JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Sinaptik vezikül (SV) Bisiklete binme nöronal sinapslarda, hücreler arası iletişim çekirdek mekanizması vardır. FM boya alımı ve yayın kantitatif SV endo - ve ekzositozu raporlaması birincil yoludur. Burada, biz FM1-43 Drosophila nöromüsküler kavşak (NMJ) modeli sinaps Bisiklet sürmeyi tüm uyarım yöntemleri karşılaştırın.

Özet

FM boyalar sinaptik vezikül (SV) döngüsü incelemek için kullanılır. Bu amfipatik probları hidrofilik baş ve hidrofobik kuyruk, onları geri dönülebilir olarak girin ve membran lipid bilayers çıkmak için yeteneği ile suda çözünebilir hale var. Bu styryl boya nispeten olmayan sulu ortamda floresan, ancak plazma zarı dış broşür içine ekleme neden bir > 40 X artırmak floresans içinde. Nöronal sinapslarda içinde FM boyalar sırasında SV endositoz, neurotransmission presynaptic aşamaları görselleştirmek için güçlü bir araç sağlayarak hem içinde hem de SV havuzları arasında ticareti ve ile yayımlanan SV ekzositozu içselleştirilmiş. Bir birincil genetik glutamatergic sinaps geliştirme ve işlev nöromüsküler kavşak (NMJ), nerede FM boya görüntüleme yoğun SV dynamics mutant koşulları geniş bir alanda ölçmek için kullanılan Drosophila modeldir. Büyük sinaptik boutons için görüntüleme uygulamalarında ideal güzel bir dizi NMJ sinaptik terminal kolayca ulaşılabilir. Burada, biz karşılaştırın ve kontrast Drosophila NMJ etkinlik bağımlı FM1-43 boya alımı/release sürücü teşvik için üç yol: 1) banyo uygulama yüksek [K+nöromüsküler doku depolarize, 2) elektrot motor sinir emme için] presynaptic sinir terminal ve 3 depolarize stimülasyon) depolarizasyon ışık uyarılmış, mekansal kontrolü için channelrhodopsin versiyonlarının transgenik ifade hedef. Bu yöntemlerin her birinin yararlarını ve sakıncalarını SV döngüsü üzerinde genetik mutasyon etkileri incelenmesi için Drosophila NMJ var. Biz bu avantajları ve dezavantajları her strateji için belirli metodolojisi ile birlikte stimülasyon yaklaşım yelpazesi yardımcı olmak için görüşecek. Floresan görüntüleme ek olarak FM boyalar-ebilmek var olmak photoconverted elektron yoğun sinyalleri SV döngüsü mekanizmaları ultrastructural bir düzeyde çalışmaya transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kullanarak görüntülenir. Biz confocal karşılaştırmalar sağlamak ve elektron mikroskobu Drosophila NMJ stimülasyon, rehber yardımcı olmak için farklı yöntemler gelecekteki deneysel paradigmalar yelpazesi görüntüleme.

Giriş

Synapse oluşumu ve genetik tedirginlikler1geniş bir yelpazede işleviyle çalışmaya Drosophila larva nöromüsküler kavşak (NMJ) glutamatergic güzel karakterize synapse modeli kullanılmıştır. Motor nöron terminal birden çok axon dalları, her biri pek çok genişlemiş sinaptik boutons oluşur. Bu geniş varicosities (ilâ 5 mikron çapında) tek tip glutamatergic sinaptik veziküller dahil olmak üzere neurotransmission makine içeren (SVs; ~ 40 nm çapında) sitozolik rezerv ve kolayca derledi havuzları2. Bu veziküller nerede ekzositozu aracılık eder glutamat nörotransmitter serbest bırakılması için transpresynaptic plazma zarı fusion site aktif bölgelerde (AZs), dock-sinaptik iletişim. Daha sonra SVs tekrarlanan exo/endositoz devredir plazma zarı öpücük tarafından işletilen geri dönüşüm veya clathrin-aracılı endositoz (CME) üzerinden alınır. Drosophila NMJ kolayca erişilebilir ve yalıtma ve SV döngüsü mutantlar karakterize için oldukça uygundur. İleri genetik ekranları kullanarak, yeni genlerin SV döngüsü3için kritik kimliği roman mutasyonlar açmıştır. Ayrıca, zaten bilinen genler ile başlayarak geriye doğru genetik yaklaşımlar yeni SV döngüsü mekanizmalar aracılığıyla fenotipleri4Bisiklete binme mutant dikkatli açıklaması aydınlatma yol açmıştır. Drosophila NMJ neredeyse SV endositoz ve ekzositozu mekanizmaları yöntemleri için optik neurotransmission sırasında Bisiklete binme parça vezikül ile dissekan için deneysel bir sinaptik hazırlık olarak idealdir.

Flüoresan işaretler bir dizi dynamics Bisiklete binme sırasında veziküller görsel izlenmesine izin, ancak ilk Mao, F., ve arktarafından sentezlenir FM boya analogları en çok yönlü vardır. 5. yapısal olarak, FM boyalar hidrofilik bir baş ve bir aromatik halka aracılığıyla spektral özellikleri veriyor bir merkez bölge ile bağlı bir lipofilik kuyruğu içerir. Bu styryl boyalar ters bölme içinde membranlar, 'membran broşürler arasında flip-flop değil' de hiç öyle sitozol ücretsiz ve su5' ten membranlar içinde çok daha floresan. Lipid bilayer içine ters çevrilebilir ekleme floresans6' 40-fold bir artış neden olur. Nöronal sinapslarda Klasik FM boya etiketleme deneyler sinaptik hazırlık stimülasyon depolarize sırasında boya boya SV endositoz ile yüklemek için banyo oluşur. Dış boya sonra yıkanıp ve SV döngüsü yüklü sinapslarda7görüntüye bir kalsiyum ücretsiz zil çözümünde tutuklandı. Stimülasyon boya ücretsiz banyo içindeki ikinci turunda FM yayın ekzositozu, floresan yoğunluğu azalma ölçerek takip edilebilir bir süreç aracılığıyla tetikler. Tek bir vezikül SV gruplarından veziküller yüzlerce içeren havuzlarına kantitatif izlenen6,7olabilir. İşlevsel olarak farklı SV havuzları etkinlik bağımlı seferberlik teşrih ve öpücük ve çalıştırma8,9Bisiklete binme CME vs karşılaştırmak için FM boyalar kullanılmaktadır. Yöntem uyarılmış, ayrı ayrı tahlil için spontan ve minyatür sinaptik döngüsü faaliyetleri (ile çok küçük floresan değişiklikleri algılamak ve photobleaching azaltmak için son derece hassas ekipman)10değiştirildi. Transmisyon Elektron mikroskobu11,12,13,14 elektron yoğun bir etiket içine photoconverting floresan FM sinyal tarafından ultrastructural seviyeye uzatılabilir deneyleri .

Tarihsel olarak, banyo sinaptik hazırlıkları (bundan sonra "yüksek [K+]" anılacaktır) potasyum yüksek bir konsantrasyon içinde Bisiklete binme SV ikna etmek için stimülasyon depolarize için seçtiğiniz yöntemi olmuştur; kurbağa kolinerjik NMJ5, değişen kemirgen beyin hipokampal nöronlar15, Drosophila glutamatergic NMJ modeli16,17kültürlü. Bu yüksek [K+] yaklaşımı basittir, hiçbir özel ekipman gerektirir ve bu nedenle çoğu Labs'e erişilemez ama uygulama ve veri yorumu için sınırlamalar vardır. Sinir4,5,12emme elektrot elektriksel stimülasyon kullanın fizyolojik açıdan çok daha uygun bir yöntemdir. Bu yaklaşım doğrudan presynaptic sinir uyarılması için Aksiyon potansiyeli yayılma terminal sürücüler ve sonuçları doğrudan neurotransmission işlevi13,14elektrofizyolojik deneyleri için karşılaştırılabilir, 15, ama özel ekipman gerektirir ve teknik olarak çok daha zordur. Optogenetics gelişiyle channelrhodopsin nöronal stimülasyon kullanımı kanal ifade kullanarak ikili Gal4/UAS sistem20sıkı kronolojik zamanmekansal kontrolü de dahil olmak üzere ek avantajlar vardır. Bu yaklaşım teknik olarak emme elektrot stimülasyon çok daha kolay ve çok ucuz bir LED ışık kaynağı başka bir şey gerektirir. Burada, çalışan sayımız görüntüleme FM1-hem karşılaştırmak ve bu üç farklı stimülasyon yöntemi Drosophila NMJ, kontrast için 43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridinium dibromide): basit yüksek [K+ ], elektrik ve yeni channelrhodopsin yaklaşımlar zorlu.

Protokol

1. larva tutkal diseksiyon

  1. Silikon elastomer temel silikon elastomer Ajan elastomer kiti (Tablo reçetesi) kür, 1 kısım ile 10 parçaları iyice karıştırın.
  2. 22 x 22 mm cam coverslips elastomer ve tedavi 75 ˚C de sıcak bir tabak üzerinde birkaç saat (artık yapışkan kadar dokunmak) kat.
  3. Bir tek elastomer kaplı cam coverslip larva diseksiyon için hazırlık özel yapım pleksi cam diseksiyon odanın içine (Şekil 1, alt) yerleştirin.
  4. Borosilikat cam kılcal bir standart elektrot çektirmenin istenen konik elde edilir ve boyutu ipucu kullanarak üzerinden Tutkal pipetler hazırlayın.
  5. Yavaşça micropipette ucu kapalı ve diğer ucunu kırmak, esnek plastik boru (1/32" iç çapı, kimliği 3/32" dış çapı, OD; 1/32" duvar; 2 ft eklemek Tablo malzeme) (P2 pipet ucu) uygun ağzıyla.
  6. Tutkal (Tablo reçetesi) larva diseksiyon için hazırlık küçük hacimli (~ 20 µL) ile küçük bir kap (0.6 mL Eppendorf tüp kap) doldurun.
  7. Odası (mM) salin ile doldurun: 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, 70 sukroz ve 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic asit (HEPES) pH 7.2.
  8. Anti-at turp peroksidaz (HRP) antikor Alexa Fluor 647 için Birleşik ekleyin (anti-HRP:647; 1 mg/mL stoktan seyreltik 1:10) NMJ etiketleme için diseksiyon21,22sırasında presynaptic terminal.
  9. İnce fırça (boyutu 2) kullanarak, bir göçebe üçüncü INSTAR gıda şişeyi çıkarın ve elastomer kaplı cam yerleştirin.
  10. Cam micropipette uç ağız eki (adım 1.5) ile olumsuz hava basıncı kullanarak tutkal küçük bir birim ile doldurun.
  11. Pozisyon larva dorsal tarafı yukarı ile forseps ve yapıştırıcı tutkal olumlu hava basıncı ağız yoluyla kullanarak küçük bir elastomer kaplı coverslip başına bırak.
  12. Hayvan gerilir iki tutkal ekleri arasında gergin emin larva, posterior sonu ile bu yordamı yineleyin.
  13. Makas kullanarak (bıçaklar 3 mm; Malzemeler tablo), yatay kesim (~ 1 mm) arka ve dorsal orta çizgi boyunca dikey bir kesim yapmak.
  14. İyi forseps (#5, Tablo malzemeler), hafifçe kullanarak dorsal trakea, gut, yağ vücut ve kas kapsayan diğer iç organlara kaldırın.
  15. Yapıştırma yordamı yavaşça hem yatay hem de dikey olarak vücut duvar germek emin dört vücut duvar kapakları için yineleyin.
  16. Forseps kullanarak ventral sinir kablosu (VNC), dikkatle motor sinirler makasla kesin kaldırıp sonra tamamen VNC çıkarın.
  17. Diseksiyon serum Ca2 +ile değiştirin-ücretsiz serum (yukarıdaki diseksiyon salin CaCl2olmadan aynı) SV durdurmak için Bisiklete binme.

2. seçenek 1: Yüksek [K+] FM boya yükleme

  1. Bir FM1-43 hisse senedi çözümden (4 mM), 90 mm KCl çözüm (yüksek [K+] diseksiyon serum) 4 µM son bir konsantrasyon için 1 mL 1 µL ekleyin.
  2. Bir pipet kullanarak yerine Ca2 +-SV endositoz boya alımı teşvik için yüksek [K+] FM boya solüsyonu ile görüntüleme odasında ücretsiz salin.
  3. Hemen bir dijital zamanlayıcı stimülasyon dönemi depolarize yüksek [K+] önceden belirlenmiş süre başlatmak (Örn., 5 min; Şekil 2).
  4. Sağlıklı bir larva hazırlık onaylamak için yüksek [K+] depolarizasyon dönemi süresince kas güçlü kasılmalar unutmayın.
  5. Zamanlayıcı süresi sona erdiğinde, hızlı bir şekilde yüksek [K+] FM boya çözüm kaldırın ve Ca2 +ile değiştirin-SV durdurmak için ücretsiz serum Bisiklete binme.
  6. Yıkama ile Ca2 +hızlı art arda-ücretsiz serum (5 x 1 dk. için) yüksek [K+] FM boya çözüm tümüyle kaldırılır emin olmak için.
  7. Larva hazırlık taze Ca2 +içinde korumak-confocal mikroskop ile anında görüntüleme için ücretsiz salin.

3. Multimedya: Confocal mikroskobu

  1. Bir dik confocal mikroskobu 40 X su daldırma amaç görüntü NMJ boya Floresan (diğer mikroskoplar kullanılabilir) için kullanın.
  2. Resim 2-4 (diğer NMJs görüntüsü) karın segmentlerinin 4 NMJ kas ve toplamak uygun yazılımı (Tablo reçetesi) kullanarak görüntüler.
  3. Helene 633 nm lazer HRP:647 (ile uzun geçiren Filtre > 635 nm) ve FM1-43 (bant filtre 530-600 nm ile) heyecanlandırmak için bir Argon 488 nm lazer heyecanlandırmak için kullanın.
  4. Operasyonel en iyi kazanç ve her iki kanal için uzaklığını belirler.
    Not: Bu ayarlar deneme geri kalanı sabit kalır.
  5. Bir confocal Z-yığınında alt sinaptik terminal kısmındaki için tüm seçili NMJ HRP işaretli üst alır.
  6. Dikkatli yansıma NMJ (segment, yan ve kas) FM boya sonra boşaltma için tam olarak aynı NMJ aşırı sağlamak için dikkat edin.

4. yüksek [K+] stimülasyon: FM boya boşaltma

  1. CA2 +değiştirmek-sürücü depolarizasyon için yüksek [K+] serum (olmadan FM1-43 boya) ücretsiz serum SV ekzositozu ve boya yayın.
  2. Hemen bir dijital zamanlayıcı önceden belirlenmiş yüksek [K+] stimülasyon dönemi süresince başlatmak (Örn., 2 dk; Şekil 2).
  3. Zamanlayıcı süresi sona erdiğinde, hemen yüksek [K+] salin kaldırın ve Ca2 +ile değiştirin-SV durdurmak için ücretsiz serum Bisiklete binme.
  4. Yıkama ile Ca2 +hızlı art arda-ücretsiz serum (5 x 1 dk. için) yüksek [K+] salin tümüyle kaldırılır emin olmak için.
  5. Larva hazırlık taze Ca2 +içinde korumak-confocal mikroskop ile anında görüntüleme için ücretsiz salin.
  6. FM1-43 boya floresan confocal ayarların aynısını kullanarak yukarıda belirtildiği aynı NMJ, görüntü emin olun.

5. seçenek 2: Elektriksel stimülasyon FM boya yükleme

  1. Emme bir pipet gerekli konik elde edilir ve boyutu ipucu elektrot çektirme (Tablo reçetesi) kullanarak hazırlayın.
  2. Yangın-elektrot uç bir mikro-forge ile tek bir motor sinir ile sıkı bir uyum kadar sucked kadar Lehçe.
  3. Bir micromanipulator üzerinde emme pipet Elektrot tutucu üzerine kaydırın ve uzun esnek plastik tüp ve bir şırınga ekleyin.
  4. Uyarıcı parametreleri belirleme (Örn., 15 V, 20 Hz frekans, 20 ms süresi ve zaman 5 dk (Şekil 2) ya da 1 dk (Şekil 3)).
  5. Ca2 +değiştirmek-FM1-43 serum fizyolojik (4 µM; 1 mM CaCl2) Elektrofizyoloji sondaj platformu üzerinde yukarıda ile hazırlık larva üzerinde ücretsiz salin.
  6. Hazırlık mikroskop sahneye koymak ve larva ve emme pipet (40 X su-daldırma amaç) odakta olana aşaması yükseltmek.
  7. Kesim motor sinir emme elektrot şırınga tarafından oluşturulan olumsuz hava basıncı ile seçilen hemisegment innerve bir döngü kadar emmek.
  8. Seçili hemisegment kas kasılması için görsel olarak izleme sırasında stimülasyon kısa bir patlama ile emme elektrot işlevi sınayın.
  9. SV endositoz sürmeyi seçme parameters (adım 5,4) ve FM1-43 boya alımı (Şekil 2) kullanarak motor sinir uyarmak.
  10. Yıkama ile Ca2 +hızlı art arda-FM1-43 boya çözüm tümüyle kaldırılır emin olmak için ücretsiz serum (5 x 1 dk. için).
  11. Larva hazırlık taze Ca2 +içinde korumak-yukarıdan confocal görüntüleme protokolü kullanarak anında görüntüleme için ücretsiz salin.
  12. Yansıma NMJ (segment, yan ve kas) FM boya boşaltma sonra tam aynı NMJ erişim sağlamak için dikkatli dikkat edin.

6. elektriksel stimülasyon: FM boya boşaltma

  1. Ca2 +değiştirmek-ücretsiz (olmadan FM1-43 boya) normal serum fizyolojik serum ve hazırlık Elektrofizyoloji teçhizat sahnesinde yerini.
  2. Boşaltma için uyarıcı parametrelerini ayarlayın (Örneğin, 15 V, 20 Hz frekans, 20 ms süresi ve saati 2 dk (Şekil 2) veya 20 s (Şekil 3)).
  3. Aynı motor sinir yukarıdaki gibi aynı elektrot içine emmek ve SV ekzositozu ve FM1-43 boya yayın etkinleştirmek için teşvik etmek.
  4. Yıkama ile Ca2 +hızlı art arda-ücretsiz serum (5 x 1 dk. için) dış boya tümüyle kaldırılır emin olmak için.
  5. Larva hazırlık taze Ca2 +içinde korumak-confocal mikroskop ile anında görüntüleme için ücretsiz salin.
  6. FM1-43 boya floresan confocal ayarların aynısını kullanarak yukarıda belirtildiği aynı NMJ, görüntü için emin olun.

7. seçenek 3: Channelrhodopsin stimülasyon FM boya yükleme

  1. ChR2 ifade larva ChR2 ortak faktör all-trans retinal (içinde çözünmüş etanol; 100 µM son konsantrasyonu) içeren gıda yükseltmek.
  2. Larva hazırlık Pleksiglas odasında kamera bağlantı noktası ile donatılmış bir diseksiyon mikroskop sahne üzerine yerleştirin.
  3. Mavi LED eklemek (470 nm; Tablo malzeme) programlanabilir bir uyarıcı bir koaksiyel kablo kullanarak ve LED Kamera bağlantı noktasına yerleştirin.
  4. Mavi LED ışık ışını mikroskobu Yakınlaştır işlevini kullanarak disseke larva işlevi üzerine odaklanır.
  5. Ca2 +değiştirmek-ücretsiz salin ile optogenetic sahnede larva hazırlık FM1-43 serum (4 µM; 1 mM CaCl2) yukarıda üzerinde.
  6. Uyarıcı (Örneğin, 15 V, 20 Hz frekans, 20 ms süresi ve 5 dk (Şekil 2) zaman) kullanarak LED parametrelerini ayarlayın.
  7. Işık stimülasyon başlatmak ve optogenetic stimülasyon dönemi (Örneğin, 5 min; önceden belirlenmiş süresi için bir zamanlayıcı ile izlemek Şekil 2).
  8. Zamanlayıcıyı sona erdiğinde, hızlı bir şekilde FM boya çözüm kaldırın ve Ca2 +ile değiştirin-ZF durdurmak için ücretsiz serum Bisiklete binme.
  9. Yıkama ile Ca2 +hızlı art arda-FM boya çözüm tümüyle kaldırılır emin olmak için ücretsiz serum (5 x 1 dk. için).
  10. Larva hazırlık taze Ca2 +içinde korumak-yukarıdan görüntüleme iletişim kuralını kullanarak confocal mikroskop ile anında görüntüleme için ücretsiz salin.
  11. Yansıma NMJ (segment, yan ve kas) FM boya boşaltma sonra tam aynı NMJ erişim sağlamak için dikkatli dikkat edin.

8. Channelrhodopsin stimülasyon: FM boya boşaltma

  1. CA2 +değiştirmek-kamera bağlantı noktasını LED ile diseksiyon mikroskop sahnede (olmadan FM1-43 boya) normal salin ücretsiz serum larva üzerinde duruldu.
  2. Boşaltma (örn., 15 V, 20 Hz frekans, 20 ms süresi ve 2 dk (Şekil 2) zaman) yönelik uyarıcı parametreleri ayarlayın.
  3. Işık stimülasyon başlatmak ve optogenetic stimülasyon dönemi önceden belirlenmiş süresi için bir zamanlayıcı ile takip (Örneğin, 2 dk; Şekil 2).
  4. Zamanlayıcı süresi sona erdiğinde, hızlı bir şekilde FM boya çözüm kaldırın ve Ca2 +ile değiştirin-ZF durdurmak için ücretsiz serum Bisiklete binme.
  5. Yıkama ile Ca2 +hızlı art arda-ücretsiz serum (5 x 1 dk. için) dış boya tümüyle kaldırılır emin olmak için.
  6. Larva hazırlık taze Ca2 +içinde korumak-confocal mikroskop ile anında görüntüleme için ücretsiz salin.
  7. FM1-43 boya floresan confocal ayarların aynısını kullanarak yukarıda belirtildiği aynı NMJ, görüntü için emin olun.

9. floresans miktar

  1. Resim içinde resim J (NIH açık kaynak) yüklemek ve maksimum yoğunluk projeksiyon görüntü tıklatarak oluşturun | Yığınlar | Z proje.
  2. Kullanma belgili tanımlık anti-HRP:647 kanal, görüntüye git | Ayarlamak | Eşik ve slayt sadece NMJ vurgulanana kadar üst araç çubuğu.
  3. Değnek aracını kullanarak, NMJ üzerinde tıklatın. NMJ kesintili ise, ÜST KRKT tuşunu basılı tutun ve tüm parçaları seçin.
  4. Görüntü FM1-43 boya kanal değiştirmek ve Çözümle'git | Floresans ölçü elde etmek için ölçü birimi.
  5. (Tespit kesimi, yan ve kas) aynı NMJ adımlardan 9.1-9,4 "boş" görüntü için tekrarlayın.
  6. Boş boya yüzdesini elde etmek için boş/dolu floresans yoğunluklarını oranı almak.
    Not: Bu yordam floresan "oval" veya "serbest" seçim araçlarını kullanarak bouton başına bouton olarak analiz etmek için değiştirilebilir. Arka plan floresans kas floresans örnekleme tarafından çıkarılır. Ajanlar da bu arka plan azaltmak için eklenir.

Sonuçlar

Şekil 1 Protokolü Imaging etkinlik bağımlı FM boya için iş akışı gösterilmektedir. Deney her zaman daha sonra kullanılan stimülasyon yöntemi ne olursa olsun aynı larva tutkal diseksiyon ile başlıyor. Şekil 1a bir disseke larva, şematik ventral sinir kablosu (VNC), sinirler ve tekrarlanan hemisegmental kas desen yayılan bir şey. VNC kaldırılır ve hazırlık FM1-43 (Şekil 1b, p...

Tartışmalar

Yüksek [K+] serum fizyolojik uyarılma depolarize tarafından çok aktivite bağımlı FM boya Bisiklete binme ama büyük olasılıkla az fizyolojik29için üç seçenek en kolay yoldur. Bu basit yöntem tüm hayvan erişilebilir her hücrede depolarizes ve bu yüzden yönlendirilmiş çalışmalar izin vermez. Yerel olarak bir micropipette yüksek [K+] serum uygulamak mümkün olabilir, ama bu hala pre/postsinaptik hücre ve büyük olasılıkla synapse ilişkili glia

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip ilgi bildirin.

Teşekkürler

Broadie laboratuvar Üyeler bu makalede katkılarından dolayı teşekkür ediyoruz. Bu eser NIH R01s MH096832 ve MH084989 b. için tarafından desteklenen ve NIH HGUGM dostluk F31 MH111144 D.L.K. için

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
SylGard 184 Silicone Elastomer KitFisher ScientificNC9644388To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22x22-1Fisherbrand12-542-BTo put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200ThermolyneHPA2235MTo cure the SylGard
Plexi glass dissection chamberN/AN/AHandmade
Borosilicate Glass CapillariesWPI1B100F-4To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette PullerSutter InstrumentP-2000To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory TubingComponent Supply Co.TET-031AFor mouth and suction pipette
P2 pipette tipUSA Scientific1111-3700For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube capFisher Scientific05-408-120Used to put glue in for dissection
Vetbond 3MWPIvetbondGlue used for dissections
Potassium ChlorideFisher ScientificP-217Forsaline
Sodium ChlorideMillipore SigmaS5886For saline
Magnesium ChlorideFisher ScientificM35-500For saline
Calcium Chloride DihydrateMillipore SigmaC7902For saline
SucroseFisher ScientificS5-3For saline
HEPESMillipore SigmaH3375For saline
HRP:Alexa Fluor 647Jackson ImmunoResearch123-605-021To label neuronal membranes
PaintbrushWinsor & Newton94376864793To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5WPI500233Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm)WPI14177Used during dissection 
FM1-43Fisher ScientificT35356Fluorescent styryl dye
Digital TimerVWR62344-641For timing FM dye load/unload 
LSM 510 META laser-scanning confocal microscopeZeissFor imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0ZeissSoftware for imaging on confocal
HeNe 633nm laserLasosTo excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laserLasosTo excite the FM dye during imaging
Micro-ForgeWPIMF200To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip TipBD301625To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base)NarishigeMMN-9To control the suction electrode for electrical stimulation
StimulatorGrassS48To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop MicroscopeZeissUsed during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion ObjectiveZeissUsed during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans RetinalMillipore SigmaR2500Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera portZeiss2000-CUsed during channelrhodopsin stimulation
LED 470nmThorLabsM470L2Used for ChR activation
T-Cube LED DriverThorLabsLEDD1BTo control the LED
LED Power SupplyCincon Electronics Co.TR15RA150To power the LED
Optical Power and Energy MeterThorLabsPM100DTo measure LED intensity

Referanslar

  1. Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
  2. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
  3. Long, A. A., et al. Presynaptic calcium channel localization and calcium-dependent synaptic vesicle exocytosis regulated by the Fuseless protein. J Neurosci. 28 (14), 3668-3682 (2008).
  4. Kopke, D. L., Lima, S. C., Alexandre, C., Broadie, K. Notum coordinates synapse development via extracellular regulation of Wingless trans-synaptic signaling. Development. 144 (19), 3499-3510 (2017).
  5. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
  6. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J Cell Biol. 168 (6), 929-939 (2005).
  7. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
  8. Dickman, D. K., Horne, J. A., Meinertzhagen, I. A., Schwarz, T. L. A Slowed Classical Pathway Rather Than Kiss-and-Run Mediates Endocytosis at Synapses Lacking Synaptojanin and Endophilin. Cell. 123 (3), 521-533 (2005).
  9. Verstreken, P., et al. Endophilin Mutations Block Clathrin-Mediated Endocytosis but Not Neurotransmitter Release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
  10. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. -. Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of synaptic vesicle recycling using FM dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities. J Vis Exp. (85), (2014).
  11. Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36 (5), 555-559 (1988).
  12. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J Vis Exp. (36), e1790 (2010).
  13. Sabeva, N. S., Bykhovskaia, M. FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction. Bio-protocol. 7 (17), (2017).
  14. Sabeva, N., Cho, R. W., Vasin, A., Gonzalez, A., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Complexin Mutants Reveal Partial Segregation between Recycling Pathways That Drive Evoked and Spontaneous Neurotransmission. J Neurosci. 37 (2), 383-396 (2017).
  15. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  16. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  17. Trotta, N., Rodesch, C. K., Fergestad, T., Broadie, K. Cellular bases of activity-dependent paralysis in Drosophila stress-sensitive mutants. J Neurobiol. 60 (3), 328-347 (2004).
  18. Long, A. A., et al. The nonsense-mediated decay pathway maintains synapse architecture and synaptic vesicle cycle efficacy. J Cell Sci. 123 (Pt 19), 3303-3315 (2010).
  19. Parkinson, W., Dear, M. L., Rushton, E., Broadie, K. N-glycosylation requirements in neuromuscular synaptogenesis. Development. 140 (24), 4970-4981 (2013).
  20. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), (1993).
  21. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (8), (1982).
  22. Paschinger, K., Rendić, D., Wilson, I. B. H. Revealing the anti-HRP epitope in Drosophila and Caenorhabditis. Glycoconj J. 26 (3), 385-395 (2009).
  23. Ramachandran, P., Budnik, V. Fm1-43 labeling of Drosophila larval neuromuscular junctions. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (8), (2010).
  24. Yawo, H., Kandori, H., Koizumi, A. . Optogenetics: light-sensing proteins and their applications. , (2015).
  25. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J Neurophysiol. 101 (6), 3075-3088 (2009).
  26. Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J Vis Exp. (25), e1133 (2009).
  27. Britt, J. P., McDevitt, R. A., Bonci, A. Use of channelrhodopsin for activation of CNS neurons. Curr Protoc Neurosci. , (2012).
  28. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  29. Vijayakrishnan, N., Woodruff, E. A., Broadie, K. Rolling blackout is required for bulk endocytosis in non-neuronal cells and neuronal synapses. J Cell Sci. 122, 114-125 (2009).
  30. Honjo, K., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Optogenetic manipulation of neural circuits and behavior in Drosophila larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1470-1478 (2012).
  31. Dear, M. L., Shilts, J., Broadie, K. Neuronal activity drives FMRP- and HSPG-dependent matrix metalloproteinase function required for rapid synaptogenesis. Sci Signal. 10 (504), (2017).
  32. Baldwin, M. L., Rostas, J. A. P., Sim, A. T. R. Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B. J Neurochem. 85 (5), 1190-1199 (2003).
  33. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  34. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  35. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  36. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  37. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  38. Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. R. Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons. J Gen Physiol. 47 (5), 965-974 (1964).
  39. Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiol Rev. 54 (4), 813-889 (1974).
  40. Kuromi, H., Yoshihara, M., Kidokoro, Y. An inhibitory role of calcineurin in endocytosis of synaptic vesicles at nerve terminals of Drosophila larvae. Neurosci Res. 27 (2), 101-113 (1997).
  41. Seamon, K. B., Daly, J. W. Forskolin, cyclic AMP and cellular physiology. Trends Pharmacol Sci. 4, 120-123 (1983).
  42. Zhang, D., Kuromi, H., Kidokoro, Y. Synaptic Transmission at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects of Metabotropic Glutamate Receptor Activation. Slow Synaptic Responses Modul. , 260-265 (2000).
  43. Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19 (5), 1557-1565 (1999).
  44. Kuromi, H., Kidokoro, Y. Selective Replenishment of Two Vesicle Pools Depends on the Source of Ca2+ at the Drosophila Synapse. Neuron. 35 (2), 333-343 (2002).
  45. Kay, A. R., et al. Imaging Synaptic Activity in Intact Brain and Slices with FM1-43 in C. elegans, Lamprey, and Rat. Neuron. 24 (4), 809-817 (1999).
  46. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of Synaptic Activity in Hippocampal Slices with FM1-43 Enabled by Fluorescence Quenching. Neuron. 24 (4), 803-808 (1999).
  47. Denker, A., Rizzoli, S. O. Synaptic vesicle pools: an update. Front Synaptic Neurosci. 2, 135 (2010).
  48. Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol. 587 (12), 2919-2926 (2009).
  49. Wucherpfennig, T., Wilsch-Bräuninger, M., Gonz ález-Gait án, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161 (3), 609-624 (2003).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Neurosciencen rom sk ler kav aksorunu 135DrosophilaFM1 43Elektrofizyolojiphotoconversiontransmisyon elektron mikroskobu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır