Amip kullanarak bir yansıma tabanlı hızlı bakteriyel virülans tahlil

Özet

Burada, D. discoideum (amip) ana bilgisayar olarak kullanarak planktonik veya yüzey bağlı bakterilerin virülans ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Virülans bir 1 saat boyunca ölçülür ve öldürme ana bilgisayar floresans mikroskobu ve görüntü analizi ile sayılabilir. Biz bakteri P. aeruginosabu iletişim kuralı'nı göstermek.

Özet

Geleneksel bakteriyel virülans deneyleri konak hücreleri için birkaç saat boyunca uzun süre maruz bakteri içerir. Bu süre içinde bakteri fizyolojisi ana büyüme ortamı maruz ve konak hücreleri varlığı nedeniyle değişiklikleri uygulayabilir. Biz hızla hangi bakteri varlığında konak hücreleri büyümek ölçüde en aza indirmek bakteri virülans durumunu ölçmek için bir tahlil geliştirilmiştir. Bakteri ve amip birlikte karışık ve agar panelini kullanma tek bir görüntüleme uçağı üzerinde immobilize. Yordam tek hücreli floresans görüntüleme (calcein-AM) calcein-acetoxymethyl ester ile konak hücre sağlık bir göstergesi olarak kullanır. Konak hücreleri floresan 1s epifluorescence mikroskobu kullanılarak bakteri konak hücre maruz sonra analiz edilir. Görüntü analiz yazılımı bir ana bilgisayar öldürme Dizin hesaplamak için kullanılır. Bu yöntem virülans planktonik ve yüzey bağlı Pseudomonas aeruginosa içinde ölçmek için kullanılan ilk aşamasında alt nüfus biyofilm oluşumu ve diğer bakteri ve diğer aşamaları biyofilm büyüme için adapte edilebilir. Bu iletişim kuralı virülans ölçmenin hızlı ve sağlam bir yöntem sağlar ve büyüme ve bakım memeli hücre hatları ile ilgili karmaşıklığı çoğunu önler. Burada amip kullanarak ölçülen virülans fenotipleri da fare makrofajlar kullanarak doğrulanmış. Özellikle, bu tahlil bu yüzey ek upregulates virülans P. aeruginosaiçinde kurmak için kullanıldı.

Giriş

Bakteriyel enfeksiyon, insan ve hayvan^1,2' deki ölümlerin önde gelen nedenlerinden biridir. Sağlık ve araştırma ayarlarında önemli virülans bakteri kültürleri veya biyofilmler ölçmek için yeteneğidir. Burada, bakteriyel virülans ölçmek için çok yönlü, hızlı ve nispeten basit bir yöntem açıklanmaktadır. Ökaryotik organizma Dictyostelium discoideum (amip) modeli ana bilgisayar organizma olarak kullanılır. D. discoideum virülans faktörleri Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)^3,4,5 ve diğer bakteriler^{6,7 tanımlamak için ana bilgisayar olarak kullanılmıştır ,8} ve tip III salgı^9,10da dahil olmak üzere memeli hücreleri öldürmek büyük ölçüde aynı virülans faktörleri için açıktır. D. discoideum kullanarak önceki virülans deneyleri bakteri D. discoideum hücreleri ile uzun süre maruz saat^3,4,5boyunca işe. İletişim kuralı, burada, bu amip kullanarak virülans belirleme hızlı bir yöntem sunuyor. Bu iletişim kuralı (Şekil 1) açıklar nasıl yapılır: (1) axenically (içinde bakteri yokluğu) amip büyümek, (2) bakteri tahlil için büyümek, (3) bakteri hazırlamak ve konak hücreleri mikroskobu, (4) için epifluorescence mikroskobu gerçekleştirmek ve analiz (5) amip Floresan.

Amip başlangıçta donmuş stokları çizgili ve nerede amip Sporlar üretmek Escherichia coli (e.coli), çim üzerinde büyüdü. Bu sporlar aldı ve axenic büyüme için zenginleştirilmiş bir orta içine aşılandı. Bakteriyel virülans değerlendirilmesi için bakteri ile karışık olması hazır olana amip besin açısından zengin koşullarında axenic büyüme ile korunur. Hayatta kalma ya da amip ölümü, calcein-acetoxymethyl (calcein-AM), hücre içi esterazlar tarafından i ciddi ve, böylece, floresans^11,12için aktif floresans ölçerek sayılabilir. Canlı amip vurguladı ise az veya hiç floresans sergi ve yoğun bir şekilde ölen hücreleri bulabilsem. Calcein-AM sağlıklı amip ve birleşme içine çok az veya hiç birleşme ve stresli amip¹³' te substrat bölünme nedeniyle sonucudur. Bu davranış özellikle calcein-AM floresans memeli hücreleri^11,14,15,16ayrıdır.

Virülans için değerlendirilecektir bakteri ayrı olarak yetiştirilmektedir. Burada, P. aeruginosa fırsatçı patojen virülans ölçmek ve ayrıntılı nasıl virülans planktonik (yüzme) ve yüzey bağlı alt nüfus ölçmek için nasıl açıklar. Bu iletişim kuralı diğer bakteri virülans sınamak için adapte olabilir. Temsilcisi sonuçları bölümünde gösterdiğimiz virülans yüzey bağlı hücrelerde aktif ve planktonik hücrelerde, düşük olduğu daha önce¹³bildirdi. Öldürücü olmayan planktonik hücreleri amip tarafından tüketilen iken yüzey bağlı P. aeruginosa virülans-harekete geçirmek amipler öldürür. Planktonik bakteri virülans yalnızca denetlesinler, bakteri Petri yemekler iletişim kuralında açıklandığı gibi kullanarak yerine sıradan Kültür tüpleri kültürlü olabilir.

Öyle ki kararlı duruma besin açısından zengin koşullarında, amip büyümeye ederken P. aeruginosa kültürler ve hedeflenen büyüme aşamasında ulaşmak, amip ve P. aeruginosa kültürler koordine edilmelidir. Bu durum genellikle amip kültürler bakterilerle karışınca en az 1 gün önce seyreltilmiş gerekir. Amip ve bakteri agar pedleri kullanarak immobilize, Co için 1 saat inkübe ve düşük çözünürlüklü (10 X, sayısal diyafram 0,3) objektif, yeşil floresans protein (GFP) filtre uygular ve görüntüleme bir kamera kullanarak yansıma. Analizi serbestçe kullanılabilir ImageJ yazılım kullanılarak gerçekleştirilebilir veya görüntü analiz yazılımı özelleştirilebilir. Bizim analiz bilimsel analiz paketi¹³kullanılarak yazılmış kendi yazılımını kullanarak gerçekleştirildi. Yazılım faz kontrast görüntü kullanarak maske oluşturmak ve floresan görüntünün maskelenmiş alanlar floresans değerleri ayıklamak gerekir. Floresans değerler bir sayısal ana bilgisayar öldürme dizininde kaynaklanan en az 100 hücreleri üzerinde ortalama.

Protokol

Tüm deneysel prosedürler University of California, Irvine gerçekleştirilmiştir.

1. arabellekleri ve çözümleri

1. Lysogeny suyu (LB) 1 L cam şişede 1 litre çift distile su (GKD₂O) 25 g LB-Miller karışımı ekleyerek hazırlayın. Petri yemekler için agar bir ek 20 g ekleyin. Sterilize etmek için basınçlı kap. Erimiş agar orta 25 mL 10 cm-çap Petri yemekleri dökün ve oda sıcaklığında kuvvetlendirmek için izin verir. Oda sıcaklığında sıvı medya ve ağar kaplamalar 4 ° C'de depolayın
2. D-glikoz 1 gr karıştırılarak bir 1 L cam şişe glikoz Maya pepton (saçma) levha hazırlamak, pepton, Maya 0, 25 g, 2 g özü, KH₂PO₄4.2 g, Na₂HPO₄7 H₂O 5,1 g ve agar GKD₂ 1 L 25 g O. otoklav sterilize etmek için. Erimiş agar 25 mL 10 cm-çap Petri yemekleri dökün ve oda sıcaklığında kuvvetlendirmek için izin verir. 4 ° C'de mağaza
3. 10 g pepton karıştırarak 1 L cam şişe pepton S (PS) ortamda hazırlamak, 7 gr maya ekstresi, 15 g D-glikoz, 0,12 g Na₂HPO₄7 H₂O, KH₂PO₄1.4 g, vitamin B₁₂ 40 µg , ve 80 µg GKD₂O. 800 mL folik asit pH metre bir gün içinde kullanılmamış olan pH 4 ve pH 7 standartları kullanarak bir elektronik pH metre kalibre.
   1. PH metre kullanarak PS orta pH ölçmek. 5 M KOH ya 5 M H₃PO₄ pH 6.5 ayarlamak için ekleyin. 1 m'ye son ses seviyesini GKD₂O. filtre kullanarak 0,22 µm vakum filtre kullanılarak sterilize ve depolamak 4 ° C'de
      Not: koruyucu ekipman eldiven, koruyucu giysiler, göz koruma da dahil olmak üzere giyerek pH ayarlamaları ile dikkatli bir şekilde sürdürmek ve koruma yüz.
4. 10 x geliştirme arabellek Prime hazırlamak (DB') arabellek KH₂PO₄, 13.4 g Na₂HPO₄ 7 H₂O, GKD₂O 3.4 g 800 mL toplam bir birime ekleyerek bir 1 L cam şişede. PH metre bir gün içinde kullanılmamış olan pH 4 ve pH 7 standartları kullanarak bir elektronik pH metre kalibre.
   1. Elektronik pH metre kullanarak arabellek pH ölçmek. PH 6.5 yavaşça 5 M KOH veya gerektiği gibi 5 M H₃PO₄ ekleyerek ayarlayın. 1 GKD₂O kullanarak L için son ses seviyesini ve ısıyla tarafından sterilize. Oda sıcaklığında saklayın.
      Not: koruyucu ekipman eldiven, koruyucu giysiler, göz koruma da dahil olmak üzere giyerek pH ayarlamaları ile dikkatli bir şekilde sürdürmek ve koruma yüz.
5. 1 x geliştirme arabellek (DB) 100 mL 10 karıştırılarak olun DB x' arabellek ile 1 mL steril 2 M MgCl₂ve 1 mL steril 1 M CaCl₂. Bir autoclaved sterilize GKD₂O. mağaza oda sıcaklığında kullanarak 1 L cam şişede 1 m'ye son ses düzeyini ayarlayın.
6. PS:DB orta bir 1 L cam şişe 100 mL steril PS orta karıştırılarak hazır ol, 100 mL steril 10 DB x' tampon ve steril GKD₂O birime bir toplam 1 L. ek ile 1 mL steril 2 M MgCl₂ ve 1 mL steril 1 M CaCl ₂. 4 ° C'de mağaza
7. Calcein-AM hisse senedi çözüm calcein-AM üretici tarafından sağlanan plastik kap içinde 50 µg DMSO 50 µL ekleyerek hazırlayın. -20 ° C'de mağaza

2. büyüme ve amip Bakımı

1. E. coli zorlanma B/r¹⁷ amip için bir besin kaynağı olarak ilk büyüme döneminde büyümek. Çizgi E. coli B/r donmuş bir stoktan bir LB agar plaka üzerine-80 ° C'de depolanan ve 37 ° tek kolonileri elde etmek için C bir gecede kuluçkaya.
2. E. coli B/r bir koloni 2 mL LB orta içine aşılamak ve bir rulo davul veya bir shaker 37 ° C'de gecede kuluçkaya.
3. Gecede E. coli kültür oda sıcaklığına getirmek. Tahta bir sopa kullanarak, amip gecede kültür 750 µL-80 ° C'de tutulan bir donmuş stoktan aşılamak.
   Not: axenic büyüme¹⁸yeteneğine sahip olan kullanım D. discoideum gerilme AX3. Axenic büyüme bu adım gerekli değildir, ancak sonraki adımları onun gereksinimi olacaktır.
4. Hemen 700 µL amip -E. coli karışımdan bir glikoz Maya pepton (saçma) plaka üzerine ekleyin. Kültür plaka yüzeyine eşit olarak ileri geri ve yan-yan gerektiği gibi eğerek yayıldı. Bir dağıtıcı kullanmaktan kaçının.
5. DOLANDIRMAK plaka agar yüksek nem korur bir kutu içinde yukarı dönük olacak şekilde yerleştirin. İki tek kullanımlık plastik kaplar kullanın (183 cm x 183 cm x 91 cm) birbiri üstüne yığılmış. Alt kapsayıcı yaklaşık 25 mL su doldurun ve nem su deposu üst kapsayıcıya taşımak izin vermek için kapsayıcı döşeme ile delinmiş birkaç 0.5 cm çapında delik top konteyner yerleştirin.
6. Kuluçkaya DOLANDIRMAK plaka ve kutusu 22 ° c 4-5 gün kadar amip Sporlar (Şekil 2) plaka yüzey büyüyen gözlenir. Soğutmalı inkübatör kuluçka oda sıcaklığında yerine tabak kuluçkaya için kullanın.
   Not: Sporlar büyüdü sonra 4 ° C'de saklandığında uygun birkaç hafta plakalar üzerinde kalırlar Tabakları agar yüzü yukarı bakacak şekilde depolar. 3-4 gün sonra kuluçka, bölgelerini Temizleme bakteriyel çim içinde da amip sporulation başlangıcı gösteriyor görülebilmektedir.
   1. Küçük amip Sporlar plaka yüzeyi yukarıda kuluçka (Şekil 2) 4-5 gün sonra gözlemlemek.
      Not: Bu süre Sporlar kalitesini düşürür gibi amip bir haftadan uzun büyümek değil.
7. Amip Sporlar steril 1 mL pipet ucu plaka yüzeyine paralel süpürme tarafından amip axenic büyümesi için hazırlamak için toplamak. Sporlar 10 cm Petri kabına yarısı toplamak.
   Not: Bu hareket çok sayıda E. colitopladıkça ucunu agar plaka yüzeyine dokunmaktan kaçının.
8. Amip pipet ucu ucunu PS orta 1 mL çeker ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetting resuspend.
9. İnoculated karışımı 0,25 x konsantrasyon, antibiyotik antimycotic çözüm ile takıma PS orta 25 mL içeren bir 250 mL şişe içine aktarın.
   Not:-20 ° C'de 250 µL aliquots olarak antibiyotik antimycotic çözüm saklamak Bu onun etkinliğini azaltabilir gibi bu çözümü dondurma ve çözme yinelenen döngüleri kaçının.
10. Amip axenically 22 ° C'de 100 rpm'de dönen bir shaker büyümek. Adım 5'te virülans tahlil için 600 ölçülen bir optik yoğunluk için hücrelerin büyümesine nm (OD₆₀₀) 0,2-0,5.
    Not: 3-4 gün büyüme aşılama (adım 2.7) zaman bu adımı gerektirir. Hücreler için yüksek yoğunluklu büyüdü Eğer PS orta bir OD₆₀₀ 0,05 veya daha düşük olarak geri kültüründe sulandırmak ve geri bir OD₆₀₀ 0,2-0,5 için büyür.

3. P. aeruginosa büyüme

1. P. aeruginosa bir koloni bir LB plaka almak, 2 mL PS:DB kültür aşılamak ve 37 ° C'de doygunluk için bir gecede büyümek.
   Not: antibiyotik antimycotic çözüm PS:DB ortama eklemeyin.
2. 1 gecede kültür: 100 veya 1:1,000 6 cm-çap Petri kabına PS:DB kullanarak oranında seyreltin. Planktonik hücre virülans yalnızca denetlesinler Eğer geleneksel Kültür tüpleri yerine kullanmayı kültürler büyümek. 37 ° C'de 100 RPM ayarla benchtop rotator Tarih kültür sallamak
3. Hasat kültürleri tekrarlanabilirlik emin olmak için zaman belirli noktalarda. Virülans değerlendirilmesi önce 1 saat 30 dk 4 bölümünde açıklandığı gibi bir agar pad hazırlayın.
   Not: P. aeruginosa virülans yaklaşık 8 h büyüme yüzeylerde tarafından indüklenen.
4. Yüzey bağlı hücreleri izole etmek için sıvı orta Petri kabına kaldırmak, hemen DB arabellek planktonik hücreleri kaldırmak için 1 mL ile yıkayın ve hemen 5.1 adıma geçin.
   Dikkat: 30'dan daha uzun yıkama yok s olarak bu huzursuz ve hücre yüzey bağlı bağlantısını kesin ve virülans ölçüm etkileyebilir.
5. Planktonik hücreleri izole etmek için kültür 10 µL Petri kabına temiz bir Petri kabına aktarmak ve hemen 5.1 adıma geçin.

4. mikroskobu - Agar Pad hazırlanması

1. Amip P. aeruginosaile karışık olması hazır önce agar yastıkları yaklaşık 30 dk 1 h için hazır olun.
2. Mikrodalga bir 250 mL şişe arabellekte DB %1 (w/v) agar 50 mL. Mix her 20 s agar kümeleri kadar yok.
3. Erimiş agar 15 dakika önceden ısıtılmış 55 ° C su banyosunda yerleştirerek serin.
4. Calcein-AM hisse senedi çözüm 15 µL 15 mL konik tüp içinde erimiş agar ekleyin. Yavaşça tüp 4 - 5 kez ters çevirme tarafından karıştırın ve hemen sonraki adıma geçin.
   Not: bir polipropilen 15 mL santrifüj tüpü bu adımı gerçekleştirin. Bu çok hızlı bir şekilde katılaşmaya agar neden olur kalın cam kaba kullanmayın.
5. 12 cm x 10 cm cam levha üzerine erimiş agar karışımı dökün ve oda sıcaklığında 10 dakika katılaşmaya agar sağlar. Katılaşmış agar yastık daha küçük 1,5 cm x 1,5 cm bölümlere cam levha Yazdırılan kılavuz yerleştirme ve kesme metal cetvel kullanarak kılavuzu boyunca kesilmiş.
6. Kullanıma hazır olması ne kadar nemli bir kutu içinde sulu jel tutmak.

5. mikroskobu - bakteri-amip örnek hazırlanması için görüntüleme

1. Bakteri hücreleri yüzeye bağlı virülans tahlil için amip hücre 10 µL 2.10 adımından yüzey bağlı bakterilerden adım 3.4 ekleyin.
   Not: Amip bakteri ile karıştırma bu adımı açıklamaktadır.
2. Planktonik hücre virülans tahlil için adım 3.5 planktonik bakterilerin 10 µL adım 2.10 amip hücre 10 µL karıştırın.
   Not: bakteri ile karıştırma önce axenically yetiştirilen amip hücreleri (adlı bir OD₆₀₀ 0,2-0,5) yıkama yok. Antibiyotik antimycotic çözüm kullanımı nedeniyle amip kültüründe yok E. coli büyüme gözlenir.
3. Derhal 1,5 cm x 1,5 cm calcein-AM agar pad adım 4.5 bakteri-amip karışımı üzerine Petri kabına zemine yerleştirin.
   Not: agar pad hızlı bir yumuşak hareket kullanarak karışımı üzerine yerleştirin. Panelindeki karışım üzerine yavaş yavaş olarak bu hareket çevre doğru ve uzak alt Pad hücreleri itmek eğilimi daha düşük değil. Bu adımı bakteri ve amip eşit olduğundan emin olun karışık, immobilize ve her iki tip hücre aynı uçağa sınırlı.
4. Aşırı sıvı yavaşça agar pad çevreleyen kalan herhangi bir sıvı pipetting tarafından kaldırın. Petri kabına oda sıcaklığında 20 dakika kurumasını sağlar.
5. Bir kapak ile Petri dish ile kapak ve immobilize amip-bakteri karışımı bir ek 40 dk. Proceed adım 6.1 için oda sıcaklığında kuluçkaya.
   Not: Tüm örneklerini zaman içinde arka plan floresans arttıkça aynı süre için kuluçkaya önemlidir. 1 h bir kuluçka süresi önerilir. İncubations 1 saat daha uzun süre amip hücreleri patlamaya başlayabilir daha az tekrarlanabilir.

6. mikroskobu - resim alma

1. Aydınlık alan ve yeşil floresans görüntüleri alma yeteneğine sahip bir floresan mikroskop kullanarak görüntü amipler. Yeşil floresan için yeşil floresans protein (GFP) filtreleri 474/27 ile nm ve 525/45 nm uyarma ve emisyon, anılan sıraya göre. Amip görüntü için bir 10 X (≥0.3 sayısal diyafram) hedefi kullanın.
   Not: Calcein-AM agar yeşil floresans kanalda floresan için ölen amip neden olur. Sağlıklı amip Aksi takdirde floresan değildir.
2. Edinme kez GFP kanalları fototoksisite sınırlamak ve dinamik alan görüntü yoğunluklarını optimize faz kontrast için ayarlayın. Fark girişim kontrast (DIC) faz kontrast yerine.
   Not: 100-200 ms Etkilenmeler faz kontrast ve GFP floresan için mümkünse kullanın. Tüm deney boyunca değişmeden pozlama ve enstrüman ayarlarını almak. Bu ana bilgisayar öldürme dizin bilgi işlem için önemlidir.
3. Öldürme Dizin ana hesaplamak için iyi istatistikler elde etmek için en az 100 amip hücreler için görüntüleri elde.

7. görüntü analizi ve ana bilgisayar öldürme Dizin

1. ImageJ kullanarak görüntü analizi gerçekleştirin.
2. Faz kontrast görüntü dosyası içinde ImageJ Dosya açmak | Açık ve görüntüsü seçin. Görüntü tıklayarak eşik ayarlamak | Analiz | Eşik. Sadece yoğunluğu tepe (Şekil 3A) seçmek için alt ve üst eşik ayarlayın.
3. İşlemi tıklatarak görüntü ikiliye dönüştürme | İkili | İkili yapmak. İşlemi seçerek delikleri | İkili | Delikleri.
   Not: görüntü kaynağı olarak Şekil 1 ' de kullanarak adımları 7.1-7,2 amip ve bakteri yüzey bağlı karanlık bölgeleri (Şekil 3B) görünür bir resim üretecek.
4. Analiz alan ve gri değeri demek kutularını işaretli olduğundan emin olun | Ayarla ölçümleri. Ana araç çubuğunda oval aracını seçerek amip yaklaşık boyutunu ölçmek. Tıklayın analiz | Ölçü ve temsilcisi amip alanını not edin.
5. Analiz tıklatarak amip için maske oluşturun | Parçacıklar analiz. Boyut kutusunda, amip içerir ancak bakterileri dışarıda alanı girin. Maskeler aşağı açılan menü çubuğunda göster seçeneğiiçin'i seçin. Yöneticisine Ekle kutusunun işaretli olduğundan emin olun.
6. Tıkırtı OK ve sadece amip ve bir yatırım getirisi Yöneticisi iletişim kutusu (Şekil 3C) gözükür gösteren bir resim.
7. Floresan görüntü kullanarak dosyasını açın | Açık ve uygun dosyayı seçerek. Tüm bölgelerin üst karakter tuşunu basılı tutarak ve tıklamak (Şekil 3D) listesindeki her bölgesindeki ROI Yöneticisi'ni seçin.
8. ROI Yöneticisi ölçü birimi düğmesini tıklatın. Bu-ecek açık her amip ortalama yoğunluk değerini görüntüleyen bir sonuçlar pencere.
9. Floresans değerleri her amip için bir elektronik tablo programına kopyalama ve dizin tüm floresans değerlerin ortalamasını alarak öldürmek ana hesaplar.

Sonuçlar

Vahşi-türü büyüdük ya da P. aeruginosa süzün PA14¹⁹ ΔlasR ²⁰ 6 cm çapında Petri yemeklerinde aynı PA14 planda strain ve virülans planktonik ve yüzey bağlı hücre denetlesinler. Kültürler tek-kolonileri PS:DB kültürleri, gecede bir rulo davul 37 ° C'de tüplerde kültür ile doygunluğu yetiştirilen içine aşılanmış, 1: 100 PS:DB, 6 cm çapında Petri yemeklerinde 100 devir / dakikada sallayarak 8 h...

Tartışmalar

Bu iletişim kuralı virülans P. aeruginosaiçinde tahlil hızlı ve nicel yöntemi açıklanır. Bu iletişim kuralı ile diğer bakteri test edilebilir. Ancak, büyüme orta amip büyüme koşulları ile uyumlu olması gerektiğini akılda tutmak önemlidir. Özellikle, PS:DB bakteriyel büyüme aracı olarak kullanan Protokolü optimize. Diğer medya kullanılması halinde, hiçbir bakteri hücreleri orta amip ile uyumlu olduğunu doğrulamak için mevcut olan bir büyüme sadece medya denetimi gerçekleşti...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Bacto agar, dehydrated	BD Difco	214010
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Life Technologies	15240062	Aliquot < 1 mL and store at -20 °C
Calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM)	Life Technologies	C34852	Calcein Acetoxymethyl (AM)
Calcium chloride, anhydrous	Sigma-Aldrich	C1016
D-Glucose	Fisher Chemical	D16500	Dextrose
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D5879
Folic acid	Sigma-Aldrich	F8758
LB-Miller	BD Difco	244620
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Yeast extract	Oxoid	LP0021
Special peptone	Oxoid	LP0072
Potassium hyroxide	Fisher Chemical	P250
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	P0662
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Fisher Chemical	S373
Vitamin B12	Sigma-Aldrich	V2876
Strains
Dictyostelium discoideum	Siryaporn lab	Strain AX318
Escherichia coli	Siryaporn lab	Strain B/r17
Pseudomonas aeruginosa	Siryaporn lab	PA14	PA14 strain19
Pseudomonas aeruginosa ΔlasR	Siryaporn lab	AFS20.1	PA14-derived strain20
Supplies
0.22 µm filter	Millipore	SCGPT01RE	For filter sterilization
Conical tube, 15 mL	Corning	352097
Glass storage bottles	Pyrex	13951L	250 mL, 500 mL, 1000 mL
Petri dish, 6 cm diameter	Corning	351007	60 x 15 mm polystyrene plates
Petri dish, 10 cm diameter	Fisher	FB0875712	100 x 15 mm polystyrene plates
Plastic containers with lid	Ziploc	2.57E+09	Square 3-cup containers
Glass plates	Bio-Rad	1653308	For preparing agar pads. Other glass plates may be used with similar dimensions.
Wooden sticks	Fisher	23-400-102
Equipment
Eclipse Ti-E microscope	Nikon	MEA53100	Microscope setup
10X Plan Fluor Ph1 objective  0.3 NA	Nikon	MRH20101	Microscope setup
Fluorescence excitation source	Lumencor	Sola light engine	Microscope setup
Fluorescence filter set	Semrock	LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000	Microscope setup
Orca Flash 4.0 V2 Camera	Hamamatsu	77054098	Microscope setup
ImageJ	NIH	v. 1.49	Software for image analysis
MATLAB	Mathworks	R2013	Software for image analysis
Orbital shaker incubator	VWR	89032-092	For growth of bacteria at 37 °C
Platform shaker	Fisher	13-687-700	For growth of amoebae at 22 °C
Spectrophotometer	Biochrom	Ultrospec 10
Undercounter refrigerated incubator	Fisher	97990E	For growth of amoebae at 22 °C
Isotemp waterbath	Fisher	15-462-21Q	For cooling media to 55 °C