Epitel hücrelerinin Shigella enfeksiyon sırasında CA2 + yanıtları görüntüleme

Özet

Burada, kalsiyum (Ca^{2 +}) yanıt Shigellatarafından enfekte HeLa hücreleri tarafından elde edildi görselleştirmek için protokolleri mevcut. Bakteriyel enfeksiyon parametrelerini optimize ve Ca^{2 +} floresan problar ile görüntüleme, enfeksiyon kinetik büyük bir aralığı içinde bakteriler tarafından indüklenen atipik küresel ve yerel Ca^{2 +} sinyalleri karakterize edilmektedir.

Özet

CA^{2 +} her yerde birden bulunan iyon tüm bilinen hücresel oluşum içinde yer var. Küresel Ca^{2 +} yanıt hücre kaderini etkileyecek iken, bulunduğunuz yere konsantrasyonlarda iç mağazaları veya bir akını plazma zarı kanallardan serbest bırakmak için bağlantılı ücretsiz Ca^{2 +} sitozolik, kortikal hücre işlemleri düzenler. Patojenler uygun ya da ana bilgisayar hücreleri tetikleyici yeniden yapılanma etkileyen büyük olasılıkla Ca sinyal^{2 +} hem küresel hem de yerel ana bilgisayar plazma zarı temel aktin sitoiskeleti istila. Çünkü bu olaylar düşük frekanslarda üzerinde genişletilmiş kinetik sözde Stokastik bir şekilde ortaya çıkabilir, patojenler tarafından indüklenen Ca^{2 +} sinyalleri analiz ele alınması gereken önemli teknik sorunlar yükseltir.

Burada, küresel ve yerel Ca^{2 +} sinyalleri Shigella enfeksiyon epitel hücrelerinin üzerine tespiti için protokolleri raporu. Bu iletişim kuralları, eserler güneşe maruz bağlantılı ve Ca^{2 +} floresan problar uyarma ile ilişkili duyarlilik troubleshot sıkı edinme parametreleri üzerinde tanımlanmış zaman dilimlerinde bir kontrol ederek Shigella işgali. Yordamlar genişletilmiş enfeksiyon kinetik kimyasal sonda Fluo-4 kullanarak sırasında küresel sitozolik Ca^{2 +} sinyallerinin frekans ve genlik titizlikle analiz için uygulanır.

Giriş

CA^{2 +} hücre iskeleti yeniden yapılanma, inflamatuar yanıt ve hücre ölüm yolu ana bilgisayar-patojen etkileşimleri¹' e^,2,3ile ilgili de dahil olmak üzere tüm bilinen hücre işlemleri düzenler. Fizyolojik şartlarda bazal sitozolik Ca^{2 +} konsantrasyonları düşük, nM aralığı yüzlerce ama agonist stimülasyon üzerine geçici artar tabi. Bu varyasyonlar kez plazma ve endoplazmik retikulum membranlar eylem pompa ve kanalları yoluyla salınım davranış göstermek. Bu titreşimler desen dönem, süre ve Ca^{2 +} artar genliği ile karakterizedir ve yanına hangi, sırayla, Ca^{2 +} kod^{4,5 bilinen belirli yanıtlar hücreleri tarafından şifresi çözülür} . Sitozolik Ca^{2 +} konsantrasyonu patolojik şartlar altında sürekli bir artış mitokondrial membranlar permeabilization ve pro-apoptotik veya nekrotik faktörler^{6sürümü ile ilgili hücre ölümüne yol açabilir, 7}.

Shigella, bacillary dizanteri hastalığının bir tip III salgı sistemi (T3SS)^8,9kullanarak konak hücreleri effectors enjekte edilerek epitel hücreleri'yı işgal etti. Konak hücreleri Shigella işgali T3SS tarafından elde edildi yerel ve genel Ca^{2 +} sinyalleri ile ilişkilidir. Gözenek oluşturan gelince toksinler, konak hücre zarlarında ekler ve T3SS effectors enjeksiyon olasılığı için gereklidir T3SS translocon PLC ve inositol (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3) aktivasyonu için sorumlu-bağımlı Ca^{2 +} serbest bırakın. Yerelleştirilmiş PLC stimülasyon ve sitelerde bir atipik uzun ömürlü InsP3 bağımlı Ca^{2 +} Shigella işgali sonucu polimerli aktin birikimi ile birlikte¹⁰serbest bırakmak. Tip III efektör IpgD, bir phosphatidyl 4,5 bisphosphate (PIP2) -4-fosfataz, böylece yerel Ca^{2 +} doğumdan katkıda InsP3 oluşturmak PLC için kullanılabilir substrat miktarı kontrol PIP2, yerel miktarını sınırlar Yanıt bakteri istilası siteleri^11,12. Bu yerel Ca^{2 +} yanıt-e doğru büyük olasılıkla aktin polimerizasyon Shigella işgal siteleri¹⁰katkıda bulunur. Ayrıca Shigellatarafından ancak, elde edildi küresel Ca^{2 +} yanıtları için bakteri istilası işlemi gereksiz ama connexin hemichannels plazma zarı, açılış ve ATP sürümü olarak ekstrasellüler tetikler bir bölme. Yayımlanan ATP bir parakrin şekilde hareket sırayla, Ca^{2 +} salınım yanıt virüslü hücrenin yanındaki hücrelerdeki uyarır. IpgD da düzensiz izole yanıt-e doğru yavaş dynamics ile içine küresel Ca^{2 +} yanıt şekillendirme için sorumludur. Sonunda, uzun süreli bir bakteriyel enfeksiyon IpgD InsP3-aracılı Ca^{2 +} sinyalleri inhibisyonu için yol açar. Ca^{2 +} sinyal ile onun müdahale IpgD bir Ca^{2 +}gecikmeler-bağımlı calpain harekete geçirmek önde gelen odak yapışma yapıları sökme ve erken müfreze ile enfekte hücreleri¹³.

CA^{2 +} sinyalleri patogenezinde önemli yönlerini söz konusu iken, bir mikroorganizma kullanımı bir dizi klasik agonist çalışmalarda karşılaşılmayan teknik sorunlar yükseltir. Açıklanan protokoller burada sık kullanılan floresan Ca^{2 +} kimyasal gösterge Shigella enfeksiyon sırasında yerel Ca^{2 +} sinyalleri karakterize için tasarlanmış Fluo-4 kullanın. Ca^{2 +} sinyal içinde bakteriyel effectors rolü tanımlamak için gerekli onların kantitatif analiz için uygulanan yordamlar yanı sıra bu sinyalleri tespiti için kritik adımları ele alınmıştır.

Protokol

1. hazırlıkları

1. Bakteri hazırlık
   1. Bakteri plaka — AfaE adhesin (M90T-AfaE) ifadeShigella vahşi tipi zorlanma — bir trypticase üzerine soya (TCS) agar içeren % 0,01 Kongo kırmızısı (CR) plaka ve onları 37 ° C'de 18 h için kuluçkaya
      Not: onların tekrarlanabilirlik artırmak için 1.1.1. adımda elde Shigella plakaları 4 ° C'de depolanan ve CR ortamdaki tüm kolonileri sonunda zaman içinde kırmızıya döner çünkü bir hafta içinde kullanılmalıdır.
   2. TCS suyu öncesi kültür çizgi plakalar üzerinden 3 kırmızı kolonileri seçerek aşılamak.
      Not: Tek bir klonu olan virülans plazmid Genetik rekombinasyon uğramıştır malzeme çekme olasılığını sınırlandırmak için bir aşı 3 kolonileri ile gerçekleştirilir.
   3. 16 h 200 devirde 37 ° C'de için titreyen bir kuluçka sıvı bakteriyel kültürlerde büyümek. Ampisilin 75 mg/mL nihai bir konsantrasyon ekleyin. Aşırı antibiyotik büyük virülans plazmid kaybına yol açabilir gibi antibiyotik konsantrasyonları 3 x minimum inhibitör konsantrasyonu aşmaması gerekir.
      Not: Shigella virülans plazmid bakımından uygun antibiyotik konsantrasyonları ile desteklenmiş CR plakaları bakteri kültürleri kaplama tarafından doğrulanması gerekir. Beyaz kolonileri varlığı plazmid kaybı olduğunu gösterir.
   4. 1: 100 seyreltme, bakteriyel öncesi kültür ile Kıbrıslı Türkler kültürü aşılamak. Titreyen bir kuluçka için 200 devirde 2 h 37 ° C'de kuluçkaya. 600 optik yoğunluk emin nm (OD_600nm) olduğunu 0,2 - 0,4.
   5. Bakteri kültürü için 13.000 x g 21 ° c de 2 dk santrifüj kapasitesi ve Pelet EM Orta (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 0.8 mM MgCl₂, 5 mM glikoz ve 25 mM HEPES eşdeğer bir hacmi resuspend pH 7,3 =).
   6. Bir EM arabellek 0.1 son OD_600nm , bakteriyel süspansiyon sulandırmak ve hemen kullanın veya 21 ° C'de depolayın ve 60 dk içinde kullanabilirsiniz.
2. Hücre hazırlık
   1. DMEM kültür HeLa hücreleri 1 g/M glikoz ile % 10 fetal buzağı serum (FCS) ile desteklenmiş ve onları % 10 CO₂37 ° C'de büyümek. TC-DMEM içinde 4,5 g/M glikoz, ile yetiştirilen % 10 FCS ve non-gerekli amino asitler içeren % 10 CO₂37 ° C kuluçka içeren 7 büyümek.
   2. Hücre için bakım, düzenli olarak bir büyüme-iletişim inhibisyon önlemek için hücreleri bölme konfluent devletlere bağlı; Bu bir Ca^{2 +} sonda yükleme/transfection için yüksek verimlilik önemlidir.
   3. HeLa hücreleri üzerine 6-şey plakaları 3 x 10⁵ hücreleri/iyi deneme önceki gün HeLa hücreleri için yoğunluğu, steril 25 mm çapında dairesel coverslips plaka.
   4. TC-7 hücrelerin, trypsinize ve hücreleri saymak. Onları 4 x 10⁵ hücreleri/iyi tohum ve onları bir % 10 CO₂37 ° C'de 5-7 gün kuluçkaya-kuluçka deneyler bir polarizasyon için izin vermek için önce.
      1. Hücre kültür orta denemenin gün kadar her gün yenileyin.
         Not: Cam-alt 35-mm çaplı tek kullanımlık odaları da coverslips içeren wells bir alternatif olarak kullanılabilir. Belgili tanımlık ikinci are kullandıysanız, sıcaklık kontrolü ısıtmalı bir sahne ya da amaç yeterli değildir ve bir termostat kuluçka odası monte mikroskop sahne gereklidir.
3. Denemenin, gün Orta kaldırmak ve hücreleri 3 yıkama x 21 ° C'de 1 mL EM orta ile
4. 3 mM Fluo-4-AM¹⁴ 21 ° C'de 30 dk bir EM arabellekte hücrelerle yük
   Not: alt konfluent HeLa hücreleri yüklenmesini önemli sorun oluşturmaz, polarize TC-7 hücreleri yüklenmesini kez türdeş olmayan ve kötü verimli iken. Bu hücreler için bulduk yükleme verimliliği dispersiyon ajanı eklenmesi tarafından geliştirilmiş — pluronic asit — son konsantrasyonu % 0,1 ve anyon-ışınlama inhibitörü bromosulfophtalein 20 µM için son bir konsantrasyon, EM Fluo-4-AM-içeren. Ratiometric kimyasal kullanımı probes veya genetik olarak kodlanmış-sondalar gerektiren çift edinme yerel Ca^{2 +} yanıt görüntüleme için gerekli satın alma hızı ile uyumlu değil FRET.
5. Örnekleri 3 yıkama x EM ile tampon ve daha da onları EM arabellek 21 ° C'de AM yan hidroliz için izin vermek için 1 ml kuluçkaya. Kullanım Fluo-4 hücreleri hemen içinde sonraki 90 dk (21 ° C'de muhafaza) yüklü.

2. enfeksiyon ve yerel Ca^{2 +} tepkilerin resim alma

1. Bir görüntüleme odası veya cam alt kamara Fluo-4 yüklü hücreleri içeren coverslip yerleştirin. Görüntüleme odasında örnekleri yıkamak veya cam alt tek kullanımlık odası 3 x ile bileşikler potansiyel olarak hücre lizis kaynaklanan kaldırmak için EM arabellek. EM arabellek 1 mL ekleyin.
2. 33 ° C'de ısıtılmış bir ters floresan mikroskop sahnede odası yer
   Not: Bu sıcaklık yerel yanıt görselleştirmek için en uygun sıcaklık Shigella işgali işlemi ile uyumlu ve Ca^{2 +} yanıtları yavaşlama arasında bir uzlaşma olarak seçilir. Daldırma yağ amaç X 63 kullandığımız (NA 1,25 =) faz kontrast halkalar ile donatılmıştır.
3. Mikroskopi alanını seçin ve çekim hızı da dahil olmak üzere ve gerekirse Fluo-4 floresan sinyal en iyi duruma getirmek binning edinme parametreleri, ayarlayın.
   Not: Yerel Ca^{2 +} görüntüleme önemli sorunlar vardır düşük genlik ve yanıtları, küçük süresi satın alma 30 en az her Bayan gerektiren çeşitli ticari olarak mevcut arka ışıklı EM-CCD veya C-ecek kamera gerekli sunmak duyarlılık Fluo-4 kullanarak yerel Ca^{2 +} yanıt bulmak için. Algılama hassasiyeti de duyarlilik veya spontan yanıt-e doğru bir yüksek frekansta Fluo-4 uyarma floresan bağlantılı gibi eserler sınırlamak için önemli bir konudur. Burada, bir LED tabanlı aydınlatma 470, nm, 480 ± 40 nm bant geçiren uyarma filtre, 505-nm dikroik filtre ve 527 ± 30 nm bant geçiren emisyon %5 maksimum şiddeti 1.0 nötr yoğunluk filtresi ile kombine olarak kullanılan bu sorunları en aza indirmek için kullanılmıştır sınırlı süreler alınan akış altında. Yerel Ca^{2 +} sinyalleri tarafından toplu işlemleri 120 s akışların analizi düzenli olarak yapılan. Bu düşük aydınlatma koşullar altında fluorophore photobleaching 2 dk-akarsu satın almalar sırasında gözlendi değil. Farklı alanlar kullanılır sağlanan aynı örnek üzerinde art arda gelen alımlar gerçekleştirilebilir. Genel bir kural olarak, ilk satın alma akışı denetim alanı kendiliğinden yanıt yokluğu sağlamak için bakteri stimülasyon yokluğunda gerçekleştirilir. Spontan yanıt gözlenir, kadar hiçbir yanıt gözlenen örnekleri EM arabellek ile yıkanır.
4. Bakteri için örnek eklemek için EM arabelleği 500 µL odasından kaldırın ve 1.1.6. adımda seçilen mikroskobu alanı taşımak önlemek için uygun bakım ile 0,05 son OD_600nm elde etmek için hazırlanan bakteriyel süspansiyon 500 µL ekleyin; birimleri bakteri ve bakteri hücre örnekleri üzerine homojen dağılımı uygun bir karıştırma sağlamak.
5. Bakteriyel eklenmesi üzerine bir satın alma gerçekleştirmek. Alternatif olarak, bir satın alma 10 dk bakteri hücreleri kullanılan koşullar altında üzerine tortu için gereken süre için karşılık gelen bakteriyel yanı sıra aşağıdaki gerçekleştirin. Satın alma akışı sonunda bakteri hücreleri ve bakteri istilası siteleriyle ilişkili membran katlar başvurarak görselleştirmek için seçili alanın bir faz kontrast görüntü elde etmek.
6. Resim satın almalar, dosyaları tasarruf ve seçimi yeni alanın tüm süreç kapsayacak şekilde süresi için mükellef bulunmaktadır aralıklarla adım 2.5, olduğu gibi satın alma yordamı yineleyin.
   Not: Shigellaiçin satın alma her 5 dk 20 dk, akarsu işgali olaylar çoğunluğu kapsayacak şekilde izin 10 dk bakteriyel sedimantasyon takip bulduk.
7. Satın alma yordamı sonunda 2 µM örneklerin Ca^{2 +} sinyalleri maksimal genliği belirlemek için Ca^{2 +} ionophore ionomycin son bir konsantrasyon ekleyin. Görüntüleri genellikle az 10 dk için sinyal istikrar kadar her 3-5 s.
8. Floresans sinyali yokluğunda, Ca^{2 +}belirlemek için 10 mM son bir konsantrasyon, CA^{2 +} şelatör EGTA ekleyerek izleyin. Görüntüleri genellikle az 10 dk için sinyal istikrar kadar her 3-5 s.
   Not: genel Ca^{2 +} varyasyonları nispeten yavaş dinamikleri nedeniyle, bırakmak için aynı mikroskobik alanda birbirini izleyen tedaviler sırasında Imaging Ca^{2 +} her 3-5 s (akış Mod'da değil), bu satın alma gerçekleştirmek.

3. analiz

1. Sitozolik Ca^{2 +} varyasyonları zamanla ΔF/F burada ΔF faiz (ROI) bölgenin ortalama floresans yoğunluğunu çeşitlemeyi gösterir₀ve F₀ yüzdesi olarak aynı yatırım getirisi, hangi temel floresans hızlı bir hücreleri yoksun alanının ilgili olmayan bölgenin çıkarılır.
   1. Bazal floresans düzeyleri her hücre için taban çizgisi düzeylerine karşılık gelen farklı alanlardaki kaldırmak; Bu düzeyleri belirsizliğe yer bırakmadan nedeniyle düşük frekans belirlenebilir ve nispeten yerel Ca^{2 +} yanıtlarında verilen akım alma süresi kısa.
      Not: okudu patojenik modeli ve sorulan sorular ile ilgili yanıt çarpıcı özellikleri ölçmek. Klasik, çeşitli parametreler frekans yerel veya genel Ca^{2 +} yanıt, yanı sıra süresi, genlik ve bu tepkilerin frekans gösteren hücre de dahil olmak üzere Ca^{2 +} sinyalleri, analiz etmek için dikkate alınır. Shigella ve yerel yanıt durumunda, analiz bir başka önemli yönü kayma yanıtları bakteri istilası siteleri ile birliğidir.
2. Genel veya yerel yanıt gösterilen duyarlı hücre yüzdesi ölçmek için ROIs hücrelerde, zaman serileri Fluo-4 yoğunlukta varyasyonlar için karşılık gelen çizmek.
   1. Bir yanlış pozitif Puanlama önlemek için yerel Ca^{2 +} yanıt, ortalama floresans yoğunluğu hücre temel üç kat yukarıda arka plan varyasyonları veya bir süre en az 200 ms, bir genliği gibi tanımlamak için sıkı parametrelerini ayarlamak.
      Not: genel bir kural olarak, hatta küçük yerel Ca^{2 +} yanıt herhangi bir arka plan gürültü--dan onların profili tarafından ayrılır. ROIs bulunduğunuz yere tespiti için izin vermek için yeterli floresan sinyallerini entegre için yeterli büyüklükte olması. Fluo-4 algılama yoğunluğuna bağlı olarak, bu ROIs daireler için 2-5 mM arasında değişen fan çapı aynı olmayabilir.
   2. Ortalama Fluo-4 floresan yoğunluğu aynı hücre yanıtları yerel veya genel olup olmadığını belirlemek için farklı bir alanda 2 bölgelerde varyasyonları ölçmek.
      Not: Çok sayıda hücre Analizi görüntüleme yazılımı ortalama floresans yoğunluğu varyasyonları on-line ekran görüntüsünü seçili bölgeler için zaman içinde izin kullanımı tarafından yönetilir. Piyasada bulunan görüntüleme yazılımı böyle bir seçenek var, ama bu da Yatırım getirisi yoğunluğu evrim eklentisi kullanarak Icy freeware kullanarak gerçekleştirilebilir.
   3. Yerel yanıt gösterilen hücreleri yüzdesini belirleyin.
      Not: Bu yüzde desteklemek için yeterli sayıda olmalı mikroskobu alan analiz toplam sayısı hesaplanır bir istatistiksel olarak anlamlı bir non-parametrik test kullanarak.
   4. Yerel yanıt süresini belirlemek.
      Not: Yerel Ca^{2 +} yanıt-e doğru daha fazla süre aralıkları göre ayırt (Yani, daha az 500 ms, 5 ila 10 s arasında veya yukarıda 10 s) ve onların dernek Shigella işgal siteleri ile.
3. Yanıtları genliği ölçmek. İlk olarak, adım 2.1.7 olduğu gibi kararlı maksimal Ca^{2 +} ve hücre arka plan düzeyleri ayarlama. Bu yana Fluo-4 yük her hücre için farklı olabilir, bu tespitler alanında tek tek hücreler için gerçekleştirin.
   1. Yanıtları genliği göreceli bir maksimal yanıt yüzdesi olarak hızlı.
   2. İstatistiksel olası yanıt genliği örnekleri arasındaki farkları çözümlemek için parametrik test ardından bir normallik test kullanarak sınama yapın.
   3. Karşılık gelen faz kontrast Albümdeki görselleştirildiği bakteriyel kaynaklı membran katlar için onların anılan sıraya göre yerelleştirme tarafından derneğin bakteri istilası siteleri göre bu tepkilerin belirlemek.

Sonuçlar

Shigella işgali atipik uzun süreli yerel Ca^{2 +} Yanıt ile ilişkilidir:

Yukarıda belirtilen iletişim kuralı, ardından Fluo 4 yüklü HeLa hücreleri WT Shigella ile meydan ve akarsu satın almalar Ca^{2 +} sinyalleri analiz etmek için yapıldı. Temsil edici bir deney Şekil 1' de, tek bir hücre ve karşılık gelen faz kontrast görüntü (

Tartışmalar

Bu el yazması Shigellagenişletilmiş kinetik sırasında genel Ca^{2 +} yanıtlarının yanı sıra Shigella Invasion kısa kinetik sırasında yerel Ca^{2 +} sinyalleri izlemeye mühendislik protokolünü açıklar. Aşağıda, bu Ca^{2 +} tespiti en iyi duruma getirmek için ele alınması gereken sorunlar bulunabilir anahtar biyolojik süreçleri ile herhangi bir girişim en aza indirerek sinyalleri.

Kimyasal vs. Ca^{2 +} probları g...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fluo-4 AM	Invitrogen	F14201
Metamorph version 7.7	Universal Imaging
CoolLED illumination system pE-2	Roper Scientific
micro-dish 35 mm, high	IBIDI	81156
Trypticase Soy (TCS) broth	Thermofisher		B11768
TCS agar	Thermofisher		B11043
Congo red	Sigma-Aldrich		75768
M90T-AfaE	Sun et al. 2017	Shigella flexneri serotype V. expressing the AfaE adhesin
ipgD-AfaE	Sun et al. 2017	isogenic ipgD mutant strain expressing the AfaE adhesin