of Big Blue(R) rats. Environ Mol Mutagen. 53 (5), 358-368 (2012).
  68. Mei, N., Heflich, R. H., Moore, M. M., Chen, T. Age-dependent sensitivity of Big Blue transgenic mice to the mutagenicity of N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) in liver. Mutat Res. 572 (1-2), 14-26 (2005).
  69. Mei, N., et al. The genotoxicity of acrylamide and glycidamide in big blue rats. Toxicol Sci. 115 (2), 412-421 (2010).
  70. Nay, S. L., Lee, D. H., Bates, S. E., O'Connor, T. R. Alkbh2 protects against lethality and mutation in primary mouse embryonic fibroblasts. DNA Repair (Amst). 11 (5), 502-510 (2012).
  71. Singh, V. K., Ganesh, L., Cunningham, M. L., Shane, B. S. Comparison of the mutant frequencies and mutation spectra of three non-genotoxic carcinogens, oxazepam, phenobarbital, and Wyeth 14,643, at the lambdacII locus in Big Blue transgenic mice. Biochem Pharmacol. 62 (6), 685-692 (2001).
  72. Stuart, G. R., et al. Interpretation of mutational spectra from different genes: analyses of PhIP-induced mutational specificity in the lacI and cII transgenes from colon of Big Blue rats. Mutat Res. 452 (1), 101-121 (2000).
  73. Terrell, A. N., et al. Mutagenicity of furan in female Big Blue B6C3F1 mice. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 770, 46-54 (2014).
  74. Thompson, C. M., et al. Assessment of the mutagenic potential of Cr(VI) in the oral mucosa of Big Blue(R) transgenic F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (7), 621-628 (2015).
  75. Wang, J., Liu, X., Heflich, R. H., Chen, T. Time course of cII gene mutant manifestation in the liver, spleen, and bone marrow of N-ethyl-N-nitrosourea-treated Big Blue transgenic mice. Toxicol Sci. 82 (1), 124-128 (2004).
  76. LeBlanc, G. A., Bain, L. J. Chronic toxicity of environmental contaminants: sentinels and biomarkers. Environ Health Perspect. 105, Suppl 1. 65-80 (1997).
  77. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28 (11), 2253-2261 (2007).
  78. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Second-hand smoke and human lung cancer. Lancet Oncol. 9 (7), 657-666 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve enfeksiyonsay 134bakteriyofajCII Transgeneembriyonik fare fibroblastlarEMFmutasyonServisi vekt r

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır