Sıralı veri--dan toplu Maya 2-hibrid perde Bilişim Analizi

Özet

Pozitif Maya 2-hibrid etkileşimleri için potansiyel olarak seçilen Maya nüfusun derin sıralama etkileşen ortak proteinler hakkında bilgi hazinesi verir. Burada, biz böyle ekranlar sıra verileri çözümlemek için özelleştirilmiş güncelleştirmek bilgisayar yazılımı ve belirli Biyoinformatik araçlarını işlemini açıklar.

Özet

Aynı anda onlarca geçici ve statik protein etkileşimleri yüksek üretilen iş kısa okuma DNA sıralama kullanan tek bir ekran içinde ortaya çıkarmak için Maya 2-hibrid tahlil adapte olması. Elde edilen sıra veri kümeleri sadece olumlu Maya 2-hibrid etkileşimleri için seçimi sırasında zenginleştirilmiş hangi genlerin bir popülasyondaki izlemek ama ayrıca protein etkileşimi için yeterli ilgili alt etki alanları hakkında ayrıntılı bilgi verir. Burada, uzman olmayan tüm Biyoinformatik ve işlemek ve DNA dizisi fastq dosyaları toplu Maya 2-hibrid tahlil analiz istatistiksel adımları gerçekleştirmek izin tek başına yazılım programları tam bir süit açıklayın. Bu yazılım tarafından örtülü işlem adımları içerir: bir Maya 2-hibrid av kitaplıkta; kodlanmış her aday protein karşılık gelen 1) haritalama ve sayım sıra okuma 2) zenginleştirme profilleri değerlendirir bir istatistiksel analiz programı; ve 3) translasyonel çerçeve ve kodlayıcı bölge içinde konumunu ilgi etkileşen protein kodlayan her zenginleştirilmiş plazmid incelemek için araçlar.

Giriş

Protein etkileşimleri keşfetmek için bir yaklaşım hangi olağanüstü başarı bir protein ilgi etkileşen bir ortak¹bir parçası için bağlandığında büyümek Maya hücreleri mühendislik Maya 2-hibrid (Y2H) tahlil olduğunu. Birden çok Y2H etkileşimleri tespiti şimdi büyük paralel yüksek üretilen iş sıralama yardımı ile yapılabilir. Birkaç biçimi olmuştur nerede nüfus toplu üretmek plazmid içeren Maya için seçin koşullar altında yetiştirilen geliştirdiğimiz bir dahil olmak üzere^2,3,4,5 açıklanan bir pozitif Y2H etkileşim⁶. İş akışı geliştirilen, DEEPN (Protein ağları değerlendirme için dinamik zenginleştirme) olarak adlandırdığı, fark interactomes bir protein (veya etki alanı) vsile etkileşim proteinler tanımlamak için aynı av kitaplıklarındaki tanımlar. başka bir protein veya doğurmak farklı mutant etki alanı. Bu iş akışındaki temel adımlardan uygun işleme ve DNA sıralama veri analizi biridir. Bazı bilgiler sadece her gen için okuma önce ve sonra seçimi bir moda Y2H etkileşimlerin sayısını benzer bir RNA-seq deney sayarak panoda. Ancak, çok daha ayrıntılı bilgi Y2H etkileşim üretebilen bir verilen protein alt etki alanı hakkında bilgi de dahil olmak üzere bu veri kümeleri elde edilebilir. DEEPN yaklaşım değerli ise, buna ek olarak, birçok örnek çoğaltır analiz hantal ve pahalı olabilir. Bu sorun özellikle DEEPN veri kümeleri için geliştirilmiş istatistiksel bir modelini kullanarak çoğaltır sayısı sınırlı⁶nerede ortadan kalkar. İşleme ve analiz DNA sıralama veri kümeleri Biyoinformatik uzmanlık olmadan bu araştırmacılar için güvenilir, tam, sağlam ve erişilebilir yapmak için a maiyet-in tüm adımları analiz kapak yazılım programları geliştirdi.

Masaüstü bilgisayarlarda tek başına yazılım programları bu paketi MAPster, DEEPN ve Stat_Maker içerir. MAPster aşağı akım uygulamalarda kullanmak için bir standart .sam dosyası üreten her fastq dosya sıraya eşlemek için istimal HISAT2 programı⁷, genom sağlar bir grafik kullanıcı arayüzü var. DEEPN birkaç modülden oluşmaktadır. Bu atar ve belirli gen 'Gene say' modülü kullanılarak bir RNA-seq türü miktar için benzer karşılık gelen okur sayar. Ayrıca Gal4 transkripsiyon etki alanı ve av dizini arasında kavşak karşılık gelen dizileri ayıklar ve onların muayene karşılaştırmalı tablolar ve grafikler ('Junction_Make' modülü kullanılarak) izin vermek için bu kavşak konumunu harmanlar 'Blast_Query' modülü kolay muayene, Nefelometri ve kavşak Gal4 junction sıralarının karşılaştırma sağlar. Stat_Maker okuma başına gen zenginleştirme veri büyük olasılıkla Y2H sayısı öncelik istatistiksel bir yolu olarak değerlendirir. Burada, biz nasıl kullanma bunlar bilgisayar yazılımı bilgisayar programı ve DEEPN Y2H verilerden deneme DNA dizisi tam olarak çözümlemek için açıklar. DEEPN sürümleri PC, Mac ve Linux sistemleri çalıştırmak kullanılabilir. Eşleştirme programı MAPster gibi diğer programlar ve DEEPN istatistikler modülü Stat_Maker Unix altında çalışan ve yalnızca Mac ve linux sistemlerinde kullanılabilir alt yordamlar kullanır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. eşleme Fastq dosyaları

Not: Başvuru DNA konumunda için DNA dizisi veri okumak her sıra onda eşlenmiş DEEPN bilgisayar yazılımı hem hem birçok Biyoinformatik programı kullanın. Haritalama programları çeşitli bu HISTAT2 programın sonraki adımda kullanılan .sam dosyaları üretmek için kullandığı MAPster arabirimi eklemek için kullanılabilir.

1. Sıralı veri genom doğru sürüme eşleyin. Y2H kitaplıkları için fare kökenli, UCSC mm10 genom kullanın; o insan genleri kullanarak, UCSC hg38 başvuru soykırım, Saccharomyces cerevisiae genler için kullanın, UCSC SacCer3 başvuru genom kullanın.
2. MAPster yükleyin.
   1. MAPster yazılımını indirin ve yükleyin. Aşağıdaki, bir web tarayıcısı kullanarak yazılım bulunabilir: https://github.com/emptyewer/MAPster/releases. HISAT2 bir Apple Macintosh gibi UNIX tabanlı sistemlerde çalışır. Bu nedenle, MAPster program yalnızca Apple Macintosh ve linux gibi uyumlu sistemlerde çalışır.
      Not: Bir Apple Mac için sistem gereksinimleri şunlardır: OSX 10.10 +, > 4 Gb RAM, > 500 Gb disk alanı ve başvuru genleri indirmek için internet bağlantısı. Kullanıcılar kendi kurumsal yönetici haklarını ve izinlerini kısıtlayarak güvenlik protokolleri varsa bir kurumsal ile o kişinin danışmanız gerekebilir.
3. Gerekli dosyaları ve "Ana" sekmesini (Şekil 1) aracılığıyla parametreleri girin. Dosyaları girmek için uygun "Pairwise" düğmesini ya da gibi çiftleri ile FASTQ olarak varsayılan dosya biçimi unpaired seçin.
   1. DEEPN analiz için tek okuma biçimde çalıştırmak için "Off" "Pairwise" seçeneğini kapatın.
   2. Dosyaları sürükle ve bırak uygun pencere içine sadece tarafından MAPster yükleyin.
   3. Bir referans Y2H av kitaplığı ekler kaynağına karşılık gelen DNA/genom kaynak'ı seçin. Birkaç model organizmalar üzerinden dizin oluşturulmuş genleri "Genom" kutusunda listelenir ve otomatik olarak merkezi Johns Hopkins Üniversitesi'nden-ebilmek var olmak downloaded için İşlemsel Biyoloji. Başvuru genleri daha sonra kullanmak üzere yerel olarak depolanır.
   4. HISAT2 çekmek multi-iplik beri "Konu" kutusunun altındaki eşleme programa sadık olmak bilgisayar işlem sayısını gösterir. MAPster bilgisayarı arayın ve varsayılan olarak kullanılabilir olan işlemci en fazla sayısını öneririz.
   5. Çıkış dosyası adı belirtin. Bu yüzden kısa ama açıklayıcı bir ad boşluk veya özel karakterler olmaksızın tavsiye bu dosya adı DEEPN süreci boyunca kullanılır. Çıkış "Açık çıktı dizin" düğmesini kullanarak eşlenen dosyaları için bir klasör belirtin.
   6. Parametreleri ve uygun dosyaları seçtikten sonra eşleme iş "Eklemek için sıraya al" düğmesini kullanarak işleri sıraya ekleyin. Ana penceresinde dosya adları silinir ve yeni bir örneğe karşılık gelen dosyalarla değiştirilir ve onlar sıraya karşılık gelen bir çıktı dosya adı sağladıktan sonra eklenebilir.
   7. Tüm işleri iş kuyruğuna girildikten sonra "Sıra çalıştırmak" düğmesini tıklatın.
      Not: bir kez bir eşleme iş sırasına yerleştirilir, bu işi seçmek "İş parametreleri" ve "İş komut" penceresinde görüntülenecek tüm bağımsız değişkenler komut satırı deyimiyle görüntülenecek parametre ayarlarını neden olur. Çıkış seçenekleri hizalamak için başarısız devam okuma olup olmadığını yönlendiren ve birincil hizalamaları her okuma için izin sayısını belirten içerir. MAPster varsayılan çıkış dosyasından (Örneğin bir '.sam' dosyası) SAM biçimindedir. Tüm sıra okuma fastq dosyalarından (eşleştirilmiş) olduğunu o da dahil olmak üzere bu örnek için belirtilen ve değildi içereceği (belirtilen geome başarıyla eşlenen eşlenmemiş).

2. Bioinformatic işleme kullanarak DEEPN yazılımı

Not: DEEPN yazılım şu anda fare cDNA dizileri, insan cDNA dizileri veya S. cerevisiae genomik DNA dizileri içeren av kütüphaneleri ile kullanım için derlenmektedir. DEEPN standart .sam dosya biçimlerini kabul eder ve her eşlenmeyen ve eşlenen okuma için hem eşlenmiş hem de eşlenmemiş okuma veya ayrı dosyalar içeren bir SAM (.sam) dosya kabul edebilir.

1. DEEPN yazılımını indirin ve yükleyin. Aşağıdaki, bir web tarayıcısı kullanarak yazılım bulunabilir: https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases. Bilgi işlem platformu ve download hangi sürümü ile eşleşen seçin. Yüklemek için karşıdan yüklenen yükleme paketi açın.
   Not: DEEPN sürümleri için PC, Mac ve Linux sysrems mevcuttur. Mac ve PC sistemleri olmalı > 500 Gb sabit disk alanı ve > 4 Gb RAM.
2. DEEPN yazılımını açın. Ana penceresinden (Şekil 2) karşılık gelen bir av kütüphane bilgi üst seçim kutusundan seçin. İşlem gören dosyaları "Çalışma klasörü" düğmesini ve gezinme ağıl/müdür için gidebilecekleri bir klasör seçin. Gerekirse yeni bir klasör/dizin oluşturabilirsiniz. Bir "çalışma klasörü" seçildikten sonra DEEPN unmapped_sam_files, mapped_sam_files ve sam_files adlı üç alt klasörler oluşturabilirsiniz.
   1. Bu gibi hem eşlenmiş hem de eşlenmemiş okuma içeren .sam dosyaları kullanılarak üretilen MAPster programın varsayılan ayarlarla Eğer onları 'sam_files' klasörüne yerleştirin. Aksi takdirde .sam dosyalarını içine belgili tanımlık unmapped_sam_files ve mapped_sam_files buna göre yerleştirin.
3. İşleme "Gen sayısı + Kavşağı yapmak" düğmesini tıklatarak başlatın.
   Not: İşlem eşleme pozisyonlar her gen için kaç defa okundu karşılık saymak için kullanacağı gen sayısı modülü ile başlayacak. Kavşak yapmak sonra kavşak dizileri ayıklamak (dizileri erimiş doğrudan aşağı akım Gal4-harekete geçirmek etki alanından) üzerinden okuma ve patlama algoritmasıyla tanımak. Bu, Şekil 3' te resimde klasörlerin tam bir set oluşturur. İşlem zamanı büyüklüğüne ve sıralı veri dosyası sayısı ve kullanılan bilgisayarın işlem hızından bağlıdır. 12 – 30 h ~ 250 milyon deneysel veri kümesinin aralığından tipik kez okur. Gen sayısı yordam ve Junction_Make yordam tek tek "Gen sayısı" ya da "Kavşağı yapmak" düğmesini tıklatarak başlatılabilir.
4. Karşıdan yükleyip Stat_Maker (https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases). Bu bir istatistiksel analiz paketi şu anda yalnızca UNIX Mac sistemlerinde çalışır DEEPN veri kümeleri için dizayn edilmiştir.
   1. Stat_Maker açın ve tıkırtı belgili tanımlık düğme "Doğrulamak yüklemeyi" (Şekil 4). İlk kez çalıştırıyorsanız, Stat_Maker otomatik olarak R, KEŞLER ve Bioconductor internetten bu kaynakları çekerek yükler. Kez R, KEŞLER ve Bioconductor algılandı, Stat_Maker aktif hale gelir ve daha fazla kullanıcı girişi sağlar.
   2. DEEPN işlenen çalışma klasöre gitmek için "Klasörünü Seç" düğmesini tıklatın. Stat_Maker otomatik olarak bulmak ve penceredeki istatistiksel analiz için dosyaları listelemek.
   3. Uygun dosyaları dosya listesi penceresinden dosya windows altında her vektör ve yem veri kümesi için ve her büyüme koşulları için sürükleyip bırakamazsınız: seçili olmayan (onun + medya) ve (onun - medya) seçili. Önemlisi, Stat_Maker boş için yinelenen veri kümelerini tek başına, seçili olmayan nüfusun iki örnek vektör ve iki örnekleri seçili gerektirir. Bu tahmini değişkenlik deneme içinde verir.
   4. "Çalıştır" düğmesini tıklatın. Bilgisayarın hızına bağlı olarak, hesaplama 5-15 dakika arasında sürer.
5. Etiketli "Stat_Maker sonuçlar" ana çalışma klasörü içinde yeni bir alt klasör yerleştirildiği Stat_Maker çıktı sonuçları gözden geçirin.
   Not: Sonuçları ortak elektronik tablo programları açılabilir bir CSV (virgülle ayrılmış değerler) dosyasında bulunur. Stat_Maker differentially faiz ile yem seçimi boş pTEF-GBD (Şekil 5) zenginleştirilmiş muhtemeldir gen sayısı rütbe olacak. Ayrıca tablo her veri kümesi için okuma yüzdesi gen ekleme, veya açık okuma çerçevesi ve olsun gene de doğru translasyonel okuma çerçevesi içinde bulunan içinde ters yönde, bulunursa nerede. Çoğu zaman, DEEPN bir yem sağlam Y2H etkileşimleri ile ilgili protein uygun okuma çerçevesi dışında veya bir karşılık gelen onun açık okuma çerçevesi aşağı akım cDNA parçasıdır verilen cDNA bölümlerini yakalayacaktır. Stat_Maker birleştirilmiş çıktısı tarama algılama ve bu alakasız sayısı ortadan kaldırılması basitleştirir.
6. Her potansiyel aday üzerinde verileri gözden geçirmek için açık DEEPN bilgisayar yazılımı, karşılık gelen av kütüphane bilgi ve sonra "Çalışma klasörü" kullanarak doğru çalışma klasörü seçin.
   1. "Patlama" sorgu"düğmesini tıklatın. Bu yeni pencere (Şekil 6) yükler. Üst metin kutusuna gen adını veya aday gen ilgi seçmek için GenBank NM numarasını yazın. Bu gen adları StatMaker çıktı dosyasında listelenen adlarına karşılık gelir. Türü enter veya return, hangi ilgi gen alınmasını başlatır.
   2. Hangi veri kümeleri "Veri kümesi seçin" menüleri kullanarak çözümleme için kullanılacak seçin. Genellikle, bunlar sadece vektör içerir ve selektif olmayan koşullar altında yetiştirilen örnekleri ve seçimi koşullar altında yetiştirilen yem örnek yem. Başlangıçta, veri kümelerini yüklemek için bir kaç saniye sürecek, ancak, aynı veri kümeleri farklı genler ile sonraki sorgu hızla gidecek. Blast_Query ilgi ve nasıl bol miktarda her erime noktası sıra boyunca füzyon noktaları görüntüler. Bu hem "Sonuçlar" sekmesini kullanarak tablo biçiminde veya bir grafik biçiminde "Komplo" sekmesini kullanarak görüntülenebilir. Bu sonuçlar bir .csv dosyasına sağ üst köşesinde ".csv Kaydet" düğmesini tıklatarak dışa aktarılabilir.

3. DEEPN tarafından belirlenen adaylar doğrulanması

Not: DEEPN ve Stat_Maker amacı bir pozitif Y2H etkileşim vermek aday genler belirlemektir. Böyle Y2H etkileşimleri doğrulama de bitmiş yem plazmid ilgi kullanarak geleneksel ikili Y2H biçimini kullanarak boş Gal4-harekete geçirmek etki alanı 'av' plazmid ile eşleştirilmiş olarak faiz gen/cDNA parçası taşıyan av plazmid ile eşleştirilmiş. Gerçek plazmid DNA Y2H Seçime tabi Maya popülasyondan izole karışımı içinde ilgi izole etmek mümkün değildir. Ancak, bir hesaplama açısından ne o Y2H etkileşim üretiyor gen/cDNA parçası olan yeniden yapılandırma, astar 5' ve 3' ucunda bu parça için tasarım ve o parça Maya popülasyondan izole DNA yükseltmek. Bu bölüm 5' ve 3' sonunda aday av parçasının bulmak açıklar.

1. DEEPN yazılımını açın ve parametreleri "Select Parameter" ve "İş projeye karşılık gelen klasör seç" çalışma klasörü seçin. Blast_Query modülü "Patlama" sorgu"düğmesini tıklatarak başlatın.
2. Faiz veya onun GenBank "NM" gen adını yazın en iyi metin kutusuna numara. Aşağı açılır menüden birleşme pozisyonları 'Sonuç' sekmesinin altındaki tablo almak için seçilen Maya popülasyon için yem ilgi için karşılık gelen veri kümesini seçin. Varsayılan olarak, veritabanı içinde bulunan kavşak sayısı ppm tarafından sayısal veri kümesi, onların bereket göre farklı pozisyonlar Blast_Query sipariş edecek.
   1. En bol pozisyon bulmak "ORF içinde" ve "çerçevesinde". Pozisyon için değer üst metin kutusunda bulunan nükleotit konumunu gen NCBI başvuru sırası ('NM' numarası) ile karşılık gelir. Bu sıra GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/) alınan veya Blast_Query pencerenin alt metin kutusuna kopyalanır.
      Not: Bir örnek Şekil 6' da, orta masası bulunur. Merkezi veri kümesinde 'Sonuç' en bol kavşak göster: 'Konum': 867; '#Junctions': 20033.821; 'Sorgu Başlat', 1; CD: ORF; ve 'Çerçeve': çerçeve içinde. Nükleotit 867 GenBank NCBI başvuru sırası NM_019648 av parçası başlıyor.
3. Sorguyu başlatın 1 ise, 5' ucuna pozisyon numarasına karşılık gelen nükleotit dahil etmek için astar tasarım ve o konumdan (Şekil 7) 25 nükleotit aşağı genişletme. Sorguyu başlatın 1 den fazla ise, Gal4 harekete geçirmek etki alanı ve faiz av dizisi arasındaki fazladan nükleotid vardır ve astar aşağı sorguyu başlatın değerine göre daha başlaması gerektiğini gösterir.
4. DEEPN penceresinden "Verileri çözümleme" altında "Okuma derinlik" düğmesini tıklatın. Okuma derinlik penceresi açıldıktan sonra NCBI başvuru sırası (NM) numarası veya gen adı üst metin kutusuna yazın. İlgi zenginleştirilmiş gen içeren ilgili veri kümesi seçmek için açılan menüyü kullanın. Soldaki tablo kullanın ve kaç defa okundu faiz (Şekil 7B) gen için karşılık gelen veri bulunamadı belirlemek için sağdaki grafik görüntüler.
5. Okuma derinlik tarafından hesaplanan gen parça dizisi ele geçirecek bir 3' son astar tasarım. Okuma zenginliği ORF giderse ve dur kodonu, o katmak kodonu ve sadece akıntıya karşı bölgenin kodonu astar tasarlayın. Gen dizileri için kodonu genişlemediğine sonuçları tablo tespit edilebilir ve bu pozisyon en uzak 3' kullanabileceğiniz en uzak 3' bölgesini bulmak için kullanırsanız, astar yerleştirmek için konumu.
   Not: Okuma derinlik program belirtilen gen/cDNA ilgi maç dizileri bulamadı aralıklarla tarar. Bu en bol av parçası 5' ve 3' sonu o gen örnek için nerede tahmin yardımcı olur. Şekil 7' de görüldüğü gibi dizinin uzunluğunu okuma derinliğine dalgalanmaları normaldir. Okuma derinlik açıkça kodonu ise, av parçası kodonu genişletir ve böylece 3' astar sadece kodonu çevresindeki karşılık gelebilir gösterir.
6. Gen başına 50 µL PCR reaksiyonu gerçekleştirmek. Her reaksiyon 25 pmol av-Kütüphane plazmid eşleşen her ileriye ve geriye doğru astar içerir (bkz. tablo malzeme). Reaksiyonlar da yüksek-sadakat 2 x PCR Master Mix 25 µL, DNA örneği ve 50 µL kadar su 5 µg içerir.
   1. Tavlama sıcaklığı 55 ° C 30 72 ° C'de 3 dk. uzantılı kez 25 döngüleri için tepkiler yükseltmek s ve 10 98 ° C'de denaturing 98 ° C'de 30 s denatürasyon tarafından Bisiklete binme Precede s. ve 72 ° C'de 5 dk kuluçka ile takip edin

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Fastq veri eşleme: ilk adım
DEEPN ilk çıkış, hizalama için genomik tarafından eşlenmelidir kısa sıra okuma bir dosyadır dahil olmak üzere hemen hemen tüm NGS uygulamalarda transcriptomic veya diğer referans DNA⁸. Son zamanlarda, HISAT2 hizalama program eşleme hız^7,9önemli ölçüde artırmak için state-of--art dizin oluşturma algoritmaları kullanan geliştirilmiştir...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Burada açıklanan yazılım paketi bir tamamen işlemek ve DEEPN deney yüksek işlem hacmi DNA sıralama verileri çözümlemek izin verir. Kullanılan ilk DNA dizisi okuma standart fastq dosyalarında alır ve konumlarını DEEPN yazılım da dahil olmak üzere bilişim programları bir bütün ana tarafından aşağı akım işleme için bir referans DNA üzerine haritalar MAPster bir programdır. Belgili tanımlık yarar MAPster arabirimi ve birden çok iş birleştirmek giriş dosyaları, sıraya yeteneğini coveni...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mapster			https://github.com/emptyewer/MAPster/releases
DEEPN software			https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases
Statmaker			https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases
Minimum computer system	Apple		Mac Intel Core i5 or better
	-		4 Gb RAM or better
	-		500 Gb Disk spce or better
	-		OS 10.10 or higher
	Dell		Intel i5-7400 or better
	-		4 Gb RAM or better
	-		500 Gb Disk spce or better
	-		Windows 7 or higher