Lazer-yakalama mikrodiseksiyon optimizasyonu gelen insan dokusu taze donmuş enterik gangliyon yalıtım için

Özet

Bu iletişim kuralı, enterik gangliyon lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) kullanarak sabitlenmemiş, taze rezeke insan bağırsak dokusundan izole yüksek bütünlük RNA örnekleri almak için hedeftir. Bu protokol flaş donmuş örnekleri insan bağırsak dokusu, cryosectioning, ethanolic boyama ve dehidratasyon, LCM, hazırlanıyor içerir ve RNA çıkarma.

Özet

Bu yöntemin amacı enterik gangliyon lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) kullanarak sabitlenmemiş, taze rezeke insan bağırsak dokusu toplanan yüksek bütünlük RNA örnekleri elde etmektir. Biz RNA yalıtır enterik gangliyon yeterince yüksek kalite ve miktar üzerinden RNA-devamı için almak için çok önemli beş adım iş akışında belirledik Öncelikle, bağırsak dokusu hazırlanırken, her örnek serosa mümkün olduğu kadar büyük temel kalıpları alt kısmında düzleştirme önce Blot tarafından kaldırıldı tüm aşırı sıvı olması gerekir. Örnekleri daha sonra hızlı bir şekilde Kuru buz ve 2-methylbutane bir bulamaç donmuş. İkinci olarak, ne zaman doku kesit, cryomolds bağırsak bölümler böylece slayt başına enterik gangliyon en büyük yüzey alanı verimli myenteric pleksus tam boyutunda paralel şekilde konumlandırmak önemlidir. LCM, polietilen napthalate (kalem) sırasında üçüncü-membran slaytlar teklif en büyük hız ve enterik gangliyon toplarken enterik gangliyon üniform olmayan şekiller anahat oluşturma esnekliği. Dördüncü olarak, enterik gangliyon bölümleri içinde farklı görselleştirme için etanol uyumlu boya, kresil mor gibi sulu boya göre RNA bütünlüğünü mükemmel koruma sunuyoruz. Son olarak, yakalanan gangliyon gelen RNA çıkarılması için biz DNA kirlenme ayrıcılıklarına olan üstün RNA miktarı vermiştir ticari RNA ayıklama kitleri ve kalite arasındaki farklar görülmektedir. Geçerli protokol bu faktörlerin en iyi duruma getirme büyük ölçüde iş akışını hızlandırır ve enterik gangliyon örnekler olağanüstü RNA kalite ve miktar ile verimleri.

Giriş

Bu yöntem yüksek kaliteli RNA örnekleri enterik gangliyon lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) kullanarak insan bağırsak dokusundan elde etmek için tasarlanmıştır. Burada açıklanan Protokolü (RNA-seq) sıralama RNA için yeterli RNA kalite ve verim sağlamak için en iyi duruma getirilmiş ve taze rezeke, sabitlenmemiş, flaş donmuş insan bağırsak dokusu ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır.

Fonksiyonel gastrointestinal ve gut motilite bozuklukları her dört kişi Amerika Birleşik Devletleri'nde etkiler. Gut homeostazı ve hareketliliği çok önemli bir rol oynar gibi enterik sinir sistemi (ENS), ikinci beyin¹olarak da sık sık bu bozuklukların merkezinde bulunur. Bağırsakları manipülasyon genellikle cerrahi rezeksiyon aganglionic/noncontractile doku, kronik diyet değişiklik ve/veya ilaçlar için sınırlama getirildi. Doğal olarak, Yetişkin ENS tam transcriptome sıralı için büyük ölçüde molekülleri pharmaceutically hedef veya kök hücre tedavileri içinde kullanılan ENS içinde tanımlama yeteneği bizim sınırlama kalır.

RNA insan enterik gangliyon izole için nispeten daha az sayıda yöntem vardır. İlk yaklaşım, hücre ayrılma², yüksek inkübasyon sıcaklığı ve uzun bir kuluçka kez gerektirir; hem hangisinin RNA bozulma teşvik ve transcriptome^2,3alter bilinmektedir. Alternatif bir yaklaşım, LCM, daha güvenilir bir şekilde transcriptome korur ve RNA bütünlüğünü korur. Her ne kadar birçok araştırma-si olmak kullanılmış LCM gangliyon taze donmuş insan bağırsak dokusu^4,5,6toplamak için bu yaklaşımlar ya zavallı RNA kalite ve miktar tarafından engel, oldukça emek yoğun, ya da boyama veya RNA ayıklama teknikleri bizim ellerimizde çalışmak için değişiklik gerekli. Ek geliştirmeler^7,8, ama uyum ihtiyaç vardı enterik gangliyon^8, yalıtım için uygulandığında kılavuzları sağlanan LCM ürün bulundu RNA korumak için tasarlanmış diğer LCM protokolleri ⁹. bu nedenle, o yüksek bütünlük RNA'ın önemli miktarlar insan enterik gangliyon verimleri, nispeten hızlı bir iş akışı olan ve büyük bir tutarlı sonuçlar bu kaynaklara göre en iyi duruma getirilmiş bir protokol geliştirdiğimiz örnekleri sayısı.

Bu çalışmada, enterik gangliyon rezeke insan bağırsak dokusundan kaynaklandığı gelen yüksek bütünlük RNA izolasyonu kolaylaştırmak en iyi duruma getirilmiş yordamlar bir özetini sunuyoruz. Bizim Yöntem beş önemli yönleri içerir. İlk, taze rezeke, sabitlenmemiş insan bağırsak örnekleri kesilmiş boyutu için bir laboratuvar doku ile kaldırıldı ve flash-dondurucu bir bulamaç Kuru buz ve 2-methylbutane (2 MB) üstüne önce büyük bir temel kalıp basık tüm aşırı nem. İkinci, histolojik kesitler bağırsak myenteric pleksus enterik gangliyon büyük bir yük sunmaktadır bir slaytta tam boyutunda elde etmek için hazırlanmalıdır. Başarı ile bu adım doku hazırlık süreci büyük ölçüde bağlıdır. Üçüncü olarak, ENS gangliyon nonuniform yapısını en büyük hız ve kesinlik LCM işlemi sırasında sunan polietilen napthalate (kalem) membran slaytlar⁶, kullanımını gerektirir. Dördüncü olarak, etanol uyumlu boya, kresil mor gibi enterik gangliyon boyama sırasında RNA bütünlüğünü korumak için kullanılır. Son, RNA ayıklama işlemi RNA-devamı ile başarılı bir sonuç için önemlidir Biz yüksek RNA bütünlük üretir, enterik gangliyon küçük koleksiyonları ile başlatma sırasında RNA verimi en üst düzeye çıkarır, DNA kirlenme ortadan kaldırır ve mümkün olduğunca çok sayıda RNA türler korur bir RNA ayıklama yaklaşım aradı.

Birlikte ele alındığında, mevcut çalışmada bu faktörlerin en iyi duruma getirme büyük ölçüde iş akışını hızlandırır ve olağanüstü RNA miktarı ve kalitesi ile enterik gangliyon örnekleri verir. Sonuçlar büyük ölçüde bu yaklaşım tutarlılığını gösteren örnekleri, oldukça büyük bir grup arasında tutarlı olmuştur. Ayrıca, başarılı bir şekilde enterik gangliyon RNA örnekleri onlarca sıralamak için bu yaklaşımlar kullandık. Burada vurgulanan stratejileri de genel olarak istenen gangliyon LCM veya periferik ve santral sinir sistemi ve yüksek kaliteli RNA izolasyonu gerektiren diğer durumlarda çekirdekleri gerçekleştirmek için adapte edilebilir.

Protokol

Burada açıklanan tüm iletişim kuralları Vanderbilt Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB tarafından) onaylanmış olması.

1. doku varıştan hazırlık

1. Uygun IRB onay aldıktan ve bunlar çalışma için gerekli tüm araştırma ölçütlere uyan donör taze rezeke, sabitlenmemiş bağırsak dokusu elde etmek için insan organ bağışı kuruluşları ile koordine.
   Not: Bu protokol fareler ve diğer kemirgen modelleri ile kullanmak için adapte edilebilir.
   1. Hemen rezeksiyon bağırsak her segmentin luminal malzeme veya dışkı kaldırmak için soğutulmuş PBS ve doku BIRIMI lümen kanül.
   2. Sonra kızarma ve atık bir uygun biohazard receptacle atarak, doku-depolama ortamına (örneğin, 3 - 5 kez bağırsak doku hacmi) yeterli bir cilt dokusunda daldırın ve tek tek etiketli, su geçirmez plastik depolamak Konteynırlar, buzun içinde sular altında veya kullanım kadar buzdolabında).
   3. İşlem doku toplama önemli RNA yıkımı önlemek için zaman 18-26 saat içinde.
      Not: bağırsak segment ve depolama temizlik bağlı olarak bizim önerilen süre uzatmak mümkün olabilir.
2. Bu protokol için belirtildiği gibi insan dokusu toplamalarında peşin, gerekli tüm malzemeleri hazırlamak (daha ayrıntılı ürün bilgileri için Malzemeler tablo bakın). Gerekli tüm kişisel koruyucu ekipman her zaman giyilen emin olun.
3. Kuru buz kovaları ile birlikte bir kuru buz Bulamaç Şekil 1' de gösterildiği gibi hazırlayın.
   1. 4 standart dairesel buz kovaları ve bir dikdörtgen buz kovası doldurmak için yeterli Kuru buz ezmek. Bir standart kova küçük (11 x 21 cm) laboratuvar olması gereken dokulara yerleştirilen Kuru buz yüzeyde. Mümkünse, yeni, açılmamış kutular laboratuvar dokuların kullanın.
   2. Kuru buz Bulamaç Kuru buzun içinde temiz dikdörtgen bir buz kovası 2 L powderizing tarafından olun.
   3. Önceden soğutulmuş 2 MB kadar kuru buz yüzeye ekleyin. Biraz karıştırın ve bir pipet ucu kutusu kapak Bulamaç şekil yüzeye daha büyük dikdörtgen kova kenarlarında Kuru buz parçalarını çevrili bir kanal içine kullanarak Bulamaç düzleştirin.
   4. Daha hızlı donma teşvik etmek için bir yer kuru buz buz kovası kenarları boyunca birkaç ince bloğunu. Oda gevşek Kuru buz Bulamaç kova içinde belirli bir zamanda sığacak şekilde ≥4 temel kalıpları için olmalıdır.
      1. İsteğe bağlı olarak, yığın başka bir dikdörtgen buz kovası içinde buz kovası ¼ Kuru buz ile dolu. Bu konumlandırma daha iyi Kuru buz Bulamaç izole etmek yardımcı olur ve işlem sırasında sık sık ayarlamalar Kuru buz ve 2 MB gereksinimini engeller.
   5. Şu sırada bir montaj hattı içinde kuru buz kovaları getirin: 1) Kuru buz Bulamaç kova, 2) laboratuvar doku-Kuru buz Kovası, 3 & 4) normal Kuru buz kovaları, 5) dikdörtgen Kuru buz kovası (Şekil 1A).

2. Flash donmuş insan bağırsak dokusu hazırlanması

Not: Bu sürecin bağırsak doku kalitesi bağlı olarak bağırsak kesimi başına 45-80 dk arasında sürebilir. Ayrıca RNA kalite ve histoloji LCM işlemine devam etmeden önce değerlendirmek için kalite kontrol örnekleri toplama öneririz.

1. Büyük bir tepsi ıslak buz ile doldurun ve cerrahi kesme tahtaları Kuru buz üstüne yerleştirin.
2. Bu kurulum, doku ve kesilmiş parça soğuk depolama çözümünde depolamak için bir 500 mL ve 100 mL kadehler chill. Böylece doku almaya hazır ön sakin Bankası kesme tahtası üzerinde kalıpları.
3. Taze bağırsak dokusu aldığında, hangi doku taşınır medya dökün ve önceden soğutulmuş şişeler içinde saklayın. Bu kadehler bağırsak dokusu ve sonraki adımlar hazırlanmış olabilir kesilmiş parçalar, geçici depolama için biraz yer bırakın.
4. Bağırsak kesimi yaklaşık 20 RNA için aşağı akım uygulamaları oluşturmak için yeterli doku (40-60 cm²) ve kalite kontrol örnekler sağlayan cm uzunluğunda, için kesti. Doku bütünlüğü bağlı olarak RNA izolasyon çok daha küçük bir uzunluk (Yani, bağırsak 5 cm) ile aşağı akım işleme gerçekleştirmek için uygun olabilir.
5. Dış görev yağ ve bağ dokusu cerrahi makas kullanarak bağırsak üzerinden kırpın. Artık bağırsak serosa adipose doku sonraki adımda tamamen dümdüz yeteneği ödün vermez. Dikkatlice böylece yağ ve bağ dokusu, yapısal olarak myenteric pleksus zarar verebilir veya düzensiz kesit için Düzleştir'i dış doku yapmak kaldırma sırasında serosa nicking önlemek için doku, kırpın.
6. Bağırsak örnek, tercihen mezenterik eki sitenin tüm uzunluğu boyunca uzunlamasına bir kesi yapmak.
7. Uzak incelemek ve böylece daha kolay, gerginliği serbest bırakılması üzerine düzleştirir tenia coli kolon, üzerinden atmak.
8. Bağırsak mukoza tarafı aşağı soğuk kesme tahtası edebilir ve doku tam uzunlukta 1,25 cm çapında şeritler kesti.
   Not: Bu boyut buna göre ayarlanması gereken bu yüzden bağırsak dokusu kez kırparak sonra genişletir.
9. Geçici olarak şeritler soğutulmuş doku-depolama çözümünde saklamak.
   Not: uzun bir raf ömrü vardır, nispeten düşük maliyetli olduğundan ve oda gerekinceye kadar sıcaklıkta depolanan biz Belzer UW soğuk depolama çözümü kullanın.
10. Bir doku şerit soğuk hava deposu çözümden kaldırmak ve segmentleri ~1.5-2 cm uzunluğunda kesti.
11. Hızlı bir şekilde aşırı sıvı kaldırmak ve flash-donma sırasında buz kristalleri boyunca bağırsak serosa oluşumunu engellemek için laboratuvar mendil, bir yığın bağırsak kesimlerinde leke. Eğer doku yeterince kuru değil, yüksek kaliteli bölümler myenteric pleksus elde etmek zor olacak.
12. Fotoğraflarda bağırsak adet mukoza tarafında bir önceden soğutulmuş, büyük, tek kullanımlık plastik temel kalıp (37 x 24 x 5 mm) üzerine yığmak.
13. Dikkatle her kesimi hafifçe doku temel kalıp yüzey üzerinde uzanan ve hafifçe bastırın ve serosa altında sıkışmış herhangi bir hava kabarcıkları kovmak için eğri forseps kullanarak düzleştirin. Not doku düzleştirme sırasında genişletir. Gerekirse, segmentleri döşeme ve kalan örnekleri daha küçük bir boyutta kesilmiş.
    Not: Doku aşırı gergin ise, bu myenteric pleksus bozar. Tüm hava kabarcıkları kaldırıldıktan sonra donma önce örnek kalınlığı değerlendirmek. Bağırsak örnek özgün kalınlığı yaklaşımlar kadar gerekirse, numune içe kenarlarına itin.
14. Yüklü temel kalıp Kuru buz, 2 MB Bulamaç yüzeyine yerleştirin. Doku boyutu ve kalınlığı bağırsak segmentin bağlı olarak 30-60 s içinde tamamen dondurun.
15. Kalan 2 MB temel kalıp Kuru buz ikinci kovaya önceden soğutulmuş laboratuvar dokular üzerinde sürtünme hızlı bir şekilde kaldırmak için temel kalıp alt kuru.
16. Kurutulmuş örnek Kuru buz üçüncü küvete aktarmak ve kaplanabilir hazır olması ne kadar kuru buz yüzeyinin altında göm.
17. Hızlı kaydırma, numune hazırlama kalitesini incelemek için önce temel kalıp alt gözlemlemek. Bunlar-meli var olmak kaçmak için cryosectioning ve LCM gibi değil düz görünür veya büyük hava kabarcıkları, herhangi bir örnek not alın.
18. Örnek bir demet Kuru buz üstüne koydu, böylece tamamen donmuş muhafaza süre kaydırma doku oluşur önceden etiketli alüminyum folyo şal.
19. Örnek bir tabaka ile doku dehidratasyon-80 ° C'de depolama sırasında en aza indirmek için plastik wrap, wrap
20. Kadar derin dondurucu için taşınacak hazır örnekleri dikdörtgen kova içinde saklayın.
21. Önceden etiket ve anında depolama için-80 ° C'de derin dondurucu kutularca örnekleri toplandıktan sonra önceden chill.
22. Doku LCM iletken önce RNA bütünlük değerlendirilmesi için bağırsak her kesiminden küçük bir bölümünü al.
    1. Ön etiket RNase free bir 2mL tüp her kesimine lizis arabellek ≥500 µL ile dolu. RNA ekstraksiyon kiti "D" Malzemeleri tablodalistelenen, kullanmanızı öneririz.
    2. Bir çift doku mikro-homogenizer (20-40 sn, hiçbir doku parçaları kalıncaya kadar) bağırsaklarda bir küçük (2 x 2 mm) parça lunaparkçı. O zaman, hemen RNA lysate Kuru buz ve mağaza-80 ° C'de RNA ayıklama işlemine devam etmeden kadar dondur.
    3. İsteğe bağlı olarak, bazı bölümlerin doku dondurma Orta (TFM) bir yedekleme gömün. Bu bölümde açıklanan aynı şekilde doku bölümleri hazırlamak ama TFM örnekleri flaş donma önce temel kalıp içinde daldırın.

3. Cryosectioning

1. Daha önce cryosectioning, boyama ve dehidratasyon tüm gerekli malzemeleri hazırlamak ve istenilen doku örnekleri-80 ° C dondurucudan Kuru buz bir kova içine aktarın.
2. Cryostat kullanmak için en uygun kesme sıcaklığa (-18-22 ° c) ayarlama ve yüzeyler % 100 etanol ile aşağı silme ve bıçak tedavi hazırlamak ve tepsi RNase Dekontaminasyon solüsyonu ile fırça.
3. En iyi örnek Chuck uymaları, aşağıdaki yöntemi kullanın.
   1. Kuru buz için en az 30 koyun forseps bağırsak örnek unwrapping ve kuru buz serosa-yan-up yüzeyde yerleştirerek önce s.
   2. 3-5 mm Höyük doku dondurma Orta (TFM) bir büyük cryostat numune tutucu dökün ve hemen bağırsak örnek serosa-yan-up TFM üzerine aktarın.
   3. Hızlı bir şekilde örnek sahibi Kuru buz ve kapak powderized Kuru buz ile Oda sıcaklığında 2-5 s için örnek uyacak TFM sonra transferi sağlayan. TFM myenteric pleksus uçak altında kalmasını sağlamak.
      Not: örnek çözdürme olmadan dondurmak TFM başlamadan önce ideal olarak, bağırsak mukoza dış yüzeyine tam TFM için uygun olacaktır.
4. Numune sahibi cryostat'ın numune aklına takmak ve myenteric pleksus uçak için kesici bıçağın paralel olacak şekilde örnek cryostat bıçakla hizalayın.
5. Parça kalınlığı 8 µm için cryostat olarak ayarlayın. Mükemmel örnek hizalama amacı en büyük olası yüzölçümü myenteric pleksus her bir slayt üzerinde elde etmektir. Bu kalınlık genelde insan ve kemirgen doku için önerilir, ancak gerektiği gibi ayarlanabilir.
6. Bölüm serosa ve myenteric pleksus ulaşan kadar boyuna kas.
   1. Myenteric pleksus bulmak için bir örnek bölüm bir slayt üzerine monte ve Bölüm %1 kresil menekşe veya toluidin blue, vbgibi bir sulu boya lekesi.
   2. Boyuna ve dairesel kas tabakaları arasında bağlantı tanımlamak için 40-2000 X büyütme, hafif bir mikroskop altında bölümüne bakın. Mikroskop parametreleri Tablo malzemeleritemin edilmektedir. Kesit başında serosa bağ dokusu varlığı ile işaretlenir. Kalan bazı mezenterik yağlı de serosa gözlenebilir. Bir sayfa dış boyuna kas tabakasının sonra başlar. Boyuna ve dairesel kas tabakaları arasındaki sınır aşıldığında, enterik gangliyon bir kısmını tespit edilecektir.
      Not: sonraki birkaç bölümlerde myenteric pleksus çok belirgin, tek bir bölüm (Şekil 2C) içinde mevcut olan gangliyon büyük tarama alanı haline gelecek. Doku kesit başında tamamen düz değilse, gangliyon yalnızca bir bölümünü herhangi bir anda her bölümünde mevcut olacaktır. Bazı durumlarda, bağırsak örnek mükemmel düz görünen doku rağmen bir doğal olarak dengesiz myenteric pleksus gerekebilir. Bu oniki parmak bağırsağı örnekleri için özellikle doğrudur. Deneyim, bu örnekler LCM ile işlemek için uzun zaman alabilir ancak yeterli RNA tek bir günlük oturum içinde toplanır. Myenteric pleksus tam konumunu örnek, doku ve onun hazırlık donma önce dayalı arasında önemli ölçüde değişebilir.
7. Seri bölümler neurons ve glia slayt başına en yüksek sayıda sağlayan en iyi koleksiyonları ile LCM için toplama başlar. Örnek yüzey alanı bağlı olarak, birden çok bölüm tek bir kalem-membran slayt kombine edilebilir.
8. Kısa bir süre içinde cryostat 5-10 s soğutulmuş kalem membran slayda bölümleri bağlayın. Ne zaman montaj, doku sadece biraz sonuna kadar RNA bütünlüğünü koruyarak eritin.

4. boyama

Not: boyama işlemine genel bakış için Tablo 1' e bakın. Tüm çözümler kullanılan standart 50 mL konik şişeleri hazırlanır. Tüpler RNase Dekontaminasyon solüsyonu ile dış tedavi sonuçlarını (veriler gösterilmez) geliştirmek için görünmez.

1. En az bir gün önceden %4 kresil mor % 95 etanol içinde doymuş çözeltisi hazırlamak ve tam belgili tanımlık tenkıye yükleme öncesinde kresil violet yeniden askıya alma.
   Not: Etanol konsantrasyonu etkili boyama için indirdi tartışma bölümünde açıklandığı gibi gerekebilir. Boyama sırasında önemli ölçüde % 50 veya % 75 etanol kullanarak RNA bütünlük azaltıp biz test etmedim. Kresil mor ışığa duyarlı ve böylece ışıktan korunmalıdır.
2. Myenteric pleksus bir slayda bölümlerini takma sonra hemen daldırın % 95 etanol (-20 ° C'de önceden soğutulmuş) konik bir şişe içinde slayt için 30 s.
   1. Eğer bölümleri tam olarak önceki adımda slayt için uygun değil, biraz slayt (Laboratuvar mendil yerleştirilmiş ikisinin arasında slayt olmalı ve eldiven) eldivenli elle % 95 etanol batış önce tam bağlılık için alt sıcak. Bu çözüm RNA bütünlük azaltmadan en az 3-6 slayt için yeniden kullanılabilir.
3. Slayt yüz-up önceden tedavi, RNase free konteyner⁸yerleştirilen bir laboratuvar silin yatıyordu.
4. 3-mL şırınga %4 kresil mor ile ön doldurma ve 0.2 µm şırınga filtre ekleyebilirsiniz.
   Not: Selüloz asetat filtreleri öneririz.
5. Leke doğrudan üzerine doku bölümleri⁸ 6-10 damla uygulamak ve yeterli boya kadar veya 10-30 s için kuluçkaya ne zaman korunur de-lekeli. Boyama sırasında el ile doku bölümler eşit leke ile kaplı olan sağlamak için slayt konteyner yavaşça döndürün.
6. Pour leke ve hemen de-% 75 etanol bir şişe olarak slaydı leke. Aşırı boya çoğunlukla kapalı örnek seeped kadar art arda slayt daldırın. Bu 10-20 s arasında sürebilir.
7. Tüm fazla leke kaldırılıncaya kadar art arda bir şişe % 95 etanol örnekte 10 s. Submerge örnek için art arda daldırma de-boyama son haline getir.
   1. Destaining süresi, gangliyon boyama en iyi duruma getirmek için gerekli değişiklikleri yapın. Çok fazla leke kaldırılırsa, örnek de saydam olur ve görselleştirmek zor olabilir
      Not: Bu boyama Protokolü tatmin edici sonuçlar elde edilmiştir önce hangi değişiklik gerekli çeşitli yayınlar^5,8,10,11 göre optimize edilmiştir. Bu nedenle, boya ve destaining işlemi sırasında kullanılan etanol konsantrasyonu, gerektiğinde en iyi bir sonuç elde etmek değiştirilmesi gerekir.

5. su kaybı

1. Hemen % 100 etanol içinde slayt 2 - 3 kez, toplamda 10-20 s daldırma.
2. Susuz % 100 etanol için en az 30 slayt daldırın s. Susuz etanol çok higroskopik olduğu için moleküler elekler (8-12 mesh) % 100 etanol emilen su kaldırmak ve böylece daha tamamen örnek⁵kurutmak için yordamı başlangıcı önce şişe ekleyin.
3. Art arda ksilen 15-20 s için slayt daldırma. Bu adım tam slayt üzerindeki etanol tabakası kaldırır. Moleküler elekler vaktinden tam olarak aşırı etanol ve su molekülleri⁵absorbe ksilen, tüpler için ekleyin.
   Dikkat: Xylenes gözleri ve üst solunum yolu için tahriş edici olarak sınıflandırılmış ve bir kimyasal duman mahallede kullanılmalıdır.
4. En az 10 dk (ile moleküler elekler, 8-12 mesh) ksilen içinde slayt daldırın.
   Not: Kısa bir mola bu adımdan sonra gerekirse alınabilir. Örnekleri ksilen içinde 4-5 saat zararlı etkileri olmadan boyama için LCM veya RNA verim/bütünlük bırakılabilir.
5. Isteğe bağlı olarak, tek tek bu noktada birkaç ek slayt hazırlamak. Hazırlanan tüm slaytlarda LCM tamamladıktan sonra ikinci turunda slaytlar hazırlanıyor, cryostat doku doku yüzey su kaybı refaced gerekebilir. 1-4 bölümleri kullanılabilir bölümler toplanan önce iptal gerekir.

6. lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM)

1. Slayt ksilen kaldır ve LCM mikroskop sahne içine bir kimyasal duman başlıklı en az 1 dk. Ekle bir kartuş LCM kapaklar kuruması. Sahne Alanı'na slayt yük ve slayt genel bakış görüntüsünü elde etmek.
2. LCM için istediğiniz yere belirlemek ve bir kap bir slayda yüklemek.
3. Kızılötesi (IR) lazer hizalama ve onun güç ve süresi yakalamak bir 20-30 µm çapı spot yapmak için ayarlayın.
4. Ultraviyole (UV) lazer bulun ve bir uygun kesme hızını ve yoğunluğunu ayarlayın.
5. (Slayt genel yazılım programının yeşil bir daire olarak tasvir) kap collectable alan sınırı içinde kalmak emin LCM yazılımını kullanarak toplanan için istenen gangliyon anahat.
6. Orada öyle ki en az bir IR spot her 100-500 µm her izini sürmek, IR noktalar ayarlayın.
7. IR/UV kesme düğmesi tüm işaretli gangliyon koleksiyonu ile devam etmek için tuşuna basın.
8. Koleksiyonları tamamlandığında, kap yeni bir konuma taşımak ve toplama işlemi yineleyin veya kapağı yeterince Gangliyon (veya önerilen zaman sınırı 60-80 dakika ulaşılana kadar) dolu bir kez LCM kap QC istasyonunda inceleyin.
9. Enkaz kapakta varsa uzak RNase dekontaminasyon çözüm ile önceden tedavi, nükleaz ücretsiz su ile durulanmalıdır, ve tamamen kurumuş ince uçlu bir fırça kullanarak silin.
10. Dikkatle göz kapağı incelemek veya tüm enkaz sağlamak için parlak alan mikroskop altında büyütme ile kaldırıldı. Enkaz önceden tedavi boya fırçası kullanımı yoluyla kaldırılamaz, bir iyi pipet ucu (RNase free) uzak enkaz kazımak için kullanın.
11. 230 µL RNA lizis arabelleği (RNA ekstraksiyon kiti "10 µL/mL konsantrasyonu eklendi B", β-mercaptoethanol ile arabellek RLT) ile dolu bir 0.5 mL microfuge tüp üzerine kapağı güvenli.
12. Ters çevir kapağı, kısaca girdap ve 30 dk için oda sıcaklığında kuluçkaya.
13. 5 min ve o zaman transfer microfuge için Kuru buz tüp için ≥ 5000 x g santrifüj kapasitesi.
    Not: Protokol burada duraklatılmış. RNA lysates RNA bozulması en az 1 hafta üzerinde önemli bir etkisi olmadan-80 ° C'de muhafaza edilebilir. RNA izolasyon aynı gün gerçekleştirilirse, buz üzerinde örnekleri çıkarma için hazır olana kadar sakin ol.
14. 80-90 dk önerilen maksimal süre içinde tüm ek koleksiyon slayt ksilen çıkardıktan sonra gerçekleştirin. RNases yavaş yavaş susuz bölümler için ortam nemi maruz kalır gibi yeniden olmak. Koleksiyon dönem sınırlama etkileri en aza indirmek ve sonuna kadar RNA bütünlüğünün korunması.

7. RNA izolasyon

1. Bir RNase free iş istasyonu RNA çekimi için hazırlayın.
2. Tüm tüpler ve Kimyasalları kılavuzuna göre RNA ayıklama çantası için hazırla.
   Not: olmakla birlikte birçok kitleri LCM takip RNA izolasyon için kullanılabilir, biz "B" malzeme listesinde listelenen, RNA ekstraksiyon kiti kullanarak en iyi başarı oldu. Şekil 5 RNA ayıklama reaktifler yan yana karşılaştırma için bkz.
3. Örnekleri-80 ° C dondurucudan kaldırmak ve hızla bir 37 ° C su banyosunda çözülme.
4. Hemen çözdürülen girdap örnekleri eşit guanidinium thiocyanate tuzları dağıtmak 2-3 s.
5. Her örnek % 70 etanol eşit bir hacmi ile birleştirin. 2 veya daha fazla lysates birlikte, gerekirse, yeterli bir RNA konsantrasyon ulaşmak havuz.
6. RNA ayıklama işlemi için kılavuzda microdissected örnekleri için en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralını kullanarak üretici yönergelerine göre devam edin.
7. RNA nükleaz ücretsiz su (14 µL) önerilen en küçük birim içine son adım, elute.
8. RNA izolasyon, aliquot 1-2 µL dönüştürmek bir yeni gelen RNA'ın RNase free tube kalite değerlendirme/kalite kontrol için RNA, bir Bioanalyzer gibi küçük miktarlarda görselleştirebilirsiniz Havacilik aygıtı ile önceden etiketli. Aliquot bir miktar ile yüksek-duyarlı RNA miktar teçhizat için ayrı bir tüp içine ek 1 µL.
   1. Bu adımları, RNA aşağı akım analiz için yeterli miktarda elde etmek için gereken şekilde ayarlayın (i.e., LCM kapaklar RNA ayıklama önce daha çok sayıda havuz).
9. Aşağı akım analiz için yeterli örnekleri toplamaya kadar-80 ° C'de mağaza RNA.

Sonuçlar

LCM, RNA-devamı için standartlara toplantı kullanarak insan bağırsak örneklerinden enterik gangliyon nispeten hızlı toplamayı etkinleştirmek varolan iletişim kuralları için çeşitli iyileştirmeler yaptık İlk olarak, biz en iyi duruma getirilmiş Kuru buzun içinde 2 MB (Şekil 1B) bir bulamaç yüzeyinde yer büyük temel kalıpları bağırsak dokusu segmentlerinde hızlı donma. En iyi başarı cryosectioning ve sonraki LCM...

Tartışmalar

Çok sayıda enterik gangliyon verimli toplama RNA-devamı için RNA türetmek için bir kaynak olarak bu yordamla Burada, sonuna kadar RNA bütünlüğünü koruyarak varolan iletişim kuralları'nda belirtilen işlemler hız. Bu yordamdaki adımların tümünü birbirine bağlı olduğundan, tüm sorunları çalışma başlangıcından bertaraf edilmesi ve tüm örnekleri olarak benzer şekilde bir başkasına mümkün olduğunca güvenilir RNA-seq. elde etmek için hazır olduğundan önemlidir

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Neutral-buffered formalin	Sigma	HT501128-4L
2-Methylbutane	Fisher	O3551-4
3-mL syringe	BD	309628
50-mL conical tubes, polypropylene	Corning	05-526B
Base molds 37x24x5mm, disposable	Electron Microscopy Sciences	5025511
Belzer UW  Cold Storage Solution	Bridge to Life	N.A.
CapSure Macro LCM caps	Arcturus, ThermoFisher	LCM0211
Cling Wrap, Press’n Seal	Glad	N.A.
Cresyl Violet Acetate	Acros Organics	AC405760025
Cutting Board	Electron Microscopy Sciences	63308
Ethanol, 190-proof	Pharmco-AAPER	111000190
Ethanol, 200-proof	Pharmco-AAPER	111000200
Glass Microscope slides	Fisher	12-550-343
Gloves, extended cuff	Microflex	19010144
Gowns, surgical-disposable	Kimberly-Clark	19-088-2116
Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan)	Nalgene	1335920B
Kimwipes (large)	Kimberly-Clark	34120
Kimwipes (small)	Kimberly-Clark	34133
Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT)	ThermoFisher	N.A.
Leica Cryostat Chuck, large,  40 mm	Southeast Pathology Instrument Service	N.A.
Light Microscope	Olympus	CX43
Microscope objective (20X)	Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17	N.A.
Microscope objective (10X)	Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/-	N.A.
Molecular Sieves	Acros Organics	AC197255000
Nuclease-free water	Ambion	AM9937
PicoPure RNA extraction kit	Applied Biosystems	12204-01
Pellet Pestle	Kimble Kontes	4621973
PEN membrane LCM slides	Arcturus, ThermoFisher	LCM022
RNase-free tubes, 1.5 mL	Ambion	AM12400
RNaseZAP	Sigma	Sigma-R2020
RNA Extraction Kit "A" (PicoPure)	Applied Biosystems	12204-01
RNA Extraction Kit "B" (RNeasy  Micro kit)	Qiagen	74004
RNA Extraction Method "C" (TRIzol)	Invitrogen	15596-026
RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit)	Qiagen	74134
Splash Shield, disposable faceshield	Fisher	17-310
Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp"	Fine Science Tools	14002-14
Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm)	Nalgene	190-2520
Tissue Freezing Medium	General Data Healthcare	TFM-5
Xylenes	Fisher	X3P1GAL