Yalıtım, genişleme ve Adipojenik indüksiyon CD34 + CD31 + insan Omental ve deri altı yağ dokusu endotel hücrelerden

Özet

Yağ dokusu vasküler ataları gelen beyaz ve bej adiposit farklılaşma obezite metabolik iyileştirme için potansiyel taşımaktadır. CD34 + CD31 + insan yağı endotel hücre izolasyon ve bir sonraki vitro genişleme ve farklılaşma beyaz ve bej adiposit içine iletişim kurallarını açıklar. Birkaç aşağı akım uygulamaları ele alınmıştır.

Özet

Obezite bir geniş yağ dokusu adipocyte hipertrofisi ile öncelikle remodeling tarafından eşlik ediyor. Aşırı adipocyte büyüme insülin, yerel hipoksi ve inflamasyon zavallı bir yanıt sonuçlanır. Tarafından ataları gelen fonksiyonel beyaz adiposit farklılaşma uyarıcı, radikal hipertrofisi adipocyte nüfusun önlenebilir ve sonuç olarak, yağ dokusu metabolik sağlık bir azalma ile birlikte geliştirilebilir iltihap. Ayrıca, bej/kahverengi adiposit bir farklılaşma uyararak, toplam vücut enerji harcaması, kilo kaybına kaynaklanan artırılabilir. Bu yaklaşım obezite komorbiditeler tip 2 diyabet ve kardiyovasküler hastalık gibi gelişimini engelleyebilir.

Bu kağıt yalıtım, genişleme ve beyaz ve bej adiposit CD31 ve CD34 işaretleri Co hızlı insan yağ dokusu endotel hücre alt grubunu üzerinden farklılaşma açıklanmaktadır. Yöntem nispeten ucuzdur ve emek yoğun değil. İnsan yağ dokusu erişimi gerektirir ve subkutan depo örnekleme için uygundur. Bu iletişim kuralı için taze yağ doku örnekleri morbid obez bir konu [vücut kitle indeksi (VKİ) > 35] Bariatrik cerrahi prosedürler sırasında toplanır. Stromal vasküler kesir üzerinden sıralı bir immunoseparation kullanarak, yeterince hücre gibi 2-3 g yağ küçük üretilmektedir. Bu hücreler kültür-ebilmek var olmak genişlemek 10-14 gün içinde cryopreserved ve geçiş kadar 5-6 passaging ile onların Adipojenik özellikleri korurlar. Hücreleri bir Adipojenik insan insülin bir arada ve PPARγ agonist-rosiglitazone kullanarak kokteyl ile 14 gün için kabul edilir.

Bu yöntem-ebilmek var olmak kullanılmış yağ endotel hücrelerinde Adipojenik yanıt-e doğru götürmek moleküler mekanizmaları üzerinde kavramı deneyler kanıtı elde etmek için veya Adipojenik artırabilir yeni ilaçlar eleme için yanıt ya beyaz doğru yönetmen ya da bej/kahverengi adipocyte farklılaşma. Küçük subkutan biyopsi kullanarak, Bu metodoloji Yanıtlayıcı olmayan konular için klinik çalışmalarda bej/kahverengi ve beyaz adiposit komorbiditeler ve obezite tedavisi için teşvik etmek amaçlı dışarıda için kullanılabilir.

Giriş

Son kanıtlar hem fareler ve insanlar, yağ dokusu damarlara ikamet eden hücre alt grubunu beyaz veya bej/kahverengi adiposit^1,2,3Ayrıştırılan gösterir. Bu tür hücrelerin fenotip tartışmalara, endotel hücreleri, düz kas/pericyte veya ara fenotipleri^4,5,6,7bir spektrum destekleyen kanıt ile bir konudur. Bu metodoloji geliştirme kapsam CD34 + CD31 + endotel hücreleri obez insanlar farklı yağ depoları dan izole Adipojenik potansiyelini test etmek için yapıldı. Diğer çalışmalar literatürde potansiyel toplam stromal vasküler fraksiyonunun veya bilinen adipocyte ataları^2,8,9Adipojenik üzerinde duruluyor. Şu anda mevcut teknolojilerin özellikle yağ dokusu endotel hücreleri ilaç teslim¹⁰için hedef olabilir olduğundan, potansiyel böyle hücrelerinin Adipojenik geçmesi anlama indüksiyon beyaz veya bej adiposit doğru için önemlidir gelecekte hedefli tedaviler.

Farklı gruplar CD31 ve CD34 işaretleri arada insan yağ dokusu^11,12,13endotel hücreleri izole etmek için vekilleri olarak bildirdi. Genellikle, yalıtım iki sıralı adımları ve manyetik boncuklar kullanarak pozitif seçimi kullanılarak gerçekleştirilir. Bu raporda, CD31 plastik boncuk ile kombine CD34 + manyetik bir boncuk kullanarak immunoseparation kullanılmıştır. Bu teknik sıralı manyetik immunoseparation tipik Arnavut kaldırımlı endotel morfoloji korunması ile ilgili olarak daha üstün bulduk. Ayrıca, 1-2 g yağ gibi küçük başlangıç genişleme ve Adipojenik indüksiyon için gerekli yeterince hücre oluşturmak başardık. Küçük örnek biyopsi subkutan yağ hücreleri aşağı akım uygulamaları için gerekli miktarı üretmek için yeterli olacaktır. Bu açıdan özellikle bu yöntem insan denekler Adipojenik indüksiyon bir kavramaları için tarama için kullanılacaktır, potansiyel olarak önem kazanır.

Literatürde bildirilen diğer sistemlerin aksine, bu yöntem CD34 + CD31 + hücrelerinin Adipojenik indüksiyon için sadece iki malzemeler kullanır: bir PPARγ agonist — rosiglitazone — ve insan insülin. Önemlisi, insanlar¹⁴post-absorptive insülin dolaşan normal/yüksek Aralık içinde kullanılan insülin miktarı düşer. Akt fosforilasyon tarafından ölçülen hücreleri vitro, insülin duyarlılık derecesini indüksiyon kokteyl tepki yeteneğini kendi ile ilişkili değil. İlginçtir, bu indüksiyon kokteyl ve deneysel koşullar kullanarak, beyaz ve bej/kahverengi hücreleri bir karışımı elde edilen boyutu ve sayıda hücre içi lipid damlacıkları ve moleküler işaretleyicilerin görünümünü ifade tarafından belirlendiği gibi. Bu basit ve maliyet-etkin indüksiyon Protokolü (bej beyaz vs. ) Yanıtlayıcı hücrelerinin fenotip kantitatif değerlendirilmesi ile birlikte potansiyel olarak farklılaştırılmış bej dengesini değiştirebilir ajanlar bir tarama için izin verir : beyaz adiposit.

Bu yöntem aynı zamanda insan yağ dokusu içinde vasküler endotel ataları adipogenesis temel mekanizmaları anlamak için translasyonel bir yaklaşım sağlar. Bu özel yalıtım/farklılaşma tekniği kullanarak, müfettişler çeşitli yolları yalın ve obez insanlarda çeşitli yağ depoları dan adipogenesis vasküler endotel hücre alt grubunu içinde sorumlu sorguya çekebiliriz.

Protokol

Kurumsal teftiş kurulu Derneği Doğu Virginia Tıp Fakültesi, araştırma ve çalışmada kullanılan insan yağ doku örnekleri toplanması onayladı. Bilinçli yazılı izni hastalardan toplanmıştır.

1. hazırlanması arabellekleri, medya ve aletleri

1. Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered çözüm (KRBBS) hazırlamak: 135 mM sodyum klorür, 5 mM potasyum klorür, 1 mM magnezyum sülfat, 0.4 mM potasyum fosfat dibasic, 5.5 mM glikoz, 1 mM Adenozin, % 0,01 antibiyotik/antimycotic mix (50 µg/mL penisilin, 50 µg/mL streptomisin, gentamisin 30 µg/mL, amfoterisin 15 ng/mL) ve 10 mM HEPES (pH 7.4 =). Bu çözüm doku toplama ve sindirim için her zaman taze hazırlanır.
2. Taze collagenase çözüm hazırlamak: 1 mg/mL collagenase, tip 1, KRBSS; 3 mL/g yağ olun. Doku sindirim önce su banyosunda 37 ° C'de collagenase çözüm önceden ısıtmak.
3. CD34 hücre izolasyon arabellek hazırlamak: % 2 fetal Sığır serum (FBS) ve 1 mM EDTA steril fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS).
4. Adipogenesis ortam hazırlamak: DMEM/F12, % 5 FBS, 50 µg/mL penisilin/streptomisin, 1,25 µL/mL (5 µg/mL veya 144 mU/mL) insan insülin ve 0,36 µL/mL 2.8 mM rosiglitazone (1 µM).
5. %0,3 yağ kırmızı O (ORO) hisse senedi çözüm (ağırlık/hacim) ORO 0.3 g isopropanol 100 mL içine çözülerek hazırlayın.

2. yağ Stromal vasküler kesir yalıtım

Not: Morbid obez tip 2 diyabetik (T2D) ve Sentara metabolik ve kilo kaybı cerrahi Merkezi'nde (Sentara Medikal Grubu, Norfolk, VA) obezite cerrahisi uygulanan diyabetik olmayan konular, 18-65 yaş arası kesitsel bir kohort çalışma dahil. Dışlama kriterleri bir otoimmün hastalığı tip 1 diyabet, kronik immünsüpresif tedavi, Anti-inflamatuar ilaçlar, thiazolinendiones, etkin tütün kullanımı, kronik veya akut enfeksiyonlar veya bir geçmiş gerektiren koşullar da dahil olmak üzere dahil Son 12 ay içinde tedavi malignite. T2D 126 mg/dL veya daha büyük bir açlık plazma glukoz, 200 mg/dL veya daha büyük 2 h glikoz tolerans testi sonra bir glukoz veya antidiyabetik ilaçların kullanımı tanımlanmıştır.

1. İnsan omental (OM) ve subkutan (SC) Yağ dokusundan (AT) insan denekler obezite cerrahisi uygulanan toplamak.
2. OM ve SC AT hemen doku çıkarma sonra Hank tamponlu tuz solüsyonu ile 50 µg/mL penisilin/streptomisin, oda sıcaklığında içeren ayrı şişeleri tutun.
3. Dikkatli bir şekilde temiz ve fibrotik ve dağlanmış bölümleri doku örneği laboratuarda doku çıkarma sonra geldiğinde % 70 etanol makas örnek aldım ve cımbız kullanarak kaldırın.
4. Yağ dokusu tartmak ve BT 5 g (veya daha az) aliquots collagenase sindirim için bölüm.
5. İnce iki çift makas kullanarak at 5 ml collagenase çözüm oda sıcaklığında bir mercek şişe içinde 5 g kıyma.
6. 15 mL toplam için kıyılmış doku için ek bir 10 mL collagenase çözeltisi ekleyin.
7. Sürekli titriyor ile bir su banyosu içinde 37 ° C'de 1 h için örnekleri sindirmek.
8. Künt bir son yapmak için bir 20 mL şırınga ihbar kesti.
9. 250 µm kafes üzerinden 9 cm x 9 cm kare şeklinde bir kesik ve künt son şırınga kullanarak 50 mL konik tüp yarıya kadar itin.
10. Örnekleri 20 mL künt son şırınga ve 250 µm naylon mesh adiposit ve stromal damar hücreleri sindirilmemiş dokusundan ayırmak için 50 mL konik tüp içine filtreden içine dökün.
    Not: mesh aşırı fibrotik sindirilmemiş malzeme nedeniyle tıkanmış olsun AT 5 g 50 mL konik Tüp, başına birden fazla kullanmayın.
11. KRBBS 10 mL ile mercek şişe dışarı yıkama ve kalan hücreleri toplamak için filtreden dök.
12. Filtre uygulanmış örnekleri, oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
    Not: Adipositler float tüp üstünde ve bazı stromal damar hücreleri tüpün dibinde yerleşmek için izin vermek bu adım önemlidir.
13. 20 mL şırınga ve bir 20 G x 6'pipetting iğne stromal vasküler kesir katmanı kaldırın ve temiz 50 mL konik tüp aktarmak için kullanmak.
14. KRBBS 10 mL ekleyin ve oda sıcaklığında 5 min için bankta oturmak örnekleri sağlar.
15. 2.12-2,14 adımları iki kez tekrarlayın.
    Not: Aşağıdaki adımları hiçbir kirlenme ile kayan adiposit stromal vasküler hücre olduğundan emin olun.
16. Aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi her iki depoları için daha fazla alay, buzda stromal vasküler kesirler tutmak.
    Not: Bu hücre canlılığı üzerinde bir etkiye sahip gibi hücreleri daha 1 h, buz üzerinde terk etmeyin. Adiposit deneyler için taze kullanılan ya da flash donmuş sıvı azot uzun süreli depolama için olabilir.

3. yağ dokusu endotel hücre izolasyon

1. 500 x g 4 ° C'de 5 min için de stromal vasküler kesirler (SVF) spin
2. Örnekler santrifüj kaldır ve dikkatle süpernatant dökün; SVF hücreleri içeren pelet tutun.
3. Yavaşça hücre topakları PBS 5 mL resuspend.
   Not: bir AT depo daha--dan 5 g (bkz. Adım 2.4) birden çok aliquots işlendiyse, hücre topakları birlikte havuz.
4. Örnekleri 500 x g 4 ° C'de 5 min için de spin
5. Süpernatant kaldırmak, PBS 1 mL hücrelerde resuspend ve hücreleri saymak.
   Not: Burada, bir otomatik hücre sayaç hücre sayımı için kullanıldı. Hücre canlılığı 12 µL hücre süspansiyon, akridin turuncu/propidium iyodür (AO/PI) çözümünü 12 µL ile karıştırılarak elde edildi ( Tablo malzemelerigörmek). Hücreleri her depo için at gram başına ortalama sayısı: (a) OM depo: 1,69 x 10⁵ ± 4.51 x 10⁴; (b) SC depo: 1,24 x 10⁵ ± 6.45 x 10⁴. Her iki depoları hücrelerden canlılığı yapıldı > % 90.
6. Örnekleri 500 x g 4 ° C'de 5 min için de cips
   Not: CD34 immunomagnetic seçim Protokolü ( Tablo malzemelerigörmek) adımlar için 3.7-3.15 uyarlanmıştır.
7. Pelet CD34 yalıtım arabellek 100 µL içinde resuspend.
   Not: Toplam hücre sayısı aşağıdaki re-süspansiyon birimleri gerektirir: (a) < 2 x 10⁷ hücreleri: Pelet 100 µL; resuspend (b) 2 x 10⁸–5 x 10⁸ hücreleri: pelet 1 mL resuspend. 3.9-3,16, adımda kullanılan reaktifler hacimleri için küçülttüm < 2 x 10⁷ hücreleri.
8. CD34 kokteyl 10 µL ekleyin ve 15 dakika oda sıcaklığında örnek kuluçkaya.
9. Manyetik boncuklar 5 µL ekleyin ve örnek oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
10. CD34 yalıtım arabellek 2.5 mL her örnek için ekleyin ve oda sıcaklığında 5 min için mıknatıs örnekleri yerleştirin.
11. Mıknatıs 5 için ters çevir'i s yalıtım tampon dökün.
12. Örnekler mıknatıs kaldırmak ve 3.10 ve 3,11 4 x arasındaki adımları yineleyin.
13. Tüp mıknatıs kaldır ve CD34 yalıtım arabellek 2 mL ekleyin.
14. Hücreleri 500 x g 4 ° C'de 5 min için de cips
15. Hücre topakları 1 mL CD34 yalıtım arabellek resuspend ve hücreleri saymak.
    Not: İşte, at gram başına ortalama sayısı: (a) OM depo: 4,75 x 10⁴ ± 3,36 x 10⁴; (b) SC depo: 1,06 x 10⁴ ± 9,53 x 10³. Bir CD31 plastik immunobead iletişim kuralı için adımları 3,16-3,34 ( Tablo malzemelerigörmek) uyarlanmıştır.
16. Hücreleri 500 x g 5 min için de cips ve Pelet arabellek b 250 µL ve yıkama arabelleği 250 µL'resuspend.
17. İyice CD31 boncuk vortexing tüp tarafından resuspend.
18. 20 µL CD31 boncuk ekleyin.
    Not: Toplam hücresini nedeniyle sayar > 1 x 10⁶, birimin üreticinin giriş göre küçültülmüş.
19. Oda sıcaklığında 30 dakika sallanan ile örnek kuluçkaya.
20. Bir süzgeç steril 50 mL konik tüp takın.
    Not: Süzgeç büyük açılış üstte olması gerekir.
21. Önce hücre ayırma, yıkama arabelleği süzgeç equilibrate 1 mL ekleyin. Süzgeç 3,16 adıma altında oluşturulan karışımı uygulamak.
22. Dairesel bir hareketle toplam hacmi 20 mL için süzgeç yıkama arabelleği 5 mL ile yıkayın. Bağlayıcı bir steril 50 mL konik tüp takmak ve radarı kilit kapatın.
23. Süzgeç konektöre takın. Yıkama arabellek süzgeç duvar boyunca 1 mL ekleyin. Süzgeç duvar boyunca aktif arabellek D 1 mL ekleyin. Örnek hafifçe girdap ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
24. Yıkama arabellek 1 mL ekleyin. Yukarı ve aşağı 10 x pipetting tarafından boncuk ayrı hücreler.
    Not: hava kabarcıkları oluşturulmasını engellemek.
25. Radarı-kilidi açmak ve 50 mL konik tüp içine akmaya müstakil hücreleri izin vermek. Süzgeç 10 yıkama yıkama arabelleği her zaman 1 mL x.
26. Bağlayıcı ve süzgeç atmak ve 300 x g 4 ° C'de 10 dakika için de örnekler santrifüj kapasitesi Hücre Pelet komple EGM-2 Medya kültürü için 2 ml resuspend.
    Not: Hücreler bu noktada at gram başına ortalama sayısıdır: (a) OM depo: 5.92 x 10³ ± 4.27 x 10³; (b) SC depo: 4.12 x 10³ ± 2.1 x 10³. Her iki depoları hücrelerden canlılığı üzerinde % 90 oldu.

4. indüksiyon Adipogenesis izole endotel hücrelerinde

1. 6-iyi doku kültürü tedavi plakaları hücrelerde bir 37 ° C'de % 5 CO₂ kuluçka komple EGM-2 medya ile büyümek. Ortamı her 3-4 hücreleri % 80 – 90 izdiham ulaşana kadar gün değiştirin.
   Not: 2-3 gün arasında nüfus katlama olduğunu.
2. 100 mm Petri yemekler üzerinde kaplama tarafından hücreleri genişletin ve 1:3 kez hücreleri bölme. Bu aşamada, geçiş 2 hücrelerdir.
3. (Bkz. Tablo reçetesi) otomatik bir hücre kullanarak hücreleri counter Count.
4. Tohum yaklaşık 100-200.000 hücrelere 6-şey plakaları her depo ve onları buna 2 gündür EGM-2 medya tamamlandı kültür için yinelenen wells sağlanması.
5. Aspire herhangi bir büyüme medya ve DMEM/F12 2 mL % 5 ile onun yerine FBS ve 50 µg/mL penisilin/streptomisin denetim için hücreleri ve 2 mL (bkz. Adım 1.4) Adipogenesis medya için tedavi hücreleri ile değiştirin.
6. Hücreleri oksijen %5 37 ° C'de kuluçkaya ilgili medya her 3-4 gün yerine CO₂ kuluçka 13 gündür.
   Not: Hücreleri tedavi 4 gün sonra lipidler toplamaya başlayacaktır.
7. ORO ve Nil yayınlanan yöntemleri^15-17göre boyama kırmızı yürütmek.
8. Bir RNA çıkarılması için hücreleri izole etmek için 6-iyi indüksiyon plakalar medyayı çıkarın ve 1 mL steril PBS ile yıkayın.
9. Guanidium thiocyanate-fenol-kloroform çözüm 350 µL ekleyin (her şey ve oda sıcaklığında 5-10 dk için kuluçkaya Malzemeler tablobkz:).
10. Hücreleri kullanarak bir hücre sıyırıcı plaka kapalı kazımak ve hücreleri bir 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.
    Not: Örnekleri RNA çıkarma ve daha sonraki bir tarihte işlenmesi için-80 ° C dondurucuda saklanabilir.
11. MRNA adapte bir RNA ayıklama kullanarak örnekleri ayıklamak ( Tablo malzemelerigörmek) protokol.
12. Bir gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) gen ifade aşağıdaki problar kullanarak değerlendirmek için gerçekleştirmek: adiponektin, UCP-1 ve CIDEA (bkz: Malzemeler tablo).
    Not: Burada, RT-PCR yordamlar aşağıdaki standart protokolü kullanılarak yapılmıştır: denatürasyon (95 ° C; 15 s), tavlama ve uzantısı (60 ° C; 1 dk) 40 döngüleri için. C_T değerleri ile gen ifade örnekleri > 35 belirlenemeyen kabul.

Sonuçlar

Bizim iletişim kuralı CD34 + CD31 + insan yağ dokusunun farklı depoları damar hücreleri Adipojenik potansiyelini belirlemek için bir vitro yaklaşım sunmayı amaçlamaktadır. Basitleştirilmiş akış diyagramı Şekil 1Aile gösterilir. CD34 hücreleri ifade olumlu bir seçim kullanarak ilk adım > %95 CD34 + hücre nüfus taze izole hücre (Şekil 1A) sonuçlanır. Önemlisi, bu işareti hücreleri birkaç pas...

Tartışmalar

Yalıtım, genişleme ve Adipojenik indüksiyon CD34 + CD31 + visseral ve subkutan depoları insan yağ dokusunun endotel hücrelerden bir metodoloji sağlamak için bu kağıt odak noktasıdır.

Metodolojisi kemirgenler veya öncelikle teknikleri fluorescently etiketli veya manyetik boncuklar-^18, birleştiğinde CD31 antikorları kullanarak dahil insanlar çeşitli vasküler yatak endotel hücrelerinin yalıtım için bildirilmiştir ¹⁹

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Large Equipment
Biosafety Cabinet	Nuaire	nu-425-400
Cell Culture Incubator	Thermo-Fisher Scientific	800 DH
Water Bath	Forma Scientific	2568	Reciprocal Shaker
RT-PCR Machine	BIO-RAD	CFX96-C1000
Electrophoresis Box	BIO-RAD	Mini PROTEAN 3 Cell
Transblot Box	BIO-RAD	Mini Trans-Blot Cell
Electrophoresis Power Supply	BIO-RAD	PowerPac Basic
ELISA Reader	Molecular Devices	SpectraMax M5
Blot Reader	LI-COR	Odyssey	Near Infrared
Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Tabletop Centrifuge	Eppendorf	MiniSpin Plus
Fluorescent Microscope	Olympus	BX50
Inverted Microscope	Nikon	TMS
KRBSS Buffer
HEPES	Research Products International	H75030
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	792519
Calcium chloride dihydrate	Sigma-Aldrich	C7902
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P5655
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	746398
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma-Aldrich	S9638
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P9333
Glucose	Acros Organics	410950010
Adenosine	Acros Organics	164040250
Bovine Serum Albumin	GE Healthcare Bio-Sciences	SH30574.02
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher Scientific	15070063
Tissue Digestion
20 mL Syringe	Global Medical	67-2020
Nylon Mesh, 250 µm	Sefar	03-250/50
Pipetting Needles	Popper	7934
Fine Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Tissue Forceps	George Tiemann & Co	160-20
Collagenase, Type I	Worthington Biochemical	LS004196
Petri Dishes, 100 mm	USA Scientific	5666-4160	TC Treated
Eppendorf Tubes, 1.5 mL	USA Scientific	1615-5500
Conical Tubes, 15 mL	Nest Scientific	601052
Conical Tubes, 50 mL	Nalgene	3119-0050
Scintillation Vials	Kimble	74505-20	Tissue Dicing
Cell Isolation
Cellometer	Nexcelom	Auto 2000
Cellometer Slides	Nexcelom	CHT4-SD100-002
Cellometer Viability Stain	Nexcelom	CS2-0106-5mL	Acridine Orange/Propidium Iodine
Anti-CD34 Magnetic Beads	StemCell Technologies	18056	Kit
EasySep Magnet	StemCell Technologies	18000
Anti-CD31 Plastic Beads	pluriSelect USA	19-03100-10
pluriSelect 10x Wash Buffer	pluriSelect USA	60-00080-10
pluriSelect Connector Ring	pluriSelect USA	41-50000-03
pluriSelect Detachment Buffer	pluriSelect USA	60-00046-12
pluriSelect Incubation Buffer	pluriSelect USA	60-00060-12
pluriSelect S Cell Strainer	pluriSelect USA	43-50030-03
Cell Culture
6-well Plates	USA Scientific	CC7682-7506	TC Treated
4-well chambered slides	Corning Life Sciences	354559	Fibronectin coated
4-well chambered slides	Thermo-Fisher Scientific	154526PK	Uncoated glass
Human Adipose Microvascular Endothelial Cells (HAMVEC)	Sciencell Research Laboratories	7200	Primary cell line
Endothelial Cell Media (ECM)	ScienCell Research Laboratories	1001	Complete Kit
DMEM/F12 Basal Media	Thermo-Fisher Scientific	11320082
Fetal Bovine Serum (FBS)	Rocky Mountain Biologicals	FBS-BBT
Insulin	Lilly	U-100	Humalog
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
Cell Analysis
Oil Red O Dye	Sigma-Aldrich	O0625	Prepared in isopropanol
96 well plates	USA Scientific	1837-9600
96 well PCR plates	Genesee Scientific	24-300
RNA Extraction	Zymo Research	R2072	Kit
cDNA Synthesis	BIO-RAD	1708841	Supermix
JumpStart PCR Polymerase	Sigma-Aldrich	D9307-250UN	Hot start, with PCR Buffer N
Magnesium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	M8787-5ML	3 mM final in PCR reaction
dNTPs	Promega	U1515
TaqMan AdipoQ	Thermo-Fisher Scientific	Hs00605917_m1
TaqMan CIDEA	Thermo-Fisher Scientific	Hs00154455_m1
TaqMan RPL27	Thermo-Fisher Scientific	Hs03044961_g1
TaqMan UCP1	Thermo-Fisher Scientific	Hs00222453_m1
BCA Assay	Sigma-Aldrich	QPBCA-1KT	Kit
Bis-acrylamide	BIO-RAD	1610146	40% stock solution
Ammonium Persulfate	BIO-RAD	1610700
TEMED	BIO-RAD	1610800
Tris	Sigma-Aldrich	T1503
Glycine	BIO-RAD	1610718
Sodium Dodecal Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
EDTA	Fisher Scientific	S311-100
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B8026
Blot Membrane	EMD Millipore	IPFL00010
Methanol	Fisher Scientific	A452-SK4
Odyssey Blocking Buffer, Tris	LI-COR	927-50000
Anti-AKT antibody	Cell Signaling Technology	2920S	Mouse monoclonal
Anti-pAKT antibody	Cell Signaling Technology	9271S	Rabbit polyclonal
Anti-UCP1 antibody	Abcam	ab10983	Rabbit polyclonal
Anti-Mouse IgG antibody	LI-COR	926-68070	Goat Polyclonal, IRDye 680RD
Anti-Rabbit IgG antibody	LI-COR	926-32211	Goat Polyclonal, IRDye 800CW
Anti-Rabbit IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	111-025-003	Goat Polyclonal, TRITC
Phosphate Buffer Saline	Thermo-Fisher Scientific	10010049
37% Formaldehyde Solution	Electron Microscopy Sciences	15686	4% solution for cell fixation
Normal Goat Serum	Vector Laboratories	S-1000	10% blocking solution
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X-100	0.1% permeabilization solution
DAPI	Thermo-Fisher Scientific	D1306
Calcein AM	Thermo-Fisher Scientific	65-0853-39	Cell fluorescent visualization
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning Life Sciences	356231	Growth factor reduced
DiI labeled Acetylated LDL	Thermo-Fisher Scientific	L3484