JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Vivo microdialysis molekülleri uyanık, özgürce davranmaya hayvanlardan beyin interstisyel sıvı (ISF) mevcut topluluğu sağlamıştır. ISF nispeten büyük molekülleri çözümlemek amacıyla geçerli madde özellikle probları yüksek molekül ağırlıklı membranlar kesim ile microdialysis iletişim kuralı'nı odaklanır.

Özet

Vivo microdialysis bir diyaliz ilkesine dayanarak uyanık, özgürce davranmaya hayvanlardan ISF toplamak için güçlü bir tekniktir. Microdialysis amino asitler veya nörotransmiterler gibi nispeten küçük moleküller ölçer kurulan bir yöntem olmakla birlikte, bu son zamanlarda da büyük moleküllerin probları yüksek molekül ağırlıklı kesilmiş ile kullanarak ISF dinamikleri değerlendirmek için kullanılmıştır membranlar. Bu tür sondalar kullanarak üzerine microdialysis sondalar içinde birikmiş basınç önlemek için bir itme-çekme modunda çalışmak zorundadır. Bu makalede stereotaksik cerrahi ve proteinler ISF toplamak için microdialysis satırlarını ayarlamak nasıl da dahil olmak üzere adım adım iletişim kurallarını sağlar. Microdialysis sırasında ilaçların sistemik veya ISF içine doğrudan infüzyon tarafından yönetilebilir. Ters microdialysis doğrudan bileşikler ISF demlemek için bir tekniktir. Uyuşturucu microdialysis perfüzyon arabellekte eklenmesi ISF sonda aynı anda ISF toplarken diffüz almalarını sağlar. Tau protein örnek olarak ölçerek, yazar nasıl kendi düzeyleri uyarıcı nöronal aktivite picrotoxin ters microdialysis tarafından değiştirilmiş gösterir. Avantajları ve microdialysis sınırlamaları genişletilmiş uygulama ile birlikte diğer vivo içinde yöntemleri birleştirerek anlatılmaktadır.

Giriş

ISF toplam beyin hacmi 15-%20 oluşur ve sinyal iletimi, substrat taşıma ve atık temizleme1için kritik bir microenvironment sunmaktadır. Bu nedenle, yaşayan hayvanlardan ISF toplama yeteneği büyük etkileri çeşitli biyolojik süreçlerin yanı sıra hastalığı mekanizması için sağlayacaktır. İn vivo microdialysis birkaç yöntemden birini bu örnek ve serbestçe hareket hayvan hücre dışı molekülleri ISF üzerinden gelen uyanık, ölçmek ve böylece nörolojik araştırma alanı2,3yararlı bir araç olarak hizmet vermektedir. Bu yöntemde, microdialysis sonda semipermeable Membranlar ile beyinde eklenen ve perfüzyon arabelleği nispeten yavaş akış oranı ile periosteum (0,1-5 µL/dak). Bu perfüzyon sırasında ISF ekstraselüler molekülleri pasif konsantrasyon gradyanı göre soruşturma içine diffüz ve diyalizat toplamak. Bu makale örnek ISF beyinde yöntemine üzerinde duruluyor olsa da, ilke ve yöntemi diğer organlara uygun değişikliğe göre gerekirse uygulanabilir.

O zaman yoğun amino asitler veya nörotransmitter beyinde de dahil olmak üzere küçük moleküller toplamak için kullanılan Microdialysis 1960'ların ve beri ilk istihdam edildi. Ancak, microdialysis probları yüksek moleküler ağırlığı membranlar (100 kDa-3 MDa) kesme son ticari durumu4,5,6 yanı sıra ISF nispeten daha büyük proteinler için uygulama genişletti ,7. Bu sonda kullanarak çalışmaları için bulma açmıştır bu proteinler tau veya α-synuclein gibi uzun olması düşünülen özel sitoplazmik Ayrıca ISF4,5,8' fizyolojik olarak mevcut.

Membranlar (genellikle üzerinde 1.000 kDa) büyük kesik ile microdialysis sonda kullanarak zorluklar Ultrafiltrasyon sıvı kaybı sondalar içinde birikmiş basınç nedeniyle daha duyarlı oldukları biridir. Burada kullanılan Microdialysis sondalar bu sorunu önlemek için benzersiz bir yapıya sahip. Böylece bu sonda ile microdialysis (= Itme) prob ve diyalizat geliyor sonda prizinden toplamak için bir silindir/peristaltik pompa sıvı için bir şırınga pompa kullanarak bir "itme-çekme" modunda ameliyat, basınç bu yapısı sayesinde yerleşik değil (= çekme) 9 (her ne kadar itme ve çekme pompalar, havalandırma delikleri sonda, mevcut iptal baskısı yüzünden ihtiyacı sistem teknik olarak sadece çekme pompası tarafından tahrik edilmektedir). Bu makale kılavuzu kanül implantasyon stereotaksik cerrahi ile başlar ve ISF microdialysis probları ile 1.000 kDa kesme membranlar yoluyla toplamak için microdialysis satırlarını ayarlamak nasıl açıklar.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan çalışmaları gözden geçirilmiş ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi lisansüstü Tıp Fakültesi Tokyo Üniversitesi tarafından onaylanmış.

1. önceden cerrahi müdahale

  1. Ameliyat başlamadan önce Steril koşullar korumak için % 70 etanol ile her şeyi silin. Bir ısıtma yastığı kullanan termal desteği önerilir.
  2. Fareler kloral hidrat (400 mg/kg) mayi enjeksiyonu ile anestezi. Anesthetization bir ayak çimdik gerçekleştirerek onaylayın. Meloksikam SR indüksiyon ve kurtarma teklifi üzerine buprenorfin kullanımı en az 24 saat için önerilir.
  3. Cerrahi bir kesme makinesi ile saç tıraş. Bir fare fare ve neonatal sıçan adaptör kulak çubukları ve burun kıskacı kullanma düzeltmek.
    Not: Bu fare kafa bu aşamada sabitlenir ve yan yana hareket etmeyen emin olmak önemlidir.
  4. Veteriner merhem gözleri kuruluk anestezi iken altında önlemek için uygulayın.

2. stereotaksik cerrahi Kılavuzu kanül implantasyon için

  1. Fare ve neonatal sıçan adaptör stereotaksik cihazları üzerinde ayarlayın. Bir kesik sagittally neşter kullanarak kafatası üzerinde cilt üzerinde yapmak.　Kan ve nemli pamuk bez kullanarak kafatasındaki bağ dokusu yok etmek.
  2. Beyin bölgesi beyin atlas kullanarak ilgi için koordinat belirleme. Ölçümler başlamadan önce böylece matkap olabilir o orta hat düz olduğundan emin olun A-P taşındı ve orta hat dikiş süre boyunca kalır.
    Not: Bu makale koordinat kullanır (A / P:-3.1 mm, M/L:-2.5 mm, D/V:-1.2 mm, 12 derece) posterior hipokampus hedeflemek için.
  3. Level kafatasını A-P
    1. Bir manipülatör stereotaksik çerçeve üzerinde bir tatbikat iliştirin. Lambda hafifçe dokunana dek matkap indirin ve onun ventral koordinat kaydedin. Bregma için bu yordamı yineleyin.
      Not: kafatası fırlattı, bregma dikey ölçüm lambda eşit olur. Aksi takdirde, burun kıskacı yüksekliğini buna göre ayarlayın. Kafatası tesviye sonra bregma ön/arka, lateral koordinatı kaydedin.
  4. Düzey kafatası-sol
    1. Matkap bregma taşımak için koordinat (A / P:-3.1 mm, M/l + 2.0 mm), kafatası matkabı daha düşük ve Dikey koordinatı kaydetmek. Koordinat için bu yordamı yineleyin (A / P:-3.1 mm, M/l-2,0 mm).
      Not: Bu dikey ölçümleri midline iki eşit uzaklıkta puan kafatası fırlattı, eşittir. Eğer değilse, kulak çubuklarının yüksekliğini ayarlayın.
  5. Burr hedef koordinat dikkatle Hole'da matkap (A / P:-3.1 mm, M/L:-2.5 mm) Kılavuzu kanül implant. Burr deliği çapını Kılavuzu kanül implantasyon için yeterince büyük değilse, ilki ile örtüşen başka bir delik. Başka bir delik sağ (kontralateral yan) paryetal kemikte ve 1,10 (bkz: Şekil 1B) diş betona güvenliğini sağlamak için yardımcı olur kemik vidası ekleyin.
  6. Bir tıraş bıçağı tarafından 1.5 mL santrifüj tüpü kapağı arka taraftan dairesel bir kilitleme parça kesme ve bir '' taç '' olun. Bu taç diş çimento cilde yayılmasını önlemek için kullanılır. 2.5. adımda yapılan burr deliği (bkz: Şekil 1) Daire içinde kalmak böylece kafatasında yer.
  7. Stereotaksik adaptör kısa kolunda bir Kılavuzu kanül koyarak stereotaksik bir derleme ayarlayın ve bir kap fındık kullanarak bağlayın. Stereotaksik adaptör uzun kol elektrot kelepçe üzerinde ayarlayın. (Bkz: Şekil 1A) stereotaksik aparatı manipülatör üzerinde ekleyin.
  8. D-V stereotax derleme manipülatör kolundaki 12 derece (bkz: Şekil 1B) döndürür. Kılavuzu kanül 1,6 olarak yapılan burr deliği için hareket ettirin. Kılavuzu kanül 1,2 mm tarafından düşürerek beynin içine yavaş yavaş ekleyin.
    Not: Prob açısı hipokampus için özeldir; diğer bölgeler diğer açıları veya hiçbir açı hiç gerektirebilir. Bir beyin atlas kesin koordinatları için başvurun. Kafatası yüzeyini kuru çünkü değil çimento sopa olacak ve çimento kapağı yerinden olmak
  9. Tam kılavuzu kanül ve onları korumak için yeterli kemik vidası her iki metal parçası kapsayacak şekilde taç içinde diş çimento ekleyin. Maruz Kafatası parçası ise ek diş çimento uygulanır.
  10. Diş çimento tamamen kurumuş kadar bekleyin (~ 12-20 dk). Stereotaksik adaptörü elektrot kelepçe çıkarın. Cap somun kaldırmak ve stereotaksik adaptör kukla bir sonda ile değiştirin ve kap somun tutturmak.
  11. Stereotaksik gelen fare düğmesini bırakın ve bireysel bir kafeste tek başına fare evi.
    Not: sternal recumbency korumak için yeterli kendine geldi kadar fareyi katılımsız bırakılmamalıdır. Fare her gün microdialysis gün kadar kontrol edin. O acı içinde görünüyorsa fare NSAİİ gibi carprofen alır. 2 hafta bekliyor bu yüzden fare için yeni ortam10yerleşir ama çalışmalar diğer türleri daha kısa kurtarma dönemleri (Örneğin, 1-2 gün) gerektirebilir uyku-uyanıklık çalışmaları için gereklidir.

3. Microdialysis Kur

  1. Kalite-kontrol probları: dolgu distile ayve tek kullanımlık 1ml şırınga byton tüp kullanarak bir sonda çıkış (kısa bağlantı noktası) için izleyin. Havalandırma delikleri parmak ile kapak ve yavaşça sonda su demleyin şırınga pistonu düşürmek. Su--dan sonda giriş görünür ve microdialysis membran yüzeyinde hiçbir sızıntı olduğundan emin olun.
    1. Probları aktivasyonu: etanol (70-%100) bir soruşturma zarı iki saniyeliğine daldırın. O zaman, distile su sonda yine bir şırınga tekrar süzülür.
  2. Perfüzyon arabellek hazırlanması: yapışma makaronlar için hedef moleküllerin önlemek amacıyla, BSA tarafından eklemek yapay CSF (1.3 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 3 mM KCl, 0.4 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3 ile % %4 30 BSA çözüm sulandrarak , 122 mM NaCl, pH 7,35 =), hangi iyi uyan CSF, kullanmak için hemen önceki elektrolit konsantrasyonu. Bir şırınga filtre ünitesi ile 0,1 µm gözenek boyutu ile perfüzyon arabellek filtre.
    Not: % 4 BSA proteinler yapışmasını için kurtarma geliştirir ancak ciddi bir şekilde teslim bileşikleri, özellikle yüksek BSA-bağlama var bileşikler için sınırlayabilirsiniz. BSA (%0,15) gibi düşük yoğunluklu belirli örnekleri3kullanmanın bir avantajı bu. Not BSA girdap ya da heyecan plaka heyecanlı zaman çok kolayca toplayabilirsiniz. Bu toplamları probları veya membran gözenekleri yapışmasına neden olabilir. Bu toplama sınırlamak için BSA çözüm hazırlarken dikkatli olun
  3. Giriş ve çıkış (bkz: Şekil 1 c) için iki ayrı hat hazırlamak ve bir bağlantı iğne ile her iki hattı bağlayın. Perfüzyon arabellek ile dolu bir tek kullanımlık 3 mL şırıngaya doldur ve künt uçlu iğne kullanarak hortumu giriş sonu ile bağlayın. Tüm boru ile perfüzyon arabellek şırınga pompa çalıştırarak doldurun.
  4. Enjektör pompa durdurmak ve bir harekete geçirmek microdialysis sonda gelen adım 3.3 (bkz: Şekil 1 c) giriş çizgi ile çıkış çizgi arasındaki bağlantı iğne yerine. Bu değiştirme önce sonda üzerinde kap somunu koymuş.
  5. Çıkış boru silindir pompa üzerinde silindir tüpte bağlayın. Enjektör pompa 10 µL/dk ve daha sonra biraz daha yavaş akış hızı (9,5-9,8 µL/dak), silindir pompa başlatmak. Sonda girdiğinizde kurtarma etkileyebilecek tüm boru içinde tüm hava kabarcıkları kaldırdığınızdan emin olun.
  6. Adım 1.2 olduğu gibi aynı şekilde adım 1.12 fareden anestezi. Fare yaka boynuna koy. Cap somun ve kukla yoklama kaldırmak ve yavaş yavaş 3.4 Kılavuzu kanül aracılığıyla gelen bir microdialysis sonda Ekle ve kap somun tutturmak.
  7. Yer içinde belgili tanımlık kafes fare bir ücretsiz taşıma sistemi ve urgan fare yaka ile bağlı. Enjektör pompa ve silindir pompa en az 1 h 3.5. adımda belirtilen akış hızında çalıştırmaya devam.
    Not: ISF koleksiyonu uyanık hayvanlardan elde etmek için bu makalede bir ücretsiz taşıma sistemi, nereye belgili tanımlık kafes büküm üzerinden makaronlar tutmak için bir hayvanın hareket yanıt verir kullanılmaktadır. Alternatif olarak, sıvı swivels çeşitli şirketler için de kullanılabilir.
  8. Silindir pompa ilk durağı ve şırınga pompa. İstenen akış hızını ayarlayın. Şırınga pompa %20 silindir pompa daha hızlı koşmak.
    Not: 1 µL/dk çalıştırırsanız, örneğin, şırınga pompa 1,2 çalıştırmak µL/dak en iyi akış hızı kararlı ampirik olarak her molekül için.
  9. ISF örnekleri toplama: ücretsiz çıkış boru sonuna buzdolabında kesir toplayıcı yerleştirmek.
    Not: Uygun numune hacmi deneyleri çözümlemesi için kullanılan bağlı olarak değişir.
  10. Deneme tamamlanmasından sonra sonda kaldırın. (Fare gerektiği gibi anestezi.)  Fare kurtarma adım 2.11 olduğu gibi işlemek. HPLC veya ELISA gibi yöntemler tarafından toplanan ISF analiz.
  11. Tüm boru microdialysis sonra yıkamak için giriş bağlayın ve tekrar bağlantı ile sonda değiştirerek çıkış makaronlar iğne ve sulandırılmış çamaşır suyu tüm boru çalıştırmak ve daha sonra su ile yıkayın. Kuru ve tekrar tekrar kullanmak üzere saklamak.
    Not: Makaronlar diğer türleri kabul edilir, ancak, BSA perfüzyon arabelleği küçük çaplı makaronlar yapışmasına neden olabilir, böylece bu makaronlar tek kullanımlık kabul edilir. Makaronlar yıpranmış ya da birden fazla kullanım sonra tıkanmış yani akış hızı kullanmadan önce her zaman tutarlı olduğundan emin olun.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Teşvik veya ters microdialysis11,12,13, picrotoxin, GABAA reseptör antagonisti veya Tetradotoksin nöronal aktivite etkisizleştirmek için Na+ kanal engelleyici kullanılmıştır. Tau yayın nöronal aktivite13,14artış tarafından uyarılır gösterilmiştir. Bunlar ile tutarlı 50 µM picrotoxin (PTX) (daha fa...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Microdialysis yüksek molekül ağırlıklı membranlar kesim ile bir itme-çekme modu tarafından ameliyat olmak zorunda, böylece akış hızı doğru ve sürekli önemlidir. Yanlışlık içinde akış oranları hava kabarcık üretimi ve örnek konsantrasyon tutarsızlığına neden olabilir. Akış tutarsız ise, sızıntı için tüm bağlantılarını kontrol edin. Sorun hala devam ederse, yeni probları ve Bacalar ile yeniden başlatmak gerekli olabilir.

Microdilaysis sondalar sürekli...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazar ifşa etmek hiçbir şey vardır.

Teşekkürler

Bu eser tarafından desteklenen '' Grant-in-Aid bilimsel araştırma yenilikçi alanlarda (Beyin Protein eskime ve demans Control)(15H01552) MEXT ve Grant-in-Aid için genç bilim adamları (B) (16K 20969). Yazar Dr David M. Holtzman ve Dr. John R. Cirrito bu yöntem geliştirme sırasında teknik tavsiye için teşekkürler.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
The Univentor 820 MicrosamplerUniventor8303002Refrigerated fraction collector
Syringe pumpKD scientificKDS-101
Roller pumpEicom microdialysisERP-10
Raturn Stand-Alone SystemBASiMD-1409Free-moving system
Dual species cage kitBASiCX-1600
AtmosLM Microdialysis probe (shaft length 8 mm, membrane length 2 mm)Eicom microdialysisPEP-8-02Shaft length for a probe, a guide, a dumy probe and a stereotaxic adaptor should be identical.
Microdialysis guide (shaft length 8 mm)Eicom microdialysisPEG-8
Microdialysis dummy probe (shaft length 8 mm)Eicom microdialysisPED-8
Bone screwBASiMD-1310
Super bond C&B setSunmedicalDental cement
Small animal Stereotaxic Instrument with digital display consoleKopfModel 940Stereotaxic apparatus
Mouse and neonatal rat adaptorStoelting51625
Standard Ear Bars and Rubber Tips for Mouse StereotaxicStoelting51648
Albumin solution from bovine serumSigmaA7284-50ML30% BSA solution
FEP tubing (70 cm)Eicom microdialysisJF-10-70Internal volume = 0.5 µL/cm
Teflon tubing (50 cm)Eicom microdialysisJT-10-50Internal volume = 0.08 µL/cm
Byton tubeEicom microdialysisJB-30
Intramedic luer stab adaptor 23GBD427565Blunt end needle
Roller tubeEicom microdialysisRT-5SInternal volume = 4 µL
Cap nutEicom microdialysisAC-5
0.25 mL microcentrifuge tube with capQSP503-QTubes for fraction collector
Sterotaxic adaptor (shaft length 8 mm)Eicom microdialysisPESG-8
Connection needleEicom microdialysisRTJ
Mouse animal collarBASiMD-1365
High Speed Rotary Micromotor kitFOREDOMK.1070Drill
PicrotoxinSigmaP1675
Screw driver for bone screws
Scalpel
Cotton swab
Surgical clipper

Referanslar

  1. Lei, Y., Han, H., Yuan, F., Javeed, A., Zhao, Y. The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications. Progress in Neurobiology. 157, 230-246 (2017).
  2. Kushikata, T., Hirota, K. Neuropeptide microdialysis in free-moving animals. Methods in Molecular Biology. 789, 261-269 (2011).
  3. Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
  4. Emmanouilidou, E., et al. Assessment of α-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma. PLoS One. 6 (7), 1-9 (2011).
  5. Yamada, K., et al. In vivo microdialysis reveals age-dependent decrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenic mice. The Journal of Neuroscience. 31 (37), 13110-13117 (2011).
  6. Ulrich, J. D., et al. In vivo measurement of apolipoprotein E from the brain interstitial fluid using microdialysis. Molecular Neurodegeneration. 8 (1), 13(2013).
  7. Emmanouilidou, E., et al. GABA transmission via ATP-dependent K+ channels regulates α-synuclein secretion in mouse striatum. Brain. 139 (3), 871-890 (2016).
  8. Takeda, S., et al. Seed-competent high-molecular-weight tau species accumulates in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's disease mouse model and human patients. Annals of Neurology. 80 (3), 355-367 (2016).
  9. Yamada, K. In vivo Microdialysis of brain interstitial fluid for the determination of extracellular tau levels. Methods in Molecular Biology. 1523, 285-296 (2017).
  10. Kang, J. -E., et al. Amyloid-β dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle. Science. 326 (November), 1005-1008 (2009).
  11. Cirrito, J. R., et al. Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo. Neuron. 48 (6), 913-922 (2005).
  12. Bero, A. W., et al. Neuronal activity regulates the regional vulnerability to amyloid-β deposition. Nature Neuroscience. 14 (6), 750-756 (2011).
  13. Yamada, K., et al. Neuronal activity regulates extracellular tau in vivo. Journal of Experimental Medicine. 211 (3), 387-393 (2014).
  14. Pooler, A. M., Phillips, E. C., Lau, D. H. W., Noble, W., Hanger, D. P. Physiological release of endogenous tau is stimulated by neuronal activity. EMBO Reports. 14 (4), 389-394 (2013).
  15. Castellano, J. M., et al. Human apoE isoforms differentially regulate brain amyloid-β peptide clearance. Science Translational Medicine. 3 (89), 89ra57(2011).
  16. Yamada, K., et al. Analysis of in vivo turnover of tau in a mouse model of tauopathy. Molecular Neurodegeneration. 10 (1), 55(2015).
  17. Taylor, H., et al. Investigating local and long-range neuronal network dynamics by simultaneous optogenetics, reverse microdialysis and silicon probe recordings in vivo. Journal of Neuroscience Methods. 235, 83-91 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Neurosciencesay 139Microdialysisbeyin interstisyel s vy ksek molek l a rl klstereotaksik cerrahin rolojiktau

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır