JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, dağınık şekilde ve geçici kene cesaret bir değiştirilmiş bütün-mount In situ hibridizasyon yaklaşım kullanarak uygun microbiota varlığı değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Özet

Bulaşıcı hastalıklar eklem bacaklılar vektörel çizimler tarafından iletilen insan sağlığı dünya çapında önemli bir tehdit devam. Bu hastalıklar neden patojenleri yok yalıtım modunda vektör kolonize zaman; Bunun yerine, onlar büyük olasılıkla etkileşimleri gut lümen içinde ikamet mikroorganizmalar ile meşgul. Vektör microbiota patojen iletim birkaç vektör kaynaklı hastalıklar için önemli bir rol oynamak için kanıtlanmıştır. Ixodes scapularis kene, Borrelia burgdorferi, dahil olmak üzere birçok insan patojenleri vektör gut yerleşik bakteri kene iletim patojenlerin etkisi olup olmadığını tespit değil. Biz yöntemleri olası türler arası etkileşimler kene gut daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırmak için kene gut ile ilişkili bakteriler bileşimi karakterize için gerektirir. Bütün Dağı in situ kullanarak özellikle bakteriyel tür ile ilişkili RNA transkript görselleştirmek için hibridizasyon bereket ile ilgili nitel veri toplama ve sağlam doku microbiota dağıtımını sağlar. Bu teknik değişiklikler gut microbiota ortamında besleme kene boyunca incelemek için kullanılan ve kene genlerin ifade analiz etmek için de uygulanabilir. Bütün kene boyama hedef RNA dokusunda üç boyutlu yeniden yapılandırma için gerek kalmadan brüt mekansal dağılımı hakkında verim bilgi cesaret ve kez sıralama tabanlı zihnimi karıştıran çevresel kirlenme tarafından daha az etkilenir karmaşık mikrobiyal topluluklar çalışma için sık kullanılan bir yöntem. Genel olarak, bu tekniği daha iyi kullanılabilmesi için değerli bir araç vektör-patojen-microbiota etkileşimleri ve hastalık iletim içindeki rolü anlamak olduğunu.

Giriş

İnsan ve hayvan patojenler eklem bacaklılar vektörel çizimler tarafından aktarılan dünya çapında bulunur ve bulaşıcı hastalıklar yaklaşık % 20 genel olarak1, ama etkili hesap ve çoğu bu patojenlerin karşı güvenli aşı mevcut değildir. Oransal ve hemen hemen tüm metazoans3 sağlık şekillendirme ve microbiome2, topluca bilinen komensal, simbiyotik ve patojen mikroorganizmaların önemli rol anlayışımızı genişletiyor. Şimdi eklem bacaklılar vektörel çizimler patojenlerin Ayrıca gut microbiota liman ve çeşitli vektör kaynaklı patojenler4,5etkilemek için bu vektör ilişkili microbiota gösterilmiştir açıkça anlaşılmaktadır. Eklem bacaklılar microbiome eubacteria, Arkeler, virüsler, ökaryotik mikroplar gibi tek hücreli, nematodlar ve mantarlar6oluşur. Ancak, baskın araştırma odak eubacteria üzerinde nedeniyle, kısmen, işaretleyici genler ve belirli bakteriyel üyelerini tanımlamak için başvuru veritabanları kullanılabilirliğini olmuştur.

Ixodes scapularis, kene vektör Borrelia burgdorferi7, de dahil olmak üzere birden çok insan patojenlerin ile bir odak hastalığının Lyme hastalığı, bir mikrobiyal görselleştirme teknik optimizasyonu amaçlı yapıldı. kene gut microbiota vektör-patojen etkileşimleri bağlamında anlayışımızı geliştirmek. Kene microbiome alanında cevaplanması gereken birkaç soru kalır. Gut kene ve yatay olarak aktarılan patojenler bağlamında gelen patojen arasındaki ilk genişletilmiş karşılaşma sitesidir; Bu nedenle, vektör vektör-patojen etkileşimleri oransal olarak gut microbiota rolünün anlaşılması anlamlı yorumlara ortaya çıkaracaktır. Kene kan yemek sindirim, burada kan yemek bileşenleri alır işlenmesi intracellularly8yer benzersiz bir moduna sahip. Gut lümen görünüşte kene beslemeleri kan yemek içerecek bir gemi olarak hizmet vermektedir ve besin sindirim ve asimilasyon besleme birkaç gün doğmak ve sonrası repletion devam etmek. Kene tarafından besleme sırasında alınan patojenler gut lümen bloodmeal ile birlikte girin ve böylece lümen kene, patojen ve ikamet microbiota arasındaki etkileşimlerin birincil bir site olur. Sindirim repletion ve deri değiştirme iksodid kene ile devam ederken, gut yapısal ve işlevsel değişiklikler9uğrar. Kompozisyon ve gut bakteri mekansal organizasyonu değişen gut çevre ile uyum içinde değişebilir olasılığı mevcuttur. Bu, bu nedenle, yerleşik bakteri tamamen kene, patojen ve gut microbiota etkileşimi anlamak için kene gut mimarisini anlamak önemlidir.

Ana bilgisayar ilişkili microbiota rutin olarak açıklamak için moleküler teknikleri yükseltmek ve bakteriyel 16S ribozomal DNA (rDNA) sıra ile yüksek-den geçerek paralel sıralama stratejileri10 kullanmaktadır. Bu sıralama stratejileri aşmak gerek axenic belirli bakteri kültürleri elde etmek ve tüm bakteriyel Üyeler örnek temsil ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Yine de, bu stratejileri bona fide sakinleri çevre contaminations ayırt etmek için yetersizlik tarafından şaşırmış. Ayrıca, örnekleri, keneler, küçük içinde büyüklük ve bu nedenle düşük microbiota özgü DNA içeren gibi değerlendirmek verir, çevre kirletici amplifikasyon olasılığı artan11 olduğunu ve belirsiz yorumlanmasında sonuçları microbiome kompozisyon. Bu nedenle, belirli uygun bakteri görselleştirme ile birlikte işlev karakterizasyonu tanımlamak ve kene microbiome geçici ve dağınık şekilde ayırt için önemli olacaktır. Bu hedef doğrultusunda, biz bütün Dağı RNA in situ hibridizasyon kullandı. Bu teknik gen ifade desenleri, organ ve embriyo12,13,-14 değerlendirmek için rutin olarak kullanılan ve ilgi tüm örnek ifade semiquantitative analiz sağlar. Bu doku bölümleri kullanmak ve genellikle kesitli malzeme tüm organları15ifadede tahmin etmek için sayısal bir derleme ile geniş Analizi gerektirir geleneksel in situ hibridizasyon teknikleri farklıdır. Burada bütün Dağı genelde bütün organizmalar12' ye anlamına gelir iken, Bütün Dağı bütün cesaret veya organları belirtir. Kene gut microbiota mimarisini değerlendirmek için bütün Dağı RNA in situ hibridizasyon yaklaşımı kullanmanın yararları kesişmeyi. Kene gut boyutu16' değişen her çifti, divertikül, 7 çiftlerinden oluşur. Eğer bu divertikül arasında herhangi bir kene biyoloji, bağlamında anladım değil işlevsel farklılıklar microbiota veya kene-patojen etkileşimleri kene. Gut divertikül rüptürü manipülasyonlar, gut microbiota gut lümen veya gevşek gut microbiota kayma lokalizasyonu yanlış yorumlanmasına sonucu ile ilişkili mevcut yerinden. RNA in situ hibridizasyon floresans etiketli daha önce kene gut transkript17 sabitleme ve bireysel gut divertikül sonda hibridizasyon, B. burgdorferi yerelleştirmek üzere açma incelemek için kullanıldığında vardır transkript parafin gömülü tüm keneler18kesit tarafından. Bu her iki yaklaşımın gut microbiota mimari etkilerdi hibridizasyon önce kene dokuların manipülasyon gerektirir.

Bu raporda, Bütün-mount situ hibridizasyon (WMISH) kullanarak uygun kene gut microbiota incelemek için iletişim kuralı biz ayrıntılı olarak tarif. Bütün Dağı RNA in situ hibridizasyon varlığı küresel bir anlayış ve belirli gut bakteri gut değişik bölgelerinde bolluk sağlar ve kene gut biyoloji patojen kolonizasyon bağlamında yeni görüşler teşvik ve iletim. Ayrıca, algılama kene gut uygun bakterilerin RNA probları karşı belirli bakteriyel RNA yönetmen kullanımına izin verir.

Protokol

1. DNA şablonları hazırlanması

  1. 16S rRNA sıra belirli bakteriyel her cins NCBI veritabanını ve tasarım polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) uyumlu ileri download ve cins özel bölgeler (~ 200-250 baz çifti uzun) daha önce anlatıldığı gibi yükseltmek astar ters 19. RNA probları bakteriyel bazı cinsler için ticari olarak olsa da aynı zamanda açık kaynak veritabanlarının SILVA20,probeBase ve21 22 için çevrimiçi kaynaklar rRNA hedefli oligonükleotid sonda ve astarlar, bakın kullanılabilir.
    Not: Özel-özel cins olan gen bölgeleri seçin ve tasarlanmış astar ilgili bakteriyel cins yükseltmek değil emin olmak önemlidir. Bu gen/cins özel sonda hibridizasyon elde etmek için önemlidir.
  2. Fareler, 24, 48 veya 72 h kene cesaret teşrih ve RNA ve açıklanan önceki23olarak kene bağırsaklar dan cDNA hazırlamak için keneler besleme. PCR şablonuna yükseltmek gibi bir thermocycler kullanarak cins özel amplicons cDNA kullanın. PCR-ürün/amplicon bir aliquot üzerinde % 1.5 özel jel çalıştırın ve amplicon için beklenen boyut görüntüleme sistemi bir jel kullanarak ultraviyole (UV) ışık altında görselleştirme tarafından karşılık geldiğini onaylayın.
  3. Bakteriyel 16S ribozomal RNA amplicon ilgi RNA polimeraz Rehberleri bakteriyofaj polimerazlar (SP6, T7 veya T3) uygun içeren bir piyasada bulunan TA vektör içine (Tablo reçetesi) klon. Amplicon kimliğini ve yön ile ilgili her Rehberleri bir klonu onaylamak için klonlar sıra. Buna göre duygusu veya antianlamlı RNA oluşturmak için seçim organizatörü (Şekil 1) probları belirlemek.
  4. Plazmid 30 µLfor üretici tarafından önerilen sıcaklıklarda 2 h reaksiyon hacmine uygun bir Restriksiyon enzimi ile 1 mg linearize. Enzimleri duygusu veya antianlamlı sonda (Şekil 1) oluşturmak için kullanılması gereken organizatörü göre seçin. 2 µL % 1'özel jel üzerinde Özet tepki görselleştirme tarafından doğrusallaştırma doğrulayın.
  5. Bir piyasada bulunan PCR ürün sütun arıtma kiti kullanılarak sindirilir DNA'ın kalan 28 µL arındırmak ve DNA toplama spektrofotometre tarafından ölçmek.
    Not: Arka plan karşılık gelen antianlamlı sonda çok daha yüksek boyama bazı anlamda probları neden olabilir ve diğer seçenekleri keşfedilmeyi gerekebilir. Alternatif negatif denetimleri örneği veya hibridizasyon kendine özgü bir model verir başka bir robot temsil edilmeyen dizileri kodlama plazmid içerir.

2. Digoxygenin-UTP RNA probları inşaatı

  1. 100 mm UTP, 10 mM digoxygenin-UTP 25 µL ve 10 µL her 100 mM ATP, GTP ve CTP 1,5 mL santrifüj tüpü içinde 7,5 µL birleştirerek nükleotit karışımı hazırlayın.
  2. Vitro transkripsiyon gerçekleştirmek piyasada bulunan T7 veya Sp6 RNA polimeraz kitleri kullanarak, 1 µL nükleotit Mix (adım 2.1) ve 0,25 - kullanarak 1 µg şablonunun DNA. Birim su ile 20 µL kadar getir. Birleştirmek ve spin darbe tüpü hafifçe vur. 2.5-3 h 37 ° C'de kuluçkaya.
    Not: Sonda inşaat sindirilir plazmid konsantrasyonları 7 ng/µL düşük ama 15-25 ng/µL Bu adım mesafeden tipik konsantrasyonları ile başarılı olmuştur. Transkripsiyon tepki de gecede 37 ° C'de inkübe, ama bu önemli ölçüde RNA verim artırmaz.
  3. DNaz 1 µL ekleyin (2.000 adet/µL) ve 10 dk 37 ° C'de kuluçkaya. 10 dk fazla olamaz veya enzim RNA aşağılayıcı başlayabilir.
  4. Buz gibi 7.5-8 M Lityum klorür 30 µL ve 30 µL RNA çökelti nükleaz ücretsiz soğutulmuş su ekleyin. Karıştırmak için tüp fiske. Yağış RNA gecede-20 ° C'de devam etmek için izin
  5. Santrifüjü 17.000 x g 4 ° C'de 20 dk için de tarafından RNA toplamak Pelet kez 1 mL taze hazırlanmış % 75 etanol dietil pyrocarbonate (DEPC) su ile yıkayın, sonra aralıklarla tekrarlayın.
  6. Kaldırmak ve süpernatant atmak, tüp temiz kağıt havlu üzerine ters çevir ve 10 dk. Resuspend için Pelet nükleaz ücretsiz su kurumasını sağlar. Pelet kolayca görünür durumdaysa, 25 µL resuspend. Pelet içinde 15-20 µL. çok küçük veya görünür değil, resuspend ise RNA konsantrasyon tahmini spektrofotometre tarafından elde etmek.
    Not: 200-500 ng/µL tipik RNA konsantrasyonları arasındadır.

3. görsel olarak RNA RNA saflık değerlendirmek için RNA formaldehit jel elektroforez tarafından probları

Dikkat: Formaldehit bir inhalasyon tehlike teşkil etmektedir; Bu nedenle, RNA jel analiz bir duman Hood için gerekli çözümler üretmek. Etidyum bromür şüpheli bir kanserojen olduğu; özenle hallederim.

  1. % 1 formaldehit özel jel24 daha önce açıklanan ve jel RNases ücretsiz bir jel kutusunda döküm olarak hazırlamak. Serin bir kez, arabellek (1 x bezleri pH 7,0, %5 formaldehit) çalıştıran x 1 jel kutusunu doldurun.
  2. Örnek arabellek (5 µL 400 mg/mL arasında etidyum bromür, bezleri, 35 µL formaldehit ve 100 µL formamide x 20 µL 10) hazırlayın. RNA inceleyebilirsek (adım 2.6) 2 µL örnek arabellek 8 µL ile birleştirin. 10 dk 70 ° C'de kuluçkaya.
  3. RNA yükleme arabellek 5 mL % 50 gliserol, 1 mL % 10 formaldehit, 40 mg bromophenol mavi, 40 mg ksilen cyanol ve 0,5 M EDTA (pH 7.5) 20 µL birleştirerek hazırlayın. Bu arabellek-20 ° C'de kullandıktan sonra saklamak
  4. Yükleme arabelleği 3 µL RNA örnek adım 3.2 ekleyip karıştırın. Örnek tüpler buz üzerinde tutun.
  5. Bütün numune hacmi adım 3.4 jel yükleyin. Bir aliquot tek iplikçikli RNA merdivenin alongside RNA boyutu doğrulamak için yükleyin. Jel 100 V çalıştırmak veya mavi boya jel aşağı yaklaşık % 75'i geçirir dek indirin. Bir jel görüntüleme sistemi kullanarak UV ışık altında RNA görselleştirin.
    Not: Kaliteli RNA prob prob (Şekil 2, lane 1) beklenen boyutuna karşılık gelen bir hareketlilik ile ayrı bir grup olarak görünmesi gerekir. Eğer soruşturma bu kullanılmaması gereken bir yaygın ve smeary band (Şekil 2lane 2) görünür.

4. Gut koleksiyonu ve fiksasyon kene

  1. Zaman ilgi için fareler üzerinde beslenen Ixodes scapularis perileri toplamak.
    Not: Bu teknik amacı gereği, 48 veya 72 s iş için en iyi keneler beslenir.
  2. Kene gelen bağırsak MEMFA (Tablo 1) mümkün olduğunca çok organ hasar kaçınarak bir diseksiyon mikroskop altında bir cam slayt üzerinde incelemek. Bir kene MEMFA 20-30 µL içinde temiz mikroskop slayttaki bir yer. Steril yüksek karbon çelik tıraş bıçağı #11 dilim baş bölge çifti kene kene vücut bırakarak kalkan kullanarak. Gut divertikül ve tükürük bezleri vücut kütikül dışarı itmek için vücut hafifçe bastırın. Tükrük bezleri ve gut ayırmak ve cesareti jilet üzerinde oymak.
  3. Cesaret 500 µL MEMFA içeren bir 1,5 mL tüp içine toplamak. Nazik 1 h için sallanan ile Oda sıcaklığında tüp kuluçkaya veya bir gece 4 ° C'de
    Not: Kene tükürük bezleri de disseke ve benzer şekilde sabit lekeli ve.
  4. Doku yavaşça 1 mL buz gibi % 100 etanol ile 3 kez yıkayarak kurutmak. Santrifüjü doku zarar verebilir gibi doğal olarak her yıkama arasında tüp altına lavabo cesaret ver. Uzun süreli depolama için örnekleri-20 ° C'de % 100 etanol içinde tutmak

5. inşaat kafes örnek sepetleri ve 24-şey sepet tutucu

  1. Dipleri 2 mL veya 5 mL kapalı ısıtmalı tek taraflı jilet bir neşter kullanarak ek alıcı santrifüj tüpleri kesti.
    Dikkat: Bıçak kesim tamamlamadan önce birkaç kez yeniden isitilan gerekebilir.
  2. 110 µm naylon mesh karelerinin biraz yeni tüp açılış daha büyük kesti. Tüp altına mesh iyi bir mühür yapılana kadar onları birlikte hafifçe sıcak bir tabak orta-düşük ateşte basarak bond. Soğumaya bırakın, mesh ve tüp arasında boşluk olduğundan emin olun ve aşırı kafes kenarları kırpın.
  3. Öyle ki adım 5,2 yapılan örnek sepet dudak Hole'da oturmak ve aracılığıyla, nerede örnek sepetleri dipleri oturup ta wells içinde konulduğunda bir set-up verimli değil düşmek bir 24-şey plaka kapak delik kesme kapak delik.
  4. Bu monte sepet tutucu sepetleri bir tabak içinde in situ hibridizasyon Protokolü tamamı için göreli kolaylıkla diğerine aktarmak için kullanın. Bir kuluçka meydana gelen iken, diğer plaka için sonraki yıkama hazırlanan iki 24-şey tabak kullanın.

6. in Situ hibridizasyon: 1. gün (zamanlama: 4-5 h)

  1. Transfer cesareti için örnek sepetleri etiketli, deneysel koşulla ayrılmış ve RNA sonda amaçlanan.
    Not: koşul çoğaltır arasında doğal varyasyon için hesap başına en az 5 cesaret leke.
  2. Yavaşça hava kabarcıkları dokusu içine yavaş yavaş serum fosfat tamponlu %0.1 non-iyonik yüzey aktif (PTw; oranını artırarak tanıtımı önlemek için örnekleri suyla temasa Tablo 1) etanol için yıkar.
    Not: Komple tüm 24-şey sepet sahibi nazik ajitasyon ile ortam sıcaklığı, aksi belirtilmediği sürece yıkar. Aliquot 500-600 µL yıkama çözümler içine cesaret her sepette tamamen batık her tür sahibinin. RNA yıkımı önlemek için su DEPC tedavi ile tüm çözümleri hazırlayın.
    1. Örnekleri 5 min için 500 µL % 100 etanol içinde yıkayın.
    2. % 75'i örnek sepet başına en az 500 µL hazırlamak, % 50 ve % 25 etanol içinde PTw. örnekleri 5 dakika içinde en yüksek etanol konsantrasyon en düşük hareket her etanol çözüm yıkanmasında tarafından suyla temasa.
    3. 4 kere 5 min için örnekleri PTw içinde yıkayın.
  3. Örnekleri İndinavir K ile permeabilize (10 µg/mL) PTw 5 dk içinde.
  4. Doku hibridizasyon için RNA probları ile hazırlayın.
    1. İki kez 6.2 500 µL trietanolamin tampon (0.1 M, pH 7,0-8.0) her 5 min için nazik ajitasyon ile ortam sıcaklığında 24-şey sepet tutucu (örnekleri Amin-Alerjik bir ortamda korumak için,Tablo 1) açıklandığı gibi örnekleri yıkayın.
    2. Trietanolamin tampon (0.1 M, pH 7,0-8.0) 5 min için örnekleri iki kez 500 µL % 0,25 asetik anhidrit ile tedavi, sonra örnekleri PTw 5 min için iki kez yıkayın.
      Not: Non-spesifik elektrostatik etkileşimler önlemek ve mRNA için sondanın özel bağlayıcı emin olmak çok önemlidir olumlu şarj etkisiz hale getirmek için ücretsiz aminler asetik anhidrit acetylates.
    3. PTw 500 µL % 4 paraformaldehyde ile 20 dk için cesaret düzeltmek, daha sonra 5 kere 5 dk her PTw içinde yıkayın.
    4. 500 µL hibridizasyon arabellek /in titreyen bir su banyosu içinde nazik ajitasyon ile 24-şey sepet sahibi için 1,5-2,5 h 60 ° C'de 24 iyi plaka (Tablo 1) örneklerinde kuluçka tarafından prehybridize. Gün 2 Protokolü (adım 7.1) yeniden kullanmak için prehybridization adım hibridizasyon arabelleği kaydedin.
    5. Sonda hibridizasyon çözümleri RNA sondalar son konsantrasyonu 1 µg/ml hibridizasyon arabellekte sulandrarak hazırlayın.  Kuluçkaya gecede, titreyen bir su banyosu (Tablo 2) nazik ajitasyon ile 60 ° C'de 24-şey sepet tutucu prob hibridizasyon çözümleri ile örnekleri. Hibridizasyon çözüm buharlaşma önlemek için sepet tutucu alüminyum folyo ile rahatça taşıyan plaka kapak.

7. in Situ hibridizasyon: 2. gün (zamanlama: 4.5-5.5 h)

  1. Örnekleri sonda hibridizasyon çözümlerinden kaldırmak ve önceki gün ayrılmış hibridizasyon arabelleğinden içine koyun. 3 min için nazik ajitasyon ile 60 ° C'de kuluçkaya.
    Not: Sonda hibridizasyon çözümleri-20 ° c yeniden kullanım için ilâ 3 kere depolanabilir.
  2. Serum sodyum sitrat arabellek (SSC) x 2 sulandrarak 20 tarafından hazırlamak x SSC DEPC tedavi su (Tablo 1). Örnekleri 3 dk ile 2 x SSC için iki kez, o zaman 2 ile 20 dk için 3 kez yıkayın x SSC 60 ° C'de sonda ve hibridizasyon arabelleği tüm izlerini silmek için.
  3. Bir (20 µg/mL) ve RNase T RNase ile tedavi1 (10 µg/mL) 2 x SSC 37 ° C'de 30 dk için tek kaldırmak için zor durumda RNA prob ücretsiz temsil eden sigara-melezleşmiştir RNA.
  4. 2 ile bir kez yıkama x SSC oda sıcaklığında 10 dakika için. 0,2 hazırlamak sulandrarak 2 tarafından x SSC suda DEPC tedavi x SSC sonra iki kez 0,2 ile yıkayın aşırı RNases kaldırmak için x SSC 60 ° C'de 30 dk için.
  5. Maleik asit tampon (MAB; 500 µL ile iki kez yıkamak Tablo 1) 10 dakikadır her.
  6. 1.5-2 h için çözüm (MAB % 2 engelleme reaktif) engelleme ile örnekleri kuluçkaya.
    Not: Engelleme reaktif çözülmeye zor olabilir; nazik Isıtma dağılmasına yardımcı olur.
  7. Anti-digoxigenin alkalin fosfataz Birleşik 500 µL çözüm engelleme 1:3,000 seyreltme, antikor, engelleme çözüm yerine ve yaklaşık 4 h için oda sıcaklığında veya 4 ° C'de gecede kuluçkaya.

8. in Situ hibridizasyon: 3. gün (zamanlama: bir gecede 6 h)

  1. Örnekleri ile 500 µL MAB aşırı antikor kaldırmak için her 30 dk için en az 5 kez yıkayın.
    Not: Bu yıkama esnektir ve 1-2 h için uzatılabilir veya 3-4 yıkama etkinliği en az düzeyde etkisi ile 4 ° C'de bir gecede yıkama için yerine olabilir.
  2. Alkalen fosfataz arabelleği, pH 9,5 (AP arabellek; ile 5 min için iki kez yıkamak Tablo 1).
  3. Son yıkama chromogenic substrat alkalen fosfataz (Tablo reçetesi) için 500 µL değiştirerek renk reaksiyon başlar. Alüminyum folyo ile örnek plaka kapak ve 3 - 5 s veya 4 ° C'de gece için oda sıcaklığında devam boyama izin Boyama reaksiyonu belirli aralıklarla overstaining önlemek için diseksiyon mikroskop altında doku görüntüleyerek izlemek.
    Not: boyama tamamlandığında, bir mor renk tonu gözlerinin içine mikroskop altında antisens probed örnekleri tarafından algılanabilir ama doku çok karanlık olmak için izin verilmemelidir. Boyama 4 ° C'de çok yavaş devam eder ve en fazla 20-24 saat sürebilir.
  4. 5 dakika içinde 500 µL MAB yıkanmasında tarafından renk reaksiyonu ve ardından doku gecede Bouin'ın çözümde düzeltmek.
    Dikkat: Bouin'ın çözüm bir duman başlıklı işlemek; aşındırıcı bir kanserojen olduğu.

9. in Situ hibridizasyon: 4 gün (zamanlama: 3-3.5 h)

  1. 1 örnek sepet başına en az 7 mL hazırlamak sulandrarak 20 x SSC su DEPC tedavi x SSC. Bouin'ın çözüm 1'örnekleri 4-6 kez % 70 etanol ile yıkayarak çıkarın doku artık sarı olana x SSC.
  2. %1 75, % 50 ve % 25 etanol çözümlerinde örnek sepet başına 500 µL hazırlamak x SSC. Örnekleri 5 min için en yüksek etanol konsantrasyon en düşük için doku rehydrate hareketli her çözümde yıkayın. İki kez 5 dk içinde her 1 yıkama x SSC.
  3. Çamaşır suyu çözüm (Tablo 1) örneklerinde bir duman başlıklı bir lightbox üzerinde 90 dk için kuluçkaya.
    Not: Bu adım herhangi bir pigmentasyon örnekleri veya Bouins eriyik-e doğru var olmak çıkarmak--dan renklendirme sağlar ve sonda sinyal açık görselleştirme için geliştirir.
  4. 1 500 µL iki kez örnekleriyle yıkama x SSC 5 min için.
  5. Çok az hasar bağırsaklarıyla örnek sepet yeni bir 24-şey plaka bir kuyunun içine ters çevirme tarafından yeniden konumlandırmak ve % 70 etanol transfer pipet kullanarak kafes alt aracılığıyla ile yıkayın. -20 ° C'de gerekirse depolar.
  6. Şekil 3' te, gösterildiği gibi birden fazla örnekleri boyama şekillerinin genel bir bakış elde etmek için herhangi bir alan parlak mikroskopla % 70 etanol 24 iyi-plaka ve görünüm cesaret korumak. Şekil 4, Şekil 5' de gösterildiği gibi bireysel cesaret alan parlak mikroskop altında incelemek için, ve Şekil 6, %100 gliserol coverslips altında cesaret dağ. Bir plastik spatula yavaşça en az hasarla doku işlemek için kullanın.
    Not: Gliserol yüksek viskozite doku sıkıştırma tarafından neden olduğu zararlara karşı korunmasına yardımcı olur ve doku daha yüksek büyütme oranlarında en iyi şekilde görüntülenebilir öyle ki divertikül dikkatli konumlandırma sağlar.
  7. Esir alma imge üstünde mikroskop mikroskop belirli görüntü yakalama yazılımı (Tablo reçetesi) kullanarak ve genel bir resim düzenleme yazılımı için TIFF görüntü olarak dışa aktarın. Deneysel tedaviler göreli Boyama farklılıkları ölçmek için genel görüntü analiz yazılımı (Tablo reçetesi) yükleyin. Görüntüyü analiz yazılımı içinde açın ve boyama piksel yoğunluğu ölçümü ve boyama çubuk grafik araziler hesaplamak için belgili tanımlık öğretim içinde belgili tanımlık bilgisayar yazılımı kullanın.

Sonuçlar

Ölçüm ve RNA probları kalitesinin tahmini boyama başlamadan önce kritik öneme sahiptir. Vitro transkripsiyon verimliliği yüksek miktar ve kalite meydana bağlıdır. Biz düzenli olarak RNA probları saflık ve sonda transkripsiyon reaksiyonlar tarafından oluşturulan miktarı doğrulamak için bir formaldehit jel üzerinde görüntülenir. Sondalar parlak, ayrı gruplar (Şekil 2) görünmesi gerekir. RNA konsantrasyon spektrofotometrik ö...

Tartışmalar

Bu bir eklem bacaklılar vektör patojenlerin microbiota çalışmaya bir bütün-mount situ hibridizasyon (WMISH) tekniği ilk kullanmaktır. Bizim iletişim kuralı bir geliştirme Drosophila ve kurbağa embriyosu25,26çalışırdım adapte oldu. Bütün Dağı RNA in situ hibridizasyon gen transkript dağınık şekilde yerelleştirmek için rutin olarak kullanılmıştır ve geçici27 ve transkript görselle?...

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Teşekkürler

Biz içtenlikle Dr. Mustafa Khokha, Yale Üniversitesi, onun laboratuvar kaynaklarının kullanımını sağlamak için teşekkür ederiz. Mükemmel teknik yardım için Bay Ming-Jie Wu için sana şükrediyoruz. EF HHMI dedektif olduğunu. Bu eser bir hediyesi John Monsky ve Jennifer Weis Monsky Lyme hastalığı araştırma fonu tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micronAmazon03-110/47
pGEM-T Easy Vector SystemPromegaA1360
Digoxygenin-11-UTPRoche1209256910
dNTPNew England Biolabs N0447S
DNAse I(RNAse-free)New England BiolabsM0303S
HiScribe SP6 RNA synthesis kitNew England BiolabsE2070S
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNew England BiolabsE2040S
Water, RNase-free, DEPC-treatedAmerican BioanalyticalAB02128-00500
EDTA, 0.5M, pH 8.0American BioanalyticalAB00502-01000
Formaldehyde, 37%JT Baker2106-01
FormamideAmerican BioanalyticalAB00600-00500
EGTASigma AldrichE-4378
DPBS, 10XGibco14300-075
Tween-20Sigma AldrichP1379-25ML
Proteinase KSigma Aldrich3115879001
Triethanolamine HClSigma AldrichT1502-100G
Acetic anhydrideSigma Aldrich320102-100ML
ParaformaldehydeThermoScientific/Pierce28906
SSC, 20XAmerican BioanalyticalAB13156-01000
RNA from torula yeastSigma AldrichR3629-5G
Heparin, sodium saltSigma AldrichH3393-10KU
Denhardt's Solution, 50XSigma AldrichD2532-5ML
CHAPS hydrateSigma AldrichC3023-1G
RNase ASigma Aldrich10109142001
RNase T1ThermoScientific EN0541
Maleic acidSigma AldrichM0375-100G
Blocking reagentSigma Aldrich11096176001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragmentsSigma Aldrich11093274910
Levamisol hydrochlorideSigma Aldrich31742-250MG
Chromogenic substrate for alkaline phosphataseSigma Aldrich11442074001
Bouin's solutionSigma AldrichHT10132-1L
Hydrogen peroxideMallinkrodt Baker, Inc2186-01
Single stranded RNA ladderAmbion -MilleniumAM7151
 #11 High-Carbon steel blades C and A Scientific Premiere#11-9411
ThermocyclerBioRad, CA1851148
SpectrophotometerThermoScientific NanoDrop 2000C
Orbital shakerVWRDS-500E Digital Orbital shaker
Shaking water bathBELLCO Glass, IncHot Shaker-7746-12110
Gel  documentation systemBioRadGel Doc XR+ Gel documentation system
Bright-field Microscope NikonNikonSM2745T
Bright-field Microscope ZeissAXIO Scope.A1
Dissection microscope ZeissSTEMI 2000-C
 Light boxVWR102097-658
PCR purification kit Qiagen28104
Image capture softwareZeissZen lite
Image editing software Adobe Adobe Photoshop CS4 version 11.0
Image analysis softwareNational Institutes of HealthImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/
Automation compatible instrumentationIntavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). Intavis, Biolane HT1.16v

Referanslar

  1. Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107 (2015).
  2. Hooper, L. V., Gordon, J. I. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).
  3. Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).
  4. Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: the force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
  5. Weiss, B., Aksoy, S. Microbiome influences on insect host vector competence. Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).
  6. Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. The functional microbiome of arthropods. PLoS One. 12 (5), e0176573 (2017).
  7. Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
  8. Sojka, D., et al. New insights into the machinery of blood digestion by ticks. Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).
  9. Grigor'eva, L. A. Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle. Entomological Review. 90, 405-409 (2010).
  10. Goodrich, J. K., et al. Conducting a microbiome study. Cell. 158 (2), 250-262 (2014).
  11. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
  12. Hemmati-Brivanlou, A., et al. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110 (2), 325-330 (1990).
  13. Frank, D., Harland, R. M. Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae. Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).
  14. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).
  15. Kernohan, K. D., Berube, N. G. Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections. MethodsX. 1, 30-35 (2014).
  16. Sonenshine, D. E. . Biology of ticks. , (1991).
  17. Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete. Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
  18. Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies. Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).
  19. Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces. Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).
  20. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
  21. Yilmaz, P., et al. The SILVA and "All-species Living Tree Project (LTP)" taxonomic frameworks. Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).
  22. Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).
  23. Narasimhan, S., et al. Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization. Nature Communication. 8 (1), 184 (2017).
  24. Bryant, S., Manning, D. L. Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA. Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).
  25. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
  26. Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis. BMC Development Biology. 16 (1), 38 (2016).
  27. Khokha, M. K., et al. Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development. Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).
  28. Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).
  29. Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations. Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).
  30. Pai, V. P., et al. HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner. Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).
  31. Legendre, F., et al. Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos. JoVE. (71), e50057 (2013).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Genetiksay 136eklem bacakl larkenegutmicrobiotatranskriptB t n mount In situ hibridizasyon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır