Nerede konularda kesme: Bir diseksiyon ve fare Retina mekansal oryantasyon analiz Rehber'den oküler yerler

Özet

Bu iletişim kuralı derin oküler yerler, s-opsin immünhistokimya, Retistruct ve özel kod doğru ve güvenilir bir şekilde izole fare retina anatomik uzayda yönlendirmek için kullanımı için kapsamlı bir diseksiyon ve analiz rehber sağlar.

Özet

Boyutu degradeler Retina hücre tiplerinin ve yoğunluk analizi de dahil olmak üzere görsel neuroscience, birçok çalışma için önemli doğru ve güvenilir bir şekilde izole fare retina kayma yönünü belirleme yön yön-seçmeli olarak ayarlama ganglion hücrelerinin ve topografik dejenerasyon desenleri bazı retina hastalıkları olarak muayene. Ancak, tanımlamak ve fare retina Retina yönde etiketlemek için kullanılan literatürde bildirilen birçok farklı oküler diseksiyon yöntemleri vardır. Bu tür çalışmalarda kullanılan yönlendirme yöntemi genellikle gözardı edilir iken değil raporlama nasıl Retina yönlendirme belirlenir tutarsızlıkları edebiyat ve karışıklık çalışmalar arasında verileri karşılaştırmak çalışırken neden olabilir. Kornea yanığı gibi yüzeysel oküler simge yapılara sık kullanılan ama son zamanlarda rektus kasları, choroid çatlak veya s-opsin gradyan gibi daha derin yerler daha az güvenilir olduğu gösterilmiştir. Burada, kapsamlı bir rehber için doğru bir şekilde incelemek ve bir izole fare retina kayma yönünü belgelemek için derin oküler yerlerinden kullanımını sağlamak. Ayrıca iki s-opsin antikorların etkinliği karşılaştırıldığında ve s-opsin immünhistokimya için bir protokol dahil. Retina göre s-opsin degradenin yönünü Retistruct yazılımı ile retina yeniden yapılanma ve özel kod ile dönme gerektirdiğinden, biz hem bu programları kullanmak için gereken önemli adımlar sundu. Genel olarak, bu iletişim kuralının amacı güvenilir ve yinelenebilir bir dizi yöntem en deneysel protokoller için uyarlanabilir doğru Retina yönlendirme için teslim etmektir. Gelecekteki çalışmaları için Retina yönlendirme yöntemleri standartlaştırmak için bu eser kapsamlı bir amacı olduğunu.

Giriş

Bir önemli ve bazen gözden Retina nörolojik uygun yönlendirmeyi ve izole bütün Dağı retina analizini bir retina bir elektrofizyoloji kayıt odasında ya da histolojik slayt üzerindeki yönünü olsun yönüdür. Bu, özellikle şu anda memeli görsel sistemin araştırmalar için en çok kullanılan modeldir fare retina içeren çalışmalar için önemlidir. Fare retina dağınık şekilde üniforma değil ama melanopsin ganglion hücrelerinin, geçici OFF-Alfa ganglion hücrelerinin ve koni opsins^{1,2 gibi işlevsel olarak farklı Retina hücre tiplerinin yoğunluğu ve boyutu degradeler vardır son keşifler ortaya ,3,4,5}. Sonuç olarak, retina yönünü belirlemek için kullanılan yöntemi içeren hücre türü veya opsin dağıtımları^2,3,6, deneysel sonuçları etkileyebilecek yönde yön-seçmeli olarak ayarlama ganglion hücreleri^7,8,9ve Retina dejenerasyonu^{10,11,12,13,14 topografik desenleri} . Aslında, değil raporlama nasıl Retina yönlendirme bildirilmektedir tutarsızlıkları edebiyat ve karışıklık çalışmalar arasında verileri karşılaştırmak çalışırken neden olabilir. Bu nedenle araştırmacılar bu tür çalışmaların sonuçları doğru bir şekilde yorumlanabilir için retina yönünü belirleme yöntemi rapor hayati önem taşımaktadır.

Retina yönlendirme sık oküler enükleasyon^{1,3,12,15,16,17 önce sırt, Menfez, burun veya zamansal kornea Puanlama tarafından tanımlanır ,18,19} veya kesme veya ekstraoküler kaslar^6,7gibi simge yapılara derin anatomik göz boyama, koroid fissür^20,21, ya da s-opsin degrade^2,3. Rektus kasları superior rektus, inferior rektus, medial rektus veya lateral rektus kas, ekin ya bisects bir derin giderici kesim yaparak sırt, Menfez, burun kemiği ve zamansal retina sırasıyla tanımlamak için kullanılabilir. Ancak, çoğu deneyler için bir rektus kas kullanarak retina²²yönlendirme için yeterli olur. Göz geliştirme kalıntısı olan choroid yarığın göz arkasında zayıf yatay bir çizgi olarak görülebilir. Bu satır her sonu burun veya küre²³zamansal kutup sona erer. Son olarak, s-opsin ifade asimetrik olarak farelerde ventral retina dağıtılır ve s-opsin antikorlar immunohistokimyasal deneyleri¹ventral retinada ortaya çıkarmak için kullanılabilir.

Son eseri Stabio, vd. ²² kornea yanığı gibi yüzeysel oküler simge yapılara anatomik uzaydaki insan hatası ve zamansal ve medial kullanırken kornea yanığı yapımında değişkenlik nedeni büyük olasılıkla retina yönlendirme için daha az güvenilir bir yöntem olduğunu gösterdi referans noktaları olarak canthi. Buna ek olarak, derin tarihi yerler, superior rektus kas, choroid fissür ve s-opsin gradyan gibi retina²²yönlendirme için daha güvenilir ve doğru yerlerinden olmak gösterilmiştir. Ancak, bu anatomik yerlerinden tanımlaması literatürde ayrıntılı olarak açıklanan değildir benzersiz diseksiyon adımları gerektirir. Böylece, bu iletişim kuralının amacı doğru fare retina kayma yönünü belirlemek için superior rektus kas, choroid fissür ve s-opsin degrade kullanımı hakkında kapsamlı bir eğitim sağlamaktır. Buna ek olarak, iki s-opsin antikorlar yanı sıra s-opsin immünhistokimya için bir iletişim kuralı etkinliğinin karşılaştırılması dahil ettik.

Bir ek meydan okuma çalışmaları üzerinde hassas Retina yönlendirme güvenerek wholemount Retina kayıt odası, yemek veya slayt üzerindeki düzleştirmek için gerekli büyük giderici kesim olduğunu. Bu düz iki boyutlu bir yapı olarak yansıması zaman doğal olarak bir üç boyutlu yapısı nedir analiz için sorunlar ortaya çıkarabilir. Retistruct²⁴ adlı bir program--dan o toplanan verilerin analiz önce düz wholemount retina üç boyutlu yapısını dönmek için kullanılabilir. Böylece, bu iletişim kuralı bir bölümünü s-opsin immunostained fare Retina yeniden oluşturmak için Retistruct yazılım kullanmak için gerekli olan adımları vurgulama için adamıştır. Protokolü was gelişmiş-e doğru döndür ve şark fare Retina s-opsin ile lekeli bizim özel MATLAB komut kullanmak için bir bölümü de dahil ettik.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Akron Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Retina yönünü belirlemek için Superior rektus kas simgesel yapı kullanma

Not: Superior rektus kas dorsal retina (Tablo 1) için bir dönüm noktası olduğunu. Deneme dorsal retina işaretleme gerektirmiyorsa, atlamak adım 1 ve adım 2 ile devam edin.

1. Onaylanmış kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Protokolü fare ötenazi için izleyin.
2. Dünyanın genel yönünü belirlemek için yanık izi ötenazi (Şekil 1A) hemen sonra kornea sklera sınırında burun ve temporal canthi arasında doğrudan dorsal kornea üzerinde olun. On saniye için bir koter kalemi Isıtma ve dorsal kornea için kalemin bir saniyeliğine dokunmadan işaretlemek yanık olun.
   Not: Holding için kornea koter kalemi çok uzun ponksiyon dünya neden olur.
   Not: bazı koter kalemleri ışık yayarlar iken, Tablo reçetesi listelenen koter kalemi ısıtıldığında dark-adapted deneyler için güvenli bir seçenek yapmak herhangi bir ışık yayarlar değil.
3. Enükleasyon için Kıvrımlı pensler hafifçe göz yerinden itmek ve Globe'dan altında kavrama için kullanın. Dünya kaldırmak için optik siniri kesmek yok; Bunun yerine, yavaş yavaş dünya onun soketten dünya yuvasından serbest bırakılıncaya kadar aynı anda bunu yavaşça soldan sağa doğru hareket ederken kaldır.
   Not: Bu hareket ne zaman dünyanın sonunda tamamen soketten çıkarmak için dünya bağlı kalır için rektus kas sağlayacaktır. Optik siniri de sık sık dünyanın bağlı kalır.
4. Dünyanın bir petri diseksiyon orta içeren ekli rektus kasları ile aktarın. Hangi göz sol göz ve sağ gözü olduğunu izlemek emin olun.
   Not: Tetkik onların Deneysel protokol ile hizalar bir uygun diseksiyon orta kullanmalısınız.
5. Diseksiyon kapsamına görsel olarak dorsal kornea yanığı bulun ve superior rektus kas ile tanımlamak ki öyle (Şekil 1A) ilişkili.
6. Diseksiyon makası veya bir 20 G (0.9 mm x 25 mm) kornea yanığı işareti (bakınız Tablo malzemeler), delinme iğne. Üstün kas bisect için optik sinir doğru küre içine kesme rahatlatma derin bir olun. Bu kesim ile izole ve yeniden oluşturulan bir retina rakamlar 1B ve 1 Cgösterilir.
7. Yavaşça ponksiyon adım 1.6 ile retina parçası maruz kadar yapılan deliğin içine girse forseps ( Tablo malzemelerigörmek) iki kümesi kullanarak retina yalıtmak için başlayın.
   Not: Bu önemlidir bu yavaşça, çok zorla yırtılma olarak yapılması giderici kesim daha fazla gözyaşı için neden olabilir.
8. Forseps sklera tamamen kaldırılıncaya kadar ayrı retina sklera üzerinden alay için kullanın. Retina tamamen izole olana iris, lens, vitre ve kalan herhangi bir yapı forseps ile kaldırın.
   Not: Protokol burada duraklatılmış. Doku s-opsin immünhistokimya için düzeltilmesi olacaksa, 3.5 adıma geçer.

2. Retina yönünü belirlemek üzere Choroid fissür simgesel yapı kullanma

Not: Choroid fissür göz arkasında sklera üzerinde present ve zamansal Kutbu'ndan burun pole (rakamlar 2B ve 2 C; çalıştırır Tablo 1).

1. Fare ötenazi için onaylanmış kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi iletişim kuralı izleyin.
2. Dünyanın genel yönünü belirlemek için yanık izi ötenazi (Şekil 2A) hemen sonra kornea sklera sınırında burun ve temporal canthi arasında doğrudan dorsal kornea üzerinde olun. On saniye için bir koter kalemi Isıtma ve dorsal kornea için kalemin bir saniyeliğine dokunmadan işaretlemek yanık olun.
   Not: Holding için kornea koter kalemi çok uzun ponksiyon dünya neden olur.
3. Göz enucleate ve diseksiyon orta içeren bir petri yerkürenin aktarın. Hangi göz sol göz ve sağ gözü olduğunu izlemek emin olun.
   Not: Tetkik onların Deneysel protokol ile hizalar bir uygun diseksiyon orta kullanmalısınız.
4. Görsel olarak bulmanıza ve tanımlamanıza choroid fissür (Şekil 2B, 2 C) göz arkasında.
   Not: Choroid fissür Ayrıca kızıl ötesi ışık²⁰altında kadeh içinde görünür durumdadır.
5. Dorsal yanık superior kutbunda yer alır olarak göz hala fare olsaydı olurdu Petri kabına dünya gelecek şekilde yönlendirin.
   Not: Dorsal varlığı dünyanın, burun ve geçici yan tanımlanması için yanmak sağlar sağ veya sol göz olup olmadığı sürece belgelenmiş oldu: sağ gözü ise, burun choroid fissür yanık ve tempora sağa doğru olacaktır l choroid fissür yanık soluna doğru olacaktır. Sol göz, zamansal choroid fissür yanık sağa doğru olacaktır ve burun choroid fissür yanık soluna doğru olacaktır.
   Diseksiyon makası veya bir 20 G (0,9 x 25 mm) (bakınız Tablo malzemeler), yapmak bir delik dorsal yanık olduğu Globe iğne.
6. Sığ bir rahatlatma dorsal kornea yanığı olduğu optik sinir doğru kesim yapmak. # Bu parçayı dorsal retina kimlik yalıtım (Şekil 2D) sonra için izin choroid fissür dik olacak.
7. Optik siniri doğru aşağıdaki iki derin giderici kesim yapmak: bir diseksiyon bıçaklar astar tarafından makas kadar göz arkasında zamansal choroid fissür çizgili ve bir diseksiyon bıçaklar astar tarafından ile burun koroid makas fissür satırı göz arkasında. Bu kesim bir izole ve yeniden oluşturulan retinada Şekil 2D ve 2Eüzerinde gösterilir.
   Not: Alternatif olarak, derin bir kesik zamansal choroid fissür yapılabilir ve gereksiz kesmek sırt kornea yanığı yapma burun choroid fissür sığ bir kesim yapılabilir. Bu daha az giderici kesim ile retina doğru oryantasyon sağlar.
8. Yavaşça ponksiyon adım 2.7 ve 2.8 ile retina parçası maruz kadar yapılan deliğin içine girse forseps ( Tablo malzemelerigörmek) iki kümesi kullanarak retina yalıtmak için başlayın.
   Not: Bu önemlidir bu yavaşça, çok zorla yırtılma olarak yapılması daha fazla gözyaşı giderici cut(s) neden olabilir.
9. Forseps sklera tamamen kaldırılıncaya kadar ayrı retina sklera üzerinden alay için kullanın. Retina tamamen izole olana iris, lens, vitre ve kalan herhangi bir yapı forseps ile kaldırın.
   Not: Protokol burada duraklatılmış. Doku s-opsin immünhistokimya için düzeltilmesi olacaksa, 3.5 adıma geçer.

3. S-opsin gradyan içerisinde fare Retina etiketleme

Not: S-opsin photopigment ifade retina ventral yarısı için mükemmel bir işaretleyici yapma ventral retina¹, asimetrik olarak dağıtılır. Bu yöntem yalnızca sabit için yararlıdır ve immunostained doku (Tablo 1). Aşağıdaki adımları yukarıda belirtilen yöntemlerden herhangi birini kullanarak disseke Retina uygulanabilir.

1. Fare ötenazi için onaylanmış kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi iletişim kuralı izleyin.
2. Hemen sonra ötenazi, göz enucleate ve dünya diseksiyon orta ile Petri kabına yerleştirin. Hangi göz sol göz ve retina disseke sonra retina yönünü belirlemek için sağ gözü olduğunu izlemek emin olun.
   Not: Tetkik onların Deneysel protokol ile hizalar bir uygun diseksiyon orta kullanmalısınız.
3. Retina retina parçası maruz kadar yavaşça kornea bir delik gözyaşı forseps (malzemeler tablo) iki kümesi kullanarak yalıtmak için başlayın.
   Not: Bu önemlidir bu yavaşça, çok zorla yırtılma olarak yapılması gözyaşı retina neden olabilir.
4. Forseps sklera tamamen kaldırılıncaya kadar ayrı retina sklera üzerinden alay için kullanın. Retina tamamen izole olana iris, lens, vitre ve kalan herhangi bir yapı forseps ile kaldırın.
   Not: Protokol burada duraklatılmış. Deneme için bir ex vivo retina kullanarak aşağıdaki adımları gerçekleştirmeden önce deneme gerçekleştirin.
5. Düz yalan olur ki diseksiyon makası kullanarak, retina dört giderici kesim yapmak. Retina ganglion hücre tarafında nitroselüloz membran (Tablo reçetesi) üzerinde hafifçe forseps ile retina membran üzerine her köşesine basarak binin.
   Not: S-opsin gradyan için Retina yönlendirme kullanırken giderici kesim konum rasgele olabilir.
6. Forseps kullanarak, bir 24-şey plaka (Tablo reçetesi) ilk kuyuda bağlı retina aktarmak fiksasyon için 1 mL % 4 paraformaldehyde (Malzeme tablo) ile dolu. 24-şey plaka bir orbital çalkalayıcı, oda sıcaklığında (Tablo reçetesi) yerleştirin ve retinanın tam olarak 40 min için düzeltmek.
   Not: Aşağıdaki yıkama ve kuluçka adımlarının tümünün bir orbital çalkalayıcı üzerinde 24-şey plaka ile tamamlanmalıdır.
7. 15 dakika oda sıcaklığında retina de 1 mL 0.1 M PBS ile dolu ikinci aktararak yıkayın. İki kez ardışık olarak retina 0.1 M PBS dolu üçüncü ve dördüncü kuyuları için aktararak bu adımı yineleyin.
8. Beşinci de içeren 1 çözüm (% 1.7 Triton X-100 ve %5.2 eşek normal serum içinde 0.1 M PBS; bkz: Malzemeler tablo) engelleme mL için bağlı retina aktarmak ve gecede 4 ° C'de kuluçkaya
9. Tavşan anti-s-opsin birincil antikor ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) 1:500 bir konsantrasyon, engelleme çözüm için ve 4 ° C'de üç gün kuluçkaya
10. Aşırı birincil antikor retina üzerinden sırayla altı Wells, oda sıcaklığında 10 dakika her 1 mL 0.1 M PBS ile dolu yerleştirerek altı kez yıkayın.
11. Bir de taze engelleme çözüm (% 1.7 Triton X-100 ve %5.2 eşek normal serum içinde 0.1 M PBS) ile retina yerleştirin ve eşek Anti-tavşan Alexa-594 ikincil antikor ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek). Gecede 4 ° C'de ikincil antikor ile retina kuluçkaya
12. Aşırı ikincil antikor retina üzerinden sırayla taze 0.1 M PBS için oda sıcaklığında her 10 min 1 mL dolu altı Wells yerleştirerek altı kez yıkayın.
13. Forseps kullanarak, bağlı retina 0.1 M PBS içeren bir Petri kabına aktarın. Nitroselüloz zar retina retina artık bağlı olduğu kadar yavaşça forseps retina ve membran arasında ipuçları ekleyerek serbest bırakın.
14. Retina retina cam sopa kadar yavaşça o forseps ile dürtmeye tarafından bir cam mikroskop slaytta mount ve Petri kabına slayt kaldırın.
15. Retina Aquamount ile slayt üzerinde kapak ve #1.5 coverslip ile kaplayın. Slaydı slayt tepsisine yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) ve oda sıcaklığında bir saat oturup bekleyin.
16. Buzdolabı ve mağaza içinde bir slayt tepsi slayt dönmek ( Tablo malzemelerigörmek) 4 ° c kullanılmadığı zaman. Slayt için 24 saat coverslipped sonra tırnak cilası kuruma önlemek için slayt kenarlarında mühürlemek için kullanın.
    Not: Protokol burada duraklatılmış.

4. kullanarak Retina Immunostained Retina yönünü belirlemek için S-opsin ile yeniden

1. S-opsin gradyan confocal mikroskop ya da bir fotoğraf makinesi eki olan bir epifluorescent mikroskobu ile görselleştirmek ( Tablo malzemelerigörmek) ve böylece tüm retina (rakamlar 1B, 2D, 3A ve bir görüntüde görülebilir retina görüntü 3D). bu bölümlerde düşük büyütmede retina görüntüleme ve görüntüleri birlikte dikiş yapılabilir.
2. Böylece tanımlanabilir Retina adı. Örneğin, adı "Retina1" olmak ilk retina yeniden.
3. Karşıdan yükleyip ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html.
4. Yeniden olabilir, ancak klasörleri boş bırakmak için ihtiyacı her retina için bireysel bir klasör oluşturun. Örneğin, "Retina1" adlı bir klasör oluşturun. Bu retina yeniden oluşturmak için gereken tüm dosyaları bu klasör sonraki adımda yerleştirilir.
   Not: Bu klasörleri içermesi gereken tek Retistruct tarafından analiz edilecek olan dosyaları dosyalarıdır. Aşağıda ayrıntılı olanlar dışındaki tüm dosyaları retina Retistruct yazılım tarafından açılacak yapamaz hale getirecek.
5. Açık belgili tanımlık imge Retina ImageJ içinde dosya seçerek → aç ve o zaman seçme "Retina1".
6. Görüntünün herhangi bir değişiklik yapmadan, "başlıklı image.png" klasörüne kaydetmek "Retina 1 dosya → Kaydet → PNG seçerek".
   Not: Dosya "image.png" olarak yeniden inşası için bir retina dosyayı tanıyamıyor Retistruct yazılımınızın adlandırılması gerekir.
7. Retina kenarlarını anahat için parçalı satırı aracını kullanın. Retina sınırında iki bitişik noktalar tıklayarak, parçalı çizgi aracı aslında "noktalar bağlamak bir anahat oluşturma iki bitişik noktalar arasında" olacak. Tüm retina özetlenen kadar yineleyin. → Araçlar → ROI Yöneticisi → retina anahat olarak "Analyze seçerek"Retina1"başlıklı outline.roi" klasörüne kaydetmek daha fazla → Kaydet [t] → ekleyin.
   Not: Retina kenarına nerede s-opsin boyama geçişleri için arka plan tespit edilebilir.
8. Optik disk kenarlığını anahat için 4.7. adımda anlatıldığı gibi kısımlara ayrılmış satırı aracını kullanın. → Araçlar → ROI Yöneticisi → optik disk anahat olarak "Analyze seçerek"Retina1"başlıklı od.roi" klasörüne kaydetmek daha fazla → Kaydet [t] → ekleyin.
   Not: Optik disk retina ortasında küçük delik olarak tanımlanır ve diseksiyon kalitesine göre değişir.
   Not: Tüm Retistruct yeniden yapılanma ("image.png", "outline.roi" ve "od.roi") için gerekli dosyaları şimdi "Retina1" klasörüne kaydedilmiş olmalıdır.
9. Download, install ve Retistruct programı açmak için Sterratt, vd. , ek materyalleri bölümünde yer Retistruct Kullanıcı Kılavuzu'nda açıklanan yönergeleri izleyin ²⁴
10. Pencere yer aldı, Retistruct'ı tıklattığınızda "Açık" simgesi üst sol-in pencere ve "Retina1" dizini klasörü seçin.
11. Ölçek çubuğu yok var olduğunu gösteren bir görüntü penceresi açılır. Tıkırtı "Kapatmak" ve retina görüntüsünü kutusunda görünecektir. Top "Özellikler" düğmesini tıklatarak anahat Retina görselleştirmek sağında görünür renk (Şekil 5A) için pencere ve değişim anahat rengini.
12. Önemli: retina sağ gözü veya sol göz (Şekil 5A) soldaki panelinde gelen olup olmadığını belirtin.
13. Soldaki "gözyaşı Ekle" düğmesini tıklatın ve bir gözyaşı veya kesme retinada gözyaşı (Şekil 5A) üç tepe noktaları üzerinde tıklatarak nerede belirtin. Bu üç köşeleri kesme bağlanan çizgiler oluşturur. Retina tüm kesim için yineleyin.
14. Dorsal retina Retina anahat rasgele bir noktaya tıklayarak tarafından belirtin. Büyük harf "D" Bu noktada anahat (Şekil 5B) görünür.
    Not: Dorsal retina retina, s-opsin degrade karşısında daha koyu yarısı olacaktır. Ancak, Retistruct dorsal retinada işaretleme işaretleme için "sırt" Bu adımda rasgele böylece retina, dorsal yarısı tanımlamak için güvenilir bir yöntem değildir.
15. Yeniden yapılandırma "Retina yeniden yapılandırma" düğmesi üst retina ekranın (Şekil 5B) bıraktı. Yeniden oluşturulan retina polar bir arsa kesintileri görülebilir (Şekil 5C) anahat olarak aynı renkte görünür.
16. "Retina1" klasör dizini (Şekil 5D) yeniden oluşturulan retina ve tüm ilişkili veriler kaydedilir böylece ekranın sağ "Kaydet" düğmesini tıklatın.
17. Yeniden oluşturulan retina için "PDF" düğmesini sağ taraftaki bölmede (Şekil 5D) kaydedin. Bir kutu boyut özellikleri için soran görünür. Varsayılan boyut için aşağıdaki adımları kabul edilir. Bu eylem yeniden oluşturulan retina "image.polar.pdf" "Retina1" klasör dizini olarak kaydedecektir.
18. "İmage.polar.pdf" boyama programı (veya diğer görüntü işleme programı) açın ve "Boya Kovası" aracını kullanın (veya benzeri) yeniden oluşturulan retinanın arka plan siyah değiştirmek için. Yeniden oluşturulan retina "Retina1_reconstructed.tif" "Retina1" klasör dizini gibi bir .tif dosyası olarak kaydedin.
    Not: Protokol burada duraklatılmış.
19. "Retina_Rotator.m" (bakınız ek materyalleri) denilen retina döndürme için MATLAB kodunu indirin. Kod dosyası klasöründeki diğer dosya ile kendi klasörüne yerleştirin.
20. MATLAB, sürüm 2007b açmak veya daha sonra. MATLAB açmak için kod dosyasını çift tıklayın. Komut penceresinde, "Retina_Rotator" yazın ve sonra enter tuşuna basın. Arama penceresi görünür.
    Not: .tif dosyaları için belirli kodudur. Döndürülecek dosyası doğru biçimde değilse, kod retina doğru döndürür değil. 4,17 4,18 bkz:. uygun biçimde restore edilmiş retina kurtardığın için.
21. Döndürülmesi için dosyayı açın. Örneğin, "Retina1_reconstructed.tif" seçin. Kod daha sonra yeniden oluşturulan retina analiz eder ve otomatik olarak döndürülmüş retina özgün dosyanın konumlandırıldığı klasöründe "Retina1_reconstructed_rotated.tif" olarak kaydedilir.
22. Kod retina analiz sonra bir pencere de Retina görüntüleri önce ve sonra karşılaştırma (rakamlar 3B ve 3 C; için döndürme gösteren görünür Rakamlar 3E ve 3F).
    Not: Bu kodu yeniden oluşturulan retina böylece ventral (parlak) yarı alt ve böylece doğru s-opsin degrade¹göre retina yönlendirme üst dorsal (dimmest) yarım olduğunu döner. Eğer olup olmadığını retina sağ gözünden veya sol gözünü belgelenmiş oldu, burun ve temporal Polonyalılar konumunu da yönlendirme (Şekil 3) bu yönteminden yaygınlaştırılması.

Sonuçlar

Doğru ve güvenilir bir şekilde üstün rektus kas bisects tek bir rahatlatma kesim dorsal retina (Şekil 1) tanımlar. Choroid fissür doğru ve güvenilir bir şekilde zamansal ve burun choroid fissür (Şekil 2) boyunca derin giderici kesikler burun ve temporal retina tanımlar. Bu örnekte, giderici bir kesim de dorsal retina retina (Şekil 2D, dikey ok) dorsal/ventral ekseni tanımlamak için yapılmıştır. Bu süreçlerin adımları çoğaltma amaçla gelecekteki dissectors tarafından gösterilir. S-opsin immünhistokimya birleşimi (Şekil 3A ve 3D), Retistruct yazılımı (3B, 3E) ile imar ve özel MATLAB kodla (3 C, 3F) doğru dönüş sağlar retina, hem de retina sağ veya sol göz (Şekil 3) olup biliniyorsa burun ve temporal Polonyalılar tahliyeleri ve dorsal yarısı tanımlaması. Biz de etkili şekilde s-opsin koniler (Şekil 4A-D) etiketleme için iki yaygın olarak kullanılan s-opsin birincil antikorlar göre: her iki keçi anti-s-opsin birincil antikor ve tavşan anti-s-opsin birincil antikor etkili bir şekilde etiketleyin s-opsin koniler (Şekil 4E) aynı fare.

Giderici kesim s-opsin yeniden immunostained retina üzerinde tespit edilmiştir ve konumlarına s-opsin degrade tarafından belirlenen şekilde karşılaştırıldı. Bizim özel MATLAB kullanma kodu (bakınız Ek malzemeler), Retina ventrally, böylece doğru yerleştirerek s-opsin boyama en yoğun bulunduğu olması doğru bir şekilde döndürülmüş (için superior rektus) 90 °, 0 ° (için burun doğru nazal, dorsal Choroid fissür) ve geçici (geçici choroid fissür için) 180 ° de gerçek. Açılı kesim değeri her bireyin giderici Retina göre s-opsin degrade döndürülmüş sonra ImageJ içinde açı aracını kullanarak tespit edilmiştir. Ortalama bir açı kesme türü giderici her için hesaplanır ve giderici her kesim türü ortalama değerini daha sonra üzerinde bir kutup çiz (Şekil 6) çizildi. Ortalama olarak, superior rektus kas kesim 96,3 ± 4.3 ° dorsal kutbunda tespit (n = 11) (Şekil 6). Burun choroid fissür 6,7 ± 5.8 ° burun kutbunda tespit ve zamansal choroid fissür 172.0 ± 4,4 ° zamansal kutbunda tespit (n = 9; Şekil 6).

Şekil 1: doğru sağ gözünde dorsal retinada tanımlamak için superior rektus kas kullanarak. (A) dorsal kornea yanık bir koter ucu kalem (beyaz ok) ile yapılan scleral kornea sınırına yakın bir örnek. Superior rektus kas da bu görünümde (beyaz ok) görünür. Bir rahatlatma ile (B) örnek bir bütün olarak bağlı retina dorsal retinada superior rektus kas parçalamak tarafından yapılan kesti. Ok dorsal retinada superior rektus kas parçalamak tarafından yapılan kesim rahatlatma derin gösteriyor. Retina birincil antikor keçi anti-s-opsin ile lekeli ( Tablo malzemelerigörmek) ve ikincil antikor eşek Anti-keçi Alexa 594 ( Tablo reçetesi; görmek uyarma: 590 nm; Emisyon: 620 nm) (mavi). Retina Texas kırmızı filtre ile bir epifluorescent mikroskopla görüntüsü (595 nm). (C) A retina Retistruct içinde yeniden ve bir özel MATLAB kod ile döndürülmüş ( Tamamlayıcı Malzemelerigörmek) üstün rektus kas görünür kesmek (beyaz ok) giderici ile. D: dorsal V: ventral, T: geçici, N: burun. Ölçek çubukları = 1 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: choroid fissür doğru sağ gözünde retinada burun ve temporal Polonyalılar tanımlamak için kullanarak. (A) dorsal kornea yanık koter ucu kalemle yapılan kornea scleral sınırına yakın bir örnek. (B) koroid fissür sklera (beyaz ok) göz arkasında görünür. Dorsal kornea yanığı da 90 ° zamansal choroid fissür üzerinden bulunan bu görünümde görünür. (C) koroid fissür optik sinir scleral kornea sınıra seyahat sklera, göz arkasında görünür. (D) A retina lekeli keçi anti-s-opsin ile ( Tablo malzemelerigörmek) ve ikincil antikor eşek Anti-keçi Alexa 594 ( Malzemeler tablo; görmek uyarma: 590 nm; Emisyon: 620 nm) ile choroid fissür kesim (yatay (Camgöbeği) oklar) ve sırt giderici (dikey ok) kesti. Retina Texas kırmızı filtre ile bir epifluorescent mikroskopla görüntüsü (595 nm). (E) bir retina Retistruct içinde yeniden ve dorsal giderici kesme ve burun ve temporal choroid fissür kesim görünür (beyaz ok) ile özel MATLAB kodla (bakınız ek malzemeler) döndürülür. D: dorsal V: ventral, T: geçici, N: burun. Ölçek çubukları = 1 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: s-opsin degrade dört Polonyalılar Retina tanımlamak için kullanarak. (A) bir retina örneği disseke immunostained s-opsin etiket ve bir Texas kırmızı filtre ile bir epifluorescent mikroskopla görüntüsü doğru bir göz (595 nm). Topografik yönlendirme s-opsin degrade tarafından belirlenir beri bu retina içinde rasgele kesikler. (B) A Retistruct ile retinada gelinen sonuçlar. Retina özel MATLAB kodu (bkz: Ek malzemeler) çalıştırmak değil çünkü s-opsin degrade doğru uyumlu değildir ki dikkat edin. (C) a retina özel kodla döner sonuçlarını. Retina s-opsin boyama en yoğun alt kısmında yer alır böylece döndürülmüş ve ventral Retina tanımlanır. Retina sağ gözünden olduğundan, zamansal kutup bulunduğu 90 ° saat yönünün tersine dorsal Kutbu'ndan ve burun direği bulunduğu 90 ° saat yönünde dorsal Kutbu'ndan. (D) bir retina örneği disseke immunostained s-opsin etiket ve bir Texas kırmızı filtre ile görüntülü bir sol göz (595 nm). Topografik yönlendirme s-opsin degrade tarafından belirlenir beri bu retina içinde rasgele kesikler. (E) dijital olarak Retistruct ile D retinada gelinen sonuçlar. Retina özel kod tarafından döndürülmüş değil çünkü s-opsin degrade doğru uyumlu değildir ki dikkat edin. (F) D retinada özel kodla döner sonuçlarını. Retina s-opsin boyama en yoğun alt kısmında yer alır böylece döndürülmüş ve ventral Retina tanımlanır. Retina sol gözünden olduğundan, Burun direği bulunduğu 90 ° saat yönünün tersine dorsal Kutbu'ndan ve zamansal kutup bulunduğu 90 ° saat yönünde dorsal Kutbu'ndan. D: dorsal V: ventral, T: geçici, N: burun. Ölçek çubukları = 1 mm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: s-opsin koni etiketleme iki birincil s-opsin antikorlar karşılaştırılması. (A) A retina lekeli keçi anti-s-opsin birincil antikor ile (bkz. Tablo malzeme). (B) aynı fare diğer retina lekeli tavşan anti-s-opsin birincil antikor ile (bkz. Tablo malzeme). (C) A temsilcisi bölge (0.1 x 0.1 mm²) keçi anti-s-opsin birincil antikor ile lekeli bir retina seçin. Bir epifluorescent mikroskobu 40 X büyütme, alınan görüntü. (D) A temsilcisi bölgesinden (0.1 x 0.1 mm²) bir retina lekeli tavşan anti-s-opsin ile (bkz. Tablo malzeme), bir birincil antikor alternatif. Görüntü üzerinde bir epifluorescent mikroskobu 40 X büyütme, çekildi. İmmunopositive s-kozalakları keçi anti-s-opsin ve tavşan anti-s-opsin, herhangi bir test Retina lekeli sayısında anlamlı bir fark olduğundan (E) her iki antikorlar s-koni dış segmentleri aynı sayıda etiket. eccentricities (n = 2; ANOVA post hoc Bonferroni testi ile; p > 0.05). Ölçek çubukları = 1 mm (A-B); 25 µm (C-D). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: Retina immunostained s-opsin ile yeniden oluşturmak için Retistruct yazılım kullanmak için görsel bir kılavuz. (A) A retina görülebilir anahat ile Retistruct açıldı ve bir "gözyaşı" eklendi. Puan "Gözyaşı" üst üste Beyaz oklarla gösterilir. Hiçbir belirli landmark diseksiyon sırasında Retina yönlendirme işaretlemek için kullanılan gibi tüm bu retina içinde rasgele, kesikler. Önemli düğmeleri kırmızıyla özetlenmiştir. "Tüm gözyaşları eklendi" ile (B) A retina ve dorsal retina retina kenarına "D" ile tanımlanır. "Yeniden Retina" düğmesini şimdi görünür olduğuna dikkat edin. Önemli düğmeleri kırmızıyla özetlenmiştir. (C) bir retina yeniden yapılandırma işlemi. Yeniden oluşturulan retina kutup Arsa giderici mavi (mavi oklar kesim yerleri açıklığa kavuşturmak için üst üste) keser gösterilen sağda görünür. (D) bir retina Retistruct çalışan nihai sonucu. Orijinal wholemount retina sol tarafta kalır ve yeniden oluşturulan retina sağda gösterilir. Giderici kesim mavi (beyaz ok kesim yerleri açıklığa kavuşturmak için üst üste) görülebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 6: superior rektus kas ve koroid fissür doğru fare retina yönlendirmek için kullanılabilir. Açıları bir kutup Arsa kesim giderici ya da superior rektus kas elde edilen veya Retistruct ile yeniden Retina choroid fissür keser. Giderici kesim s-opsin yeniden immunostained retina üzerinde tespit edilmiştir ve konumlarına s-opsin geçişin konuma karşılaştırıldı. S-opsin boyama en yoğun bulunduğu ventrally, gerçek dorsal (90 ° superior rektus için) olması doğru bir şekilde Retina döndürmek için özel MATLAB kod kullanarak, burun kemiği (0 ° burun choroid fissür için) gerçek ve zamansal (180 ° zamansal koroid için gerçek fissür) her retina için belirlenmiştir. Her bireysel rahatlatma kesme açısı ImageJ ve ortalama bir açı belirlendi değerini kesme türü giderici her için hesaplanır. Superior rektus kas kesim 96,3 ± 4.3° dorsal kutbunda tespit (n = 11). Burun choroid fissür 6,7 ± 5.8 ° burun kutbunda tespit ve zamansal choroid fissür 172.0 ± 4,5 ° zamansal kutbunda tespit (n = 9). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Derin Simgesel Yapı	Kornea yanığı konumu	Retinanın tespit Kutbu	Deneysel uygulama
Superior rektus	Dorsal	Dorsal	Canlı ya da sabit
Burun Choroid fissür	Dorsal	Burun kemiği	Canlı ya da sabit
Zamansal Choroid fissür	Dorsal	Zamansal	Canlı ya da sabit
S-opsin gradyan	Hiçbiri	Dorsal, Menfez, burun, zamansal	Sabit

Tablo 1: Derin yerler, retina Kutbu onlar tespit ve ister canlı ya da sabit doku uygulaması için kullanılabilir.

Tartışmalar

Belirlenmesi ve anatomik alanı izole fare retinada yönünü etiketleme için kapsamlı, standart protokol olmuştur. Protokol burada girişimleri standartlaştırılması tarafından bu boşluğu doldurmak için detaylı ve derin anatomik işaretlerini kullanmak nasıl ayrıntılı noktalarına güvenilir bir şekilde referans olarak tanımlamak Retina yönlendirme. Bu iletişim kuralı derin anatomik simge yapılar fare retina kornea yanığı²²gibi yüzeysel simge yapılara daha yönlendirme için daha doğru ve güvenilir bir yöntem sağlamak gösterilmiştir. Böylece, Retina yönlendirme kornea yanığı dayanıyordu çalışmalar büyük hataları rektus kasları ve choroid fissür gibi simge yapılara dayanıyordu çalışmalar daha yönde vardı olabilir. Bu tutarsızlık ihtiyacını ve sonuçları yorumlama ve doğru Retina yönlendirme bağlı çalışmalar arasında karşılaştırmalar yapma ile ilgili bu standart iletişim kuralı önemini vurgulamaktadır. Genel olarak, standart bir protokol böylece oluşabilecek veri toplama karıştırıcı bir değişkende varlığıyla Retina tanımlamak için standart dışı yöntemlerin kullanımı ortadan kaldırarak vizyon araştırmacılar takip etmek için kullanılan genel yöntem sağlar Yönlendirme.

Burada sunulan kolayca tekrarlanabilir ve deneysel protokoller birçok türleri için geçerli yöntemlerdir. Aslında, bu protokolü en büyük avantajlarından biri, uyum yeteneği var. Choroid fissür, s-opsin ifade ve rektus kas yerler tüm güvenilir Retina yönlendirme²² tanımlamak için bulunmuştur çünkü en deneysel parametreleri uygun Simgesel Yapı veri toplama (tablo en iyi duruma getirmek için seçilebilir 1). Buna ek olarak, diseksiyon yöntemleri retina yönünü daha da netleştirmek için kombine edilebilir. Örneğin, choroid fissür kesim s-opsin immünhistokimya ile tüm dört Polonyalılar Retina yönlendirmek için kombine edilebilir: burun ve temporal hemisferlerin choroid fissür kesim tarafından belirlenebilir ve s-opsin immünhistokimya teşhis ventral ve dorsal hemisferlerin. Henüz, bu protokol adaptasyon Fizyoloji deneyler zamana duyarlı doğa tarafından sınırlı. O bir dönüm noktası belirlemek, kornea yanmak yapmak ve giderici bir kesim yürütmek için gereken zaman ex vivo deneyler önemli doku ölümüne neden olabilir çünkü bu diseksiyon yöntemlerden bazıları az en uygun olabilir. Neyse ki, bir tetkik derin işaretlerini belirleme ve rahatlatma yapma choroid çatlak veya superior rektus kas diseksiyon yöntemi ile tanıdık haline gelmiştir sonra kesim hızla diseksiyon rutin bir parçası haline ve önemli ölçüde eklemeyin diseksiyon uzunluğu için. Her ne kadar biz burada ayrıntılı adımları zamanında son derece zamana duyarlı deneyler için ekleyebilirsiniz kabul ediyor musunuz, doku canlılığı artık bir sorun (Şekil 3 olduğunda s-opsin degrade hoc sonrası Retina yöndür kullanmanızı öneririz ). S-opsin retina, yönlendirmek için etkili bir yol için dört Polonyalılar tanımlayabilirsiniz gibi retina boyama: s-opsin boyama retina dorsal ve ventral direkleri böler ve bağlı olarak burun ve zamansal Polonyalılar için sağlar retina sağ veya sol göz (Şekil 3) var. Bu nedenle, bu iletişim kuralını yöntemleri deneysel parametrelerin yerine getirebilecek doğru Retina yönlendirme için güvenilir ve yinelenebilir bir dizi sağlar inanıyoruz.

Olarak değiştirilmiş herhangi bir retina diseksiyon ile tetkik ve izole edildikten doku kalitesi doğruluğunu tarafından diseksiyonu yöntemin geçerliliğini sınırlıdır. Herhangi bir doku diseksiyon sırasında kaybolur veya bir retina çok doğru yeniden yapılanma için ezilmiş, Retistruct ve MATLAB programı güvenilir bir şekilde yeniden inşa veya retina yönlendirmek mümkün olmayacaktır. Bu nedenle veri toplamak için kullanarak deneyler önce diseksiyon yöntemi uygulama önemlidir. Burada zor değildir diseksiyonlarının türleri açıkladı iken, onlar belirli bir dönüm noktası ile retina yönlendirme tanımlama tekrarlanabilirlik sağlamak için uygulanan gerekir. Ayrıca, görsel olarak doğru landmark emin olmak için veri toplama başlamadan önce anatomik işaretlerini belirleme tetkik pratik kullanılıyor esastır. Ya choroid fissür yapmak için keser veya superior rektus kas keser ve beri sabit bir işaretleyici ve böylece dissectio doğruluğu üzerinde bağımlı değildir seyiyor s-opsin gradyan için kesim karşılaştırmak belirli bir tetkik doğruluğunu kontrol etmenin bir yolu olduğunu n. potansiyel dissectors Ayrıca kesim Şekil 1 ' de gösterilen doğru Simgesel Yapı ile yeniden oluşturulan Retina örnekleri için yeniden oluşturulan onların Retina karşılaştırmak ve Şekil 2. Esasen, potansiyel bir tetkik belirli diseksiyon türü için bu protokolü bölümünde özetlenen adımları gerçekleştirmeniz gerekir, bu olsun superior rektus kas veya koroid fissür yöntemi ve geçerliliğini kurmak için s-opsin geçişin sonuçları karşılaştırmak bir belirli tetkik. Tetkik Simgesel Yapı konumu hakkında emin değilseniz ise, retina bir yanlış yönde neden olabilir çünkü olacak, varsayılan olarak, veri toplama ve etkiler yorumu.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	P5244
Axioplan2 Epifluorescent Microscope	Zeiss	N/A
Clear Nailpolish	N/A	N/A
Corning LSE Low Speed Orbital Shaker	Sigma-Aldrich	CLS6780FP
Costar TC-Treated 24-well Plates	Sigma-Aldrich	CLS3524
Dissection Microscope	Olympus	SZ51
Donkey anti-Goat Alexa 594	Life Technologies	A11058
Donkey anti-Rabbit Alexa 594	Life Technologies	A21207
Donkey Normal Serum	Millipore	566460	Use at 5.2% (52 μL with 86 μL of 20% Triton X-100 and 863 μL of 0.1M PBS for 1 mL of blocking solution)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Goat anti-s-opsin	Santa Cruz Biotechnologies	sc-14363	Not commerically available as of 2017
Graefe Curved Forceps	Fine Science Tools	11052-10
ImageJ or FIJI	National Institute of Health	N/A	Freely available software
Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer	Bovie Medical Corporation	AA00
MATLAB	MathWorks	N/A	At least version 2007b or later
Micro Cover Glasses	VWR International	48393-241
Micro Slide Trays	VWR International	82020-913
Moira Ultra Fine Forceps	Fine Science Tools	11370-40
Nitrocellulose membrane	Millipore	HAWP04700
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Use at 4% (25 μL and 875 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of fixative)
PrecisionGlide Needle 20G (0.90 mm x 25 mm)	BD PrecisionGlide	305175
Pyrex Glass Petri Dish	Sigma-Aldrich	CLS3160152
R	The R Project for Statistical Computing	N/A	Freely available software; version 3.4.3 or later
Rabbit anti-s-opsin	Millipore	ABN1660
Retiga R3 Microscope Camera	Qimaging	01-RET-R3-R-CLR-14-C
Retistruct	N/A	N/A	Freely available software  compatiable with Windows 7 or Windows 10
Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media	Fisher Scientific	14-390-5
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Use 1.7% (86 μL of 20% Triton-X with 52 μL of Donkey Normal Serum and 863 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of blocking solution)
Vannas Spring Dissection Scissors	Fine Science Tools	15000-03
5MP USB Microscope Digital Camera	AmScope	MU500	To be used with the Olympus Dissection Microscope