Bir damlacık dayalı mikrosıvısal yaklaşım ve Microsphere-PCR güçlendirme tek iplikçikli DNA'Amplicons için

Özet

Bu eser mikrosıvısal damlacık tabanlı platformlar imalatı ve polyacrylamide mikroküreler microsphere-PCR güçlendirme için uygulanması için bir yöntem sağlar. Microsphere-PCR yöntemi, Çift iplikçikli DNA ayıran olmadan tek iplikçikli DNA amplicons elde olanak verir.

Özet

Damlacık tabanlı Havacilik sağlayan kontrollü boyutu ve elde edilen microsphere morfoloji mikrosıvısal kanaldaki homojen mikroküreler güvenilir üretim etkinleştirin. Bir acrydite-DNA prob ile copolymerized bir microsphere başarıyla fabrikasyon. Asimetrik PCR, eksonükleaz sindirim ve manyetik boncuklar streptavidin kaplı üzerinde yalıtım gibi farklı yöntemler tek iplikçikli DNA (ssDNA) sentezlemek için kullanılabilir. Ancak, bu yöntemleri verimli bir şekilde yüksek oranda saflaştırılmış ssDNA büyük miktarda kullanamazsınız. Burada, biz nasıl ssDNA olabilir etkili bir şekilde güçlendirilmiş ve dsDNA sadece bir PCR reaksiyon tüpünden pipetting tarafından ayrılmış ayrıntılı bir microsphere-PCR protokolü tanımlamak. SsDNA amplifikasyon DNA Mikroarray ve DNA-SELEX (sistematik evrimi ligandlar üstel zenginleştirme tarafından) işlemler potansiyel Kimyasalları olarak uygulanabilir.

Giriş

Tek iplikçikli DNA (ssDNA) kapsamlı bir moleküler tanıma öğesi (MRE) olarak içsel özelliklerini DNA-DNA hibridizasyon^1,2için nedeniyle kabul edilmiştir. SsDNA sentetik sistemlerinin geliştirilmesi DNA microarrays³, oligotherapeutics, tanılama ve tamamlayıcı etkileşimleri^4,5dayalı entegre moleküler algılama gibi biyolojik uygulamalar yol açabilir.

Bugüne kadar mikrometre ölçekli polimer parçacıkları başarıyla mikrosıvısal aygıtlarını kullanarak gösterilmiştir. Birkaç mikrosıvısal teknikleri son derece homojen mikroküreler microchannel çevre^6,7sürekli akışı üretmek için güçlü olduğu kanıtlanmış.

Lee ve ark. çalışmada ⁸, copolymerizable oligo-microsphere ve ssDNA amplifikasyon mikrosıvısal sentezi için bir mikrosıvısal damlacık tabanlı platform bildirildi. Mikrosıvısal platform iki PDMS (polydimethylsiloxane) katmandan oluşur: microsphere ve bir alt düz bölüm oluşturmak için bir mikrosıvısal kanal ağı ile bir üst kısmı. Bunlar PDMS sıvı kanallarını üç çeşit oluşur: Kanal damlacık üretimi için iki çözüm karıştırma için 2) bir yılan gibi kanal ve microsphere katılaşma için 3) bir sıralı polimerizasyon kanal odaklanarak 1) bir akış. Bir kez iki immiscible akar tek PDMS sıvı kanalı tanıttı, akar dar delik yapısı içerisinde zorlanacak. Kanal geometri, akış hızı ve viskozite gibi akışı davranışlar microsphere Morfoloji ve boyutu etkiler. Bu nedenle, ana sıvı akışı microscale monospheres^9,10ayrılabilir.

Burada, detaylı microsphere-PCR Protokolü ssDNA güçlendirme için sağlanır. İlk olarak, bir damlacık tabanlı mikrosıvısal aygıt tasarım işlemi açıklanmıştır. Sonra hangi polyacrylamide mikroküreler rasgele DNA şablonuyla tamamlayıcı bir şekilde functionalized yolu açıkladı. Son olarak, ssDNA yükseltecek bir microsphere-PCR Protokolü gösterilir.

Protokol

1. bir PDMS mikrosıvısal Platform imalatı

1. 20 mL sıvı PDMS prepolymer temel polimer ve katalizör 10:1 bir hacim oranı karıştırarak hazırlayın. Silikon gofret için üst kısmındaki mikrosıvısal ağ üzerinde 10 mL sıvı PDMS hazırlanmış bir SU-8 kalıp üzerine dökün. Alt düz bölümü için bir kalıp yapısı olmadan silikon gofret sıvı PDMS aynı hacmi dökmek.
   Not: Mikrosıvısal ağ CAD programında tasarlanmış ve bir photomask tipik fotolitografi işlem (bkz: Tamamlayıcı rakamlar) kullanarak bir ana imal için dönüştürülür. Bu ana negatif fotorezist SU-8 kalıp silikon gofret¹¹oluşur.
2. Sıcak plaka ve tedavi için 30 dk. 75 ° C'de sıvı PDMS prepolymer ile kaplı iki silikon gofret yerleştirin.
   1. El ile SU-8 kalıp tedavi PDMS katmandan akasındaki. 1.5 mm çapında yuvarlak delik delme aracı mikron çaplı akış kanalları makro sıvı örnekleri ile arabirim için çoğaltılmış mikrosıvısal ağ üzerindeki yağ noktasına hizalayın. Üzerinden-el ile delik.
   2. Bu işlem üç kez iki çözüm ve çıkış bağlantı noktası oluşumu için delme işlemi yineleyin.
3. Hem üst hem de alt PDMS katmanları birkaç saniye örnek başına bir el corona treater¹² kullanarak hidrofilik yüzey işleme gerçekleştirin.
   1. 30 dakika sıcak bir tabak PDMS PDMS yapıştırma işlemi için kullanma iki plazma tedavi PDMS katmanları ve 90 ° C ısıda yığını. Yapısal bağ ve sızıntı fabrikasyon cihazın test için üç giriş liman şırınga pompa kullanarak basınçlı su.

2. Polyacrylamide Oligo-mikroküreler imalatı

1. Tablo 1' de ayrıntılı boncuk karışımı hazırlayın.
2. Girdap ve kısaca santrifüj standart ssDNA acrydite sonda (Ap, 100 mikron) ve acrylamide:bis (19:1) hisse senedi çözüm etiketli.
3. Çözüm hazırlamak ben % 40 akrilamid 25 μL bis çözüm, ssDNA (acrydite sonda) 10 μL, 5 x TBE arabelleği (1.1 M Tris; 900 mM bor; 25 mM EDTA) 10 μL ve su 5 μL karıştırma tarafından. Çözüm II ile % 20 amonyum Persülfat 50 μL hazırlayın.
4. İki hazırlamak şırıngalar tek tek ben ve çözüm II çözüm ile doldurulmuş ve çözüm akar mikrosıvısal platformu tanıtmak için pompa üzerine mount. Mineral yağ ile % 0,4 karışık hazırlamak TEMED microsphere yüzey katılaşma için.
   Not: TEMED iyi bir serbest radikal sabitleyici bilinir. Serbest radikallerin polimer oluşumu ile amonyum Persülfat (APS) oranı akrilamid polimerizasyonu katalizler için hızlandırabilir.
5. Bir cam şişe sürekli bir akış oluşturmak için mineral yağ 4 mL ile doldurulması.
6. Bir mikrosıvısal rezervuar olarak cam şişe kapağı iki tüp iki bağlantı noktalarına ekleyin: hava kompresörü ve mikro kanal ağa basınçlı petrol temini için sıvı limana cam şişe içine sıkıştırılmış hava uygulamak için pnömatik bağlantı noktası Cam şişeden. Tüplerin arasında cam şişe ve mikrosıvısal aygıt petrol limanda bağlayın.
   1. Tüpler şırınga pompalar iki çözüm sağlamak amacıyla mikrosıvısal cihazın iki çözüm bağlantı noktalarına bağlayın. Oluşturulan microsphere kabı aktarmak için tüpler çıkış bağlantı noktasına takın.
7. Enjektör pompa debisi 0.4 - 0.7 mL/h. ayarlama basınçlı hava basınç regülatörü (82-116 kPa) kullanarak Kompresör için ayarlayın. Manyetik karıştırıcı çubuk dönüş hızı (500 rpm) cam kabı sıcak plaka üzerinde ayarlayın. Enjektör pompa çalıştırmak ve bir elektromanyetik valf¹³ON/OFF kontrolünü kullanarak cam şişe içine bir dış kompresör tarafından oluşturulan sıkıştırılmış hava tedarik.
8. Mikroküreler akışı odaklanarak geometri oluşumu ve cam ölçek oluşturulan mikroküreler katılaşma dijital mikroskop gözlemlemek.
   Not: Microsphere boyut ve üretim hızına bağlıdır üzerinde debisi çözümleri ve mineral yağ akışı için uygulanan basınç (Tablo 2).

3. performans Polyacrylamide Oligo-mikroküreler sayar

1. Hemasitometre miktar için bir az miktarda (yaklaşık 100 μL) sulu çözüm polyacrylamide oligo-mikroküreler ve yerde bulunan cam hemasitometre al ve yavaşça microsphere süspansiyon kadar sayım odası iyi doldurun.
   Not: daha fazla ayrıntı için http://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer bakın.
2. Mikroskop ve el taksitli sayaç kümesi 16 kareler mikroküreler kullanın. Sonra hemasitometre odası sonraki kümesini taşıma ve 16 köşeler tüm dört setleri sayılır kadar güveniyor taşırlar.
3. Ortalama microsphere sayısı belirlemek ve özgün boncuk süspansiyon mikroküreler sayısını hesaplayın.
4. Mikroküreler 100 μL 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın. Nazik (400 x g) centrifuging ve pipetting aracılığıyla süpernatant kaldırın.

4. performans gösteren DNA hibridizasyon Polyacrylamide Oligomicrosphere yüzeyi

Not: Bir aynı DNA prob 5'-NH₂-5'-acrytide değişiklik yerine çözüm ben eklenir ve Ap içeren mikroküreler paralel olarak test. DNA hibridizasyon sonuçları Şekil 2' de gösterilmiştir. Cy3 etiketli tamamlayıcı oligonükleotid problar (cAp) çözüm karanlık bir odada yer almalıdır.

1. Cy3-kap 100 μL 1xTE arabellek kullanarak resuspend (TE arabellek: 10 mM Tris ve 1μM EDTA, pH 8.0) 100 mikron son bir konsantrasyon sağlamak için. Örneğin, TE arabellek ve alüminyum folyo ile kaplı bir microcentrifuge tüp transfer 100 ml kap 1 pmol resuspend.
   Not: strand dizileri için Tablo 3' e bakın.
2. Cy3-kap 100 mikron mikroküreler Ap copolymerized içeren bir steril 1.5 mL microcentrifuge tüp için ekleyin.
3. Tüp birkaç kez dokunun karıştırmak ve 1 h için karanlıkta oda sıcaklığında kuluçkaya.
4. Süpernatant atmak ve pipetting aracılığıyla kalan arabellek kaldırın.
5. Üç kez TE arabellek 500 μL ile yıkayın.
6. Mikroküreler microcentrifuge tüp hafifçe dokunarak resuspend. O zaman, 4.4 adımları yineleyin.
7. Mikroküreler görüntüleme önce alüminyum folyo ile kapatın ve cam slayt (75 mm x 50 mm) yerleştirin.

5. asimetrik PCR ssDNA yükseltecek için

1. Asimetrik bir PCR reaktif mix ssDNA çözümlenmesi için yükseltecek için hazırlayın. Reaktifler buz üzerinde Tablo 4 çözülme. Buz Taq polimeraz enzimi (50 U/µL) tutmak değil, ama oldukça-20 ° C de ihtiyaç kadar saklayın.
2. Yavaşça girdap tüm reaktifler ve sonra kısa bir süre santrifüj kapasitesi tüpler 10.000 x g 10 için de s.
3. Açıklandığı gibi tüm reaktifler birleştirmek Tablo 4.
4. Örnekleri bir thermocycler yerleştirin ve aşağıdaki koşullar altında asimetrik PCR başlatmak: 25 devir (95 ° C 30 s, 52 ° C 30 s ve 72 ° C 30 s), 85 ° C 5 min için 4 ° C'de tutun

6. Microsphere PCR ssDNA yükseltecek için

Not: Bu bölüm için ssDNA bir PCR reaksiyon tüp yükseltecek protokolünü açıklar. Microsphere-PCR reaksiyonları tepki birim 50 μL içinde gerçekleştirilmiştir. Detaylı dizileri ssDNA yükseltmek için kullanılan Tablo 5' te listelenen. Bu durumda, Ap mikroküreler yüzeyindeki rastgele DNA şablonları için tamamlayıcı bir şekilde tavlama. Bu tamamlayıcı DNA dizilerini (antianlamlı DNA dizisi, Şekil 3) üretimi için çok önemli bir adımdır. Genişletilmiş DNA microsphere-PCR güçlendirme için şablon olarak kullanılır.

1. Microsphere-PCR reaktif karışımı hazırlayın. Reaktifler Tablo 6 buz çözme; Ancak, Taq polimeraz enzimi buz üzerinde tutmayın. -20 ° gerekinceye kadar C'de depolayın.
2. Yavaşça girdap tüm reaktifler ve sonra kısa bir süre santrifüj kapasitesi tüpler 10.000 x g 10 için de s.
3. Yaklaşık ~ 25 mikroküreler mikroskobik sayma yoluyla elde edilir.
   Not: 40 X büyütme ile hafif bir mikroskop kullanarak bir tepki tüp mikroküreler sayısı hesaplanır. Yaklaşık 25 ~ mikroküreler microsphere-PCR güçlendirme için kullanılır. Daha ayrıntılı bilgi adım 3'de.
4. Açıklandığı gibi tüm reaktifler birleştirmek Tablo 6.
5. Örnekleri bir thermocycler yerleştirin ve aşağıdaki koşullar altında asimetrik PCR başlatmak: 25 devir (95 ° C 30 s, 52 ° C 30 s ve 72 ° C 30 s), 85 ° C 5 min için 4 ° C'de tutun
6. Aşağıdaki amplifikasyon, arabellek yükleme x 6 8 μL ekleyin ve her örneğinin 15 μL % 2 özel jel yükleyin. O zaman, 35 dk. 1 için 100 V Elektroforez gerçekleştirmek x TAE (Tris-asetat-EDTA, 40 mM Tris asetat, 1 mM EDTA, pH 8.2) arabellek.

7. confocal mikroskobu edinme

Not: Microsphere-DNA prob hibridizasyon sonuçlarını confocal mikroskop altında görüntüsü. Görüntü analizi ImageJ kullanılarak gerçekleştirilir.

1. Mikroskop sahneye melezleşmiştir mikroküreler bir tutucu içinde düzeltmek.
2. Lazer (helyum/Neon lazer, 543 nm hattı) seçin ve lazer denetiminde açın.
3. Objektif lens mikroskop denetimi içinde seçin.
4. Cy3 ve yapılandırma denetim kanalı için istediğiniz filtreyi seçin.
5. Deneme başlatmak ve örnek gözlemlemek. Confocal mikroskop için ayarlar Tablo 7' de özetlenmiştir.

Sonuçlar

Fabrikasyon polimer mikrosıvısal damlacık tabanlı platform iki PDMS kat (Şekil 1a) oluşur. Üç tür mikrosıvısal kanal ağları mikroküreler oluşturmak için kullanılır: Şekil 1b, karıştırma çözüm ben ve çözüm II için 2) bir yılan gibi kanal ve microsphere için 3) bir polimerizasyon kanal gösterildiği gibi 1) akışı odaklanarak geometri Katılaşma. Tüm kanallar yüksekliği 60 mikron oldu. Karışt...

Tartışmalar

DsDNA kirletici ssDNA amplifikasyon içinde büyük bir sorun vardır. DsDNA amplifikasyon geleneksel asimetrik PCR güçlendirme¹⁵en aza indirmek zor kalır. SsDNA oluşturmak için teknik gelişmeler bizi örnek üretilen iş verimliliğini artırmak etkin olması, Ayrıca, ssDNA yalıtım eksik arıtma verimi ve yüksek maliyetler nedeniyle hala sorunlu olsa da.

Asimetrik PCR ssDNA ile çalışırken kullanılan en zorlu yöntemlerinden biridir. Bu yöntem astar (

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
liquid polydimethylsiloxane, PDMS	Dow Corning Inc.	Sylgard 184	Components of chip
40% Acrylamide:bis solution (19:1)	Bio-rad	1610140	Components of Copolymerizable oligo-microsphere
Ammonium persulfate, APS	Sigma Aldrich	A3678	Hardener of acrylamide:bis solution
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine, TEMED	Sigma Aldrich	T9281	Catalyst of ammonium persulfate
Mineral oil	Sigma Aldrich	M5904	Table 1. Solution III. Component of microsphere reagents
Cy3 labeled complementary oligonucleotide probes	Bioneer	synthesized	Table 3. Sequence information
ssDNA acrydite labeled probe	Bioneer	synthesized	Table 1. Solution I. Component of microsphere reagents
Tris	Biosesang	T1016	Components of TE buffer, pH buffer solution
EDTA	Sigma Aldrich	EDS	Components of TE buffer, removal of ion (Ca2+)
Ex taq	Takara	RR001A	ssDNA amplification
Confocal microscope	Carl Zeiss	LSM 510	Identifying oligonucleotides expossure of microsphere surface
Light Microscope	Nikon Instruments Inc.	eclipse 80i	Caculating number of microspheres
T100 Thermal Cycler	Bio-rad	1861096	ssDNA amplification
Hand-held Corona Treater	Electro-Technic	BD-20AC Laboratory Corona Treater	Hydrophilic surface treatment
Hot plate	As one	HI-1000	heating plate for curing of liquid PDMS
Syringe pump	kd Scientific	78-1100	Uniform flow of Solution I and Solution II
Compressor	Kohands	KC-250A	Flow control of Solution III
Bright-Line Hemacytometer	Sigma Aldrich	Z359629	Caculating number of microspheres