Diseksiyon artırıcı işlevi hücre hatlarında Multiplex artırıcı CRISPR tabanlı girişim kullanma

Özet

Bu iletişim kuralını tasarlayın ve çoğaltılmış arttırıcılar deactivating füzyon protein SID4X-dCas9-KRAB, olarak da bilinen artırıcı girişim (Enhancer-i) ile hedefleme gerçekleştirmek için gereken adımları açıklar. Bu iletişim kuralı gen ekspresyonu düzenleyen arttırıcılar tanımlaması sağlar ve ortak bir hedef geni düzenleyen arttırıcılar arasındaki ilişkileri diseksiyon kolaylaştırır.

Özet

Birden çok arttırıcılar, genellikle belirli bir gen düzenleyen henüz çoğu genler için bu hangi arttırıcılar gen ekspresyonu için gereklidir ve bu arttırıcılar transkripsiyon bir yanıt üretmek için birleştirmek nasıl belirsizdir. Arttırıcılar milyonlarca tanımlandığı gibi yüksek üretilen iş araçları bir genom geniş ölçekte artırıcı işlevini belirlemek için gereklidir. Nükleaz-usta Cas9 kullanarak genetik silme işlemlerini yapma artırıcı işlev eğitim için geçerli yöntemleri içerir, ancak birden çok ardışık klonal hücre satırı olmalıdır gibi bu tekniği kullanarak birden çok arttırıcılar Kombinatorik etkileri çalışma zordur oluşturulan. Burada, Enhancer-i, onların endojen loci, aynı anda birden fazla arttırıcılar fonksiyonel sorgulama için izin veren bir CRISPR parazit tabanlı yöntem mevcut. Artırıcı-i nükleaz eksikliği için erimiş iki baskıcı etki alanlarının Cas9, SID ve KRAB, artırıcı deaktivasyon histon deasetilasyonu hedeflenen loci, üzerinden elde etmek için kullanır. Bu iletişim kuralı Kılavuzu RNA'lar hedef bölgeleri geçici inactivation etkinleştirmek için geçici transfection kullanır ve doku kültürü ayarları uyaranların indüklenebilir transkripsiyon yanıtlarını engelleme özellikle etkilidir. Artırıcı-i genomik hedefleme ve küresel gen ekspresyonu üzerindeki etkileri hem de çok özel. Bu iletişim kuralı elde edilen sonuçlar bir artırıcı gen ekspresyonu, katkı büyüklüğü ve katkı tarafından yakındaki diğer arttırıcılar nasıl etkilenir katkıda olup olmadığını anlamak için yardımcı.

Giriş

Büyük ölçekli projeler kodla¹, yol haritası Epigenomics²ve FANTOM gibi sıralama³ belirledik insan genomu içinde sözde arttırıcılar milyonlarca hücre türleri yüzlerce arasında. Bu her organizatörü ortalama 4,9 arttırıcılar ile ilişkilendirir ve gen ekspresyonu kez birden çok dağıtılmış düzenleyici etkileşimleri bütünleştirilmesi sonucu olduğunu düşündüren her artırıcı ortalama 2.4 genler³, ilgili kişileri tahmin edilmektedir. Bir önemli kalan sadece tek tek nasıl arttırıcılar gen ekspresyonu için katkıda tanımlamak için mücadeledir ama nasıl ifade etkiler için birleştirir. Genetik yaklaşımlar arttırıcılar fareler⁵ Drosophila⁴ model organizmalarda arasındaki ilişkileri tanımlamak için yaygın olarak kullanılır. Ancak, bu deneyler zaman alıcı ve düşük-üretim için birden çok gen, birden çok arttırıcılar çalışma vardır.

Artırıcı işlevi büyük ölçüde çalışmak için bir yaklaşım kitlesel paralel muhabir deneyleri içerir. Bu deneyleri DNA dizileri için yeteneklerini ifade bir muhabir gen⁶sürücü için binlerce eşzamanlı tarama sağlar. Bu deneyleri DNA dizisi yalnız gen yönetmelik bilgileri⁷iletmek için yeterli olabilir göstermiştir, onlar yerel kromatin bağlam dışında gerçekleştirilen uyarılar ve kapaklı bir organizatörü ile gelmek. Buna ek olarak, DNA dizisi kitlesel paralel muhabir deneyleri içinde analiz ediliyor genellikle ilgili çevresindeki sıra hariç tutabilirsiniz az 200 basepairs boyutudur. Muhabir deneyleri sadece bir dizi etkinlik teker teker ölçmek. gibi önemlisi, onlar dikkate arttırıcılar arasında bulunabilir karmaşık ilişkiler yapmak değil almak. Kitlesel paralel muhabir deneyleri bir DNA dizisi içsel etkinlikler hakkında bilgilendirici olabilir, böylece, onlar mutlaka bize o DNA dizisi genom bağlamında işlev bilgi yok.

Son zamanlarda gelişmiş CRISPR/Cas9 Araçlar⁸ kolaylaştırdı gen düzenlemesi çalışmanın arttırıcılar endojen odağı, silme için izin kadar. Ancak, aynı anda birden fazla arttırıcılar silme için genomik istikrarsızlık neden olabilir ve zaman alan ardışık artırıcı silmeleri bir tek hücre satırı oluşturmak için. Buna ek olarak, yeni genomik sıra onarım takip silme sitesinde oluşturulur ve bu dizi düzenleyici fonksiyonu kazanç olabilir. Cas9 alternatif versiyonu özellikle gen ekspresyonu,^9,10 etkinleştirme veya^11,12 etki alanlarına Cas9 nükleaz eksikliği şeklinde bastırmak füzyon güvenerek oransal için geliştirilmiştir (dCas9). Bu füzyon proteinler onlar fiziksel olarak DNA dizisi alter, bunun yerine bir düzenleyici bölgesi sorgulamak için epigenetik modüle olarak ve aynı anda birden fazla loci eğitimi için idealdir. En çok kullanılan baskıcı KAP1 Co önleyici karmaşık acemi, baskı ilişkili histon H3 lizin 9 trimethylation (H3K9me3)¹³birikimi teşvik KRAB, birleşimidir. dCas9-KRAB, olarak da bilinen CRISPR girişim¹⁴, hedef ve ekran bireysel arttırıcılar gen ifade^15,16katkılarından dolayı kullanılmıştır; Ancak, bu aynı anda birden çok bölge hedefleme için optimize edilmiş değil. Çok katmanlı CRISPR girişim arttırıcılar, mozaik-seq¹⁷, için bir sürüm tek hücre RNA-seq bir okuma kullanır ama bu teknoloji pahalı ve yalnızca tek hücre düşük duyarlılık nedeniyle son derece ifade genler incelenmesi uygundur RNA-devamı.

Kombinatorik artırıcı işlev bağlamında, östrojen transkripsiyon bir yanıt dissekan için girişim tabanlı bir CRISPR yöntem geliştirmek için çalıştı. Yaklaşık yarısı östrojen duyarlı genlerin birden çok arttırıcılar olabilir östrojen yanıt olarak katılan ve düzenleyici mantık gerektirecektir anlama olduğunu düşündüren östrojen reseptör Alfa (ER) tarafından¹⁸, bağlı 2 veya daha fazla artırıcılar içeren aynı anda birden fazla arttırıcılar hedefleme. İlk çalışmalar CRISPR girişim Organizatör kullanarak tüm rehberleri KRAB-aracılı baskı¹⁹' a eşit derecede duyarlı ettiği gibi dCas9 için ayrı baskıcı etki alanı eklenmesi, etkinliğini kolaylaştırabilir gerekçeli çeşitli arttırıcılar. Histon uyku²¹, işe alım açar gibi Sin3a etkileşim etki alanı, Mad1 (SID)²⁰ hangi transkripsiyon aktivitesiyle ilişkili histon asetil grupları kaldırmak seçtik. Önemlisi, SID'si etki alanı dCas9²² ve TALEs²³erimiş zaman gen ekspresyonu azaltılmasını etkili oldu ve Sin3a artırıcı sıra bağlamlarda²⁴çeşitli güçlü bir baskıcı ortak faktör gösterdi. Biz 10 farklı arttırıcılar ER tarafından bağlı hedeflemek için SID4x-dCas9-KRAB (Enhancer-i) kullanılan ve östrojen transkripsiyon yanıt 4 genler¹⁸için gerekli olan ER bağlayıcı siteleri (ERBS) tanımlar. Biz de östrojen transkripsiyon yanıt üretimde işbirliği siteleri tanımlamak için arttırıcılar kombinasyonları hedefli. En fazla 50 siteler potansiyel olarak aynı anda tespit gen ifade değişikliklerle hedeflenebilir ki bulduk. ChIP-seq ve RNA-seq kullanarak, Enhancer-i aynı anda birden fazla arttırıcılar eğitim için çok özel bir teknik olduğunu gösterdi.

Bu protokol için Enhancer-i, bir doku kültürü ortamında aynı anda birden fazla arttırıcılar fonksiyonel çalışma sağlayan esnek bir teknik gerçekleştirme adımları açıklar. Artırıcı-i genetik silme işlemine son derece ilişkilidir ama histon uyku (HDACs) üzerinde bağlıdır geçici etkinliğini kaldırmayı sağlar. Kılavuzu RNA'ların aksine viral vektörler aracılığıyla kararlı tümleştirme geçici transfection üzerinden sunarak, bu iletişim kuralı ifade ve potansiyel H3K9me3 yayılmasını önler. Bu protokolü ayrıntılar kılavuzu RNA tasarım ve Gibson derleme yolu ile transfection, klonlama RNA'ların lipofection kullanma kılavuzu ve qPCR tarafından elde edilen gen ekspresyon Analizi değiştirir. Biz de Enhancer-i genom ve transcriptome düzeyinde hedefleme özgüllüğü değerlendirmek için yöntemler içerir. Bu teknik eğitim için geliştirilen gen düzenlemesi er arttırıcılar insan kanser hücre hatlarında bağlı, herhangi bir memeli artırıcı diseksiyon için geçerlidir.

Protokol

1. stabil SID4X-dCas9-KRAB ifade nesil hücre hatları

Not: Burada sunulan ilaç konsantrasyonları ve transfection koşulları Ishikawa hücreler için bir rahim kanseri hücre kültürünü RPMI 1640 medya % 10 FBS ve % 1 penisilin/streptomisin ile (tam RPMI) takıma yetiştirilen optimize edilmiştir. Diğer hücre hatları farklı transfection koşulları ve ilaç konsantrasyonları gerektirebilir. Kullanıcı-ebilmek da yapmak geçici transfection deneyler vahşi tipi hücrelere, SID4X-dCas9-KRAB yanı sıra plazmidleri ifade Kılavuzu RNA ifade bir plazmid ile istikrarlı hücre kültürünü oluşturmak yerine; Ancak, geçici transfections sonuçlarından transfection tarafından SID4X-dCas9-KRAB düzeyleri farklılık gösterebilir olarak yeniden oluşturulması zor olabilir.

1. 6-şey plaka tam RPMI 3 ml (yaklaşık 300.000 Ishikawa hücreleri) % 30-50 kesiştiği yerde, en az 2 kuyu hücrelerde Ishikawa plaka.
   1. Hücreleri medyadan Aspire edin. 1 x PBS (pH 7,4) bir kez hücrelerle yıkayın. PBS Aspire edin ve tripsin (4 mL 10 cm yemek için ya da bir T-75 şişesi için 5 mL) ekleyin.
   2. ~ 5 dk 37 ° c, her 2 dk müstakil hücreler için kontrol ve hafifçe sallayarak gemi için hücreleri kuluçkaya.
   3. Hücreleri ayırdıktan sonra hücreleri yukarı ve aşağı birkaç kez ve yavaşça aşağı ekli hücreler serbest bırakmak için gemi yan pipet pipet trypsinized.
   4. Hücreleri 15 mL konik tüp aktarmak ve spin hücreleri aşağı vasıl 250 x g 5 min için.
   5. Tripsin Aspire edin ve 5-10 mL medya hücrelerde resuspend. P1000 pipet gerekirse hücre kümeleri ayırmak için kullanın.
   6. Hücreleri saymak ve birimin başına toplam hacmi 3 mL kuyuda ~ 300.000 hücre plaka için gerekli belirlemek. Hücreleri bir 6-şey plaka 2 ayrı wells için ekleyin. Her doldurmak tam RPMI ile 3 mL için de.
   7. Yavaşça plaka her 5 dk sonra hücreleri plaka üzerinde eşit olarak dağıtılır sağlamak için kaplama ilk 15 dk içinde sallamak. Mikroskop hücreleri iyi ortasından dağınık emin olmak için kullanın.
2. Kaplama, 24 h içinde faiz hücre satırı için bir uygun transfection reaktif kullanarak aşağıdaki transfections gerçekleştirin. Ishikawa hücreler için aşağıda açıklanan yordamı kullanın.
   Not: Bu protokol katyonik Lipozom tabanlı transfection reaktifler kullanımı varsayılmaktadır. Elektroporasyon bu kimyasalları için çok hassas olan veya bu düşük transfection verim lipofection ile sergi hücre türleri için alternatif bir yöntem sağlar. Transfection koşulları faiz artırıcı-i deneyler çalışmadan önce hücre satırı için optimize edilmiş olması gerekir.
   1. SID4X-dCas9-KRAB plazmid 2.5 μg ve 800 bir 1.7 mL Eppendorf Tüp, seyreltik floresan bir protein tüp içinde son hacim 155 µL ve plazmid son konsantrasyonu 0,020 µg/µL serum-ücretsiz medya içine ifade plazmid ng.
   2. Başka bir tüp, pCMV-GFP gibi bir paromisin direnç kaset içermeyen bir plazmid seyreltik 3.3 µg serum-Alerjik medyada tüp son birim 155 µL ve plazmid son konsantrasyonu böyle 0,020 µg/µL.
   3. Kısaca her tüp ve bir microfuge kullanarak aşağı spin.
   4. Transfection reaktif (Tablo reçetesi) 9.9 µL her tüp için ekleyin. Tarafından vortexing düşük hızda kısaca karıştırın. Tüpler spin aşağı bir microfuge ile.
   5. Tüpler, oda sıcaklığında en az 5 dk ama hayır daha--dan 20 dk için kuluçkaya.
   6. Biyogüvenlik kabini, hazırlanan DNA: reaktif karışımı 150 µL dropwise 6-şey plaka üzerinde bir şey ekleyin. Hazırlanan DNA: reaktif mix diğer tüp için yineleyin. Yavaşça dönen tarafından plakaları mix ve plaka da kuluçka için dönmek.
3. 2. gün sonrası transfection, medya değiştirmek ve G418 ile 600 ng/μL son bir konsantrasyon için ek. Bu konsantrasyon hücre türü için optimize edilmiş olması gerekir.
4. Komple RPMI medya değiştirmek ve G418 ile iki günde 2-4 hafta kadar transfected kontrol hücreleri öldü ve SID4X-dCas9-KRAB içeren wells konfluent olmak için ek. Hücreleri kurtarmak gereken süreyi tam hücreleri katlama zamanında bağlı olacaktır.
5. Ne zaman konfluent, haline hücreleri bir T-25 veya T-75 gemisine geçit G418 daha düşük bir doz ile RPMI tamamlamak (300 ng/μL Ishikawa hücreler için). Bu geçiş sırasında 2 aliquots ~ 100.000 hücre sırasıyla her (yaklaşık 1/10^th 6-şey plaka) 2 ayrı 1.7 mL Eppendorf tüpleri içine RNA ve DNA izolasyonu için yapmak. Bu tüpler (5 dk, 250 x g) aşağı spin, pipetting tarafından tripsin kaldırmak ve tüpler ileride kullanmak için-20 ° C'de dondurmak.
6. Piyasada kitleri kullanarak genomik DNA izole ve hücre kültürünü PCR füzyon protein içinde varlığını doğrulamak için "pAC95_PCR" veya "SID4X_PCR" astar (Tablo 1) kullanarak gerçekleştirebilirsiniz. Genomik DNA ebeveyn satırından bir negatif kontrol olarak çıkarılan ve SID4x-dCas9-KRAB plazmid DNA olumlu bir denetimi kullanın. Yüksek sadakat polimeraz ana karışımı ile 50-100 ng genomik DNA ve aşağıdaki Bisiklet koşullarını kullanın: 30 98 ° C 25 s, devir (98 ° C 10 s, 30 58 ° C s, 2 dk 72 ° C), 5 min için 72 ° C , 4 ° C'de tutun
7. RNA düzeyinde füzyon proteinin ifade doğrulamak için piyasada kitleri kullanarak hücre satırından çıkarılan RNA ile qPCR gerçekleştirin. "DCas9_qPCR" astar (Tablo 1) ve bu protokol 6.3 adımda sağlanan tek adımlı qPCR protokolü kullanın.
8. Füzyon proteini düzeyi ifade doğrulamak için bir Western gerçekleştirmek lysates hücre satırından leke. Anti-bayrak veya anti-HA antikorlar füzyon protein algılamak için.

2. Kılavuzu RNA tasarım

Not: Bu protokol vektör kilise laboratuvar tarafından oluşturulan ve Addgene (Addgene 41824) üzerinde kullanılabilir klonlama U6 Kılavuzu RNA ile kullanılmak için tasarlanmıştır. Bu vektör 41824 olarak aynı klonlama stratejisi için izin puromisindir direnç içeren bir sürümünü oluşturmak için birden çok klonlama site bu vektör (Addgene 51133) pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromisindir vektör taşındık. Ya Addgene 41824 ya da puromisindir (Addgene 106404) ile bizim yorum aşağıda özetlenen klonlama stratejisi ile uyumlu.

1. 600-900 basepairs ilgi düzenleyici her bölge için DNA dizisinin elde edilir. Transkripsiyon faktörü bağlayıcı siteleri ve/veya kromatin erişilebilirlik Kılavuzu olarak faiz (Şekil 2A) bölgesi tanımlamak kullanın.
   Not: örnek Şekil 2A , upstream ve downstream arttırıcılar özellikleri olsa da, düzenleyici elemanlarının intron içinde bulunan hedef mümkündür.
2. Bir tek metin dosyasında FASTA biçimi kullanılarak elde edilen tüm dizileri yerleştirin.
3. Faiz hücre hattında ifade değil bir gen bir organizatörü gibi deneysel koşullar üzerinden değiştirmek için beklenen en az bir negatif kontrol bölgesi tanımlayın. Bu bölge için DNA dizisi edinmek ve FASTA biçiminde metin dosyasına ekleyin.
   Not: Kılavuzu bir negatif kontrol tüm bölgelerin biz hedef olarak IL1RN organizatörü²⁵ hedefleme RNA'ları kullanın. Kullanıcı-ebilmek da seçme transkripsiyon faktörü bağlayıcı siteleri negatif bir denetimi içermiyor ilgi bölgenin yakınındaki intergenic sıra. Ancak, birden çok loci aynı anda hedef alınmaktadır, bir tek negatif kontrol bölgesi deneysel tasarım ve yorumlanması sonuçları basitleştirir. Hedeflenen artırıcı intronic ise, intronic bir bölge, bir sözde düzenleyici dCas9 füzyon olarak ek bir negatif kontrol olarak içermiyor aynı locus transkripsiyon ile girişime neden olabilir hedef için yararlı olabilir.
4. Faiz düzenleyici bölgelerinde sözde hedefler Rehberleri veya yüksek faiz hücre hattında transkripsiyonu genlerin rehberleri gibi pozitif kontrol bölgeleri tanımlayın. Bu bölgeler için DNA dizisi edinmek ve FASTA biçiminde metin dosyasına ekleyin.
5. Kılavuzu RNA'ların düşük kapalı-hedeflerle (ideal olarak 0-3) bulmak için oluşturulan DNA dizileri üzerinde e-net²⁶ (http://www.e-crisp.org/E-CRISP/) gibi bir program kullanın. Kılavuzu RNA'ların hangi S. pyogenesüzerinden dCas9 için "NGG" biçiminde bir protospacer bitişik motifi (PAM), 20 nükleotit akıntıya karşı oluşur.
   1. E-net Web sitesinde açılır menüsünü kullanarak faiz organizmanın seçin. Genom derleme türün adı görüntülenir.
   2. Giriş FASTA sırasıdır radyo düğmesini seçin. Yukarıdan FASTA dizileri kopyalamak ve onları iletişim kutusuna yapıştırın. FASTA üstbilgi her sıra için dahil olduğundan emin olun.
      Not: aynı anda en fazla 50 dizileri sorgulanabilir.
   3. Orta radyo düğmesini ve tek tasarım aþaðý açýlan menüsünden seçin.
   4. SgRNA Aramayı Başlatdüğmesini tıklatın. Yeni bir tarayıcı sekmesinde açılır ve sonuçlar görüntülenir. Aday dizileri birlikte tüm sorgu sıralarının bir biçimlendirilmiş Excel sekmeli rapor Downloaddüğmesini tıklatarak yükleyin.
   5. Excel veya bir metin düzenleme programı kullanarak sekmeli rapor açın.
6. BLAT aday tam uzunlukta gRNA serileri (23 basepairs) genom UCSC genom tarayıcı kullanın.
   1. Bir tarayıcıda UCSC genom tarayıcı web (http://genome.ucsc.edu) sitesine gidin. Bizim araçlarbölümünün altında BLAT kelime bulun ve tıklayın. BLAT arama aracı açılır.
   2. Faiz organizma ve genom Meclisi seçmek için BLAT arama genom metin altında yer alan aşağı açılan menüleri kullanın.
   3. E-net tarafından döndürülen sekmeli rapor Kılavuzu RNA dizileri kopyalamak ve onları iletişim kutusuna yapıştırın. Her sıra iletişim kutusunun altındaki Gönder ' i tıklayın benzersiz FASTA üstbilgi olduğundan emin olun.
      Not: en fazla 25 dizileri aynı anda incelenebilir. BLAT arama sonuçları sayfasında hizalamaları her Kılavuzu RNA dizisinin bir hizalama temsil eden her çizgi ile görüntülenir. İdeal olarak, bir hizalama için her kılavuz RNA, RNA kılavuz benzersizliğini gösteren olmalıdır.
   4. Genom içinde birden çok konuma mümkünse hizalama kılavuzları kaçının.
   5. Kılavuzu RNA yerelleştirme ve ilgi bölgede dağıtım incelemek için sorgulanan Kılavuzu RNA'ların biri için Eylemler bölümü altında tarayıcı linkini tıklayınız. Genom tarayıcı görünür ve seçili bir rehber RNA ortalanır. RNA'ların e-net faiz bölgesi içinde tanımlanan diğer Kılavuzu dağılımını görselleştirmenizi için sayfanın üst kısmında uzaklaştır düğmelerini kullanın.
7. Faiz (Şekil 2B) bölge boyunca dağıtılan 4 tercihen üst üste Kılavuzu RNA serileri seçin. Bölgenin ilgi 600 aşarsa, bp, 1-2 ek kılavuzları eklemeyi düşünün. Bu özellikler klonlama işlemi Kılavuzu RNA engel ve verimliliği hedefleyen Kılavuzu RNA azaltmak Kılavuzu RNA'ların homopolymeric uzanır ve aşırı GC içeriğe sahip önlemek.
8. Kılavuzları seçtikten sonra istenen her kılavuz için tam rehber RNA dizisi (23 nukleotid) içeren bir dosya oluşturmak ve 5' nükleotit yanı sıra PAM (NGG) 3' ucundan kaldır. Bu adımı oligo sipariş kolaylaştırır.
9. Aşağıdaki sıralama 5' sonuna oligonükleotid sırası ekleyin: GTGGAAAGGACGAAACACCG.
10. Aşağıdaki sıralama 3' sonuna oligonükleotid sırası ekleyin: GTTTTAGAGCTAGAAATAGC.
    Not: Son dizisi 59 nükleotit uzun ve bak bu gibi olmalıdır: GTGGAAAGGACGAAACACCG-hedef (19 nt)-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC.
11. Enhancer-i ile hedef Düzenleyici her öğe için tasarlanmış en az 4 benzersiz oligonucleotides olduğundan emin olun. Tablo 1' de listelenen "U6_internal" astar ile birlikte bu DNA dizileri sipariş.

3. Kılavuzu RNA klonlama

Not: Kılavuzu RNA Gibson derleme klonlama yüksek verimli kolonileri tabak, başına yüzlerce az varsa kolonileri vektör tek denetimde mevcut ile verimli bizim ellerde olduğu ispatlanmıştır. Böyle verimliliği havuza alınan klonlama sırasında karmaşıklık bakımından önemlidir. Klonlama Gibson derleme bir diğer avantajı kullanıcıların site U6 klonlama vektör eklemek için çalışıyorlar RNA kılavuzdaki kesilmiş bir Restriksiyon enzimi varlığı hakkında endişelenmenize gerek yok olduğunu. Yine de, bu iletişim kuralını geleneksel kısıtlama dayalı istenirse klonlama enzim için adapte edilebilir.

1. Kılavuzu RNA oligos 100 mikron Ultrasaf Su son bir konsantrasyon, yeniden oluşturma (RNase free, DNaz içermeyen). İlgi her bölge için en az 4 ayrı Kılavuzu RNA oligos olmalıdır.
2. Faiz düzenleyici her bölge için faiz bölgesine karşılık gelen tüm oligos havuzu oluşturun. Bir Eppendorf tüp her bireysel Sulandırılan Kılavuzu RNA oligo her bölge için 5 μL birleştirin. Havuzun de vortexing tarafından mix sonra 1 μL kaldırmak ve bu aliquot 1: 200 Ultrasaf Su oranında seyreltin.
   Not: arzu edilirse, bireysel düzenleyici bölgeleri hedefleme bu havuzları daha da birden çok bölge hedefleme karmaşık bir havuz oluşturmak için kombine edilebilir. En fazla 50 düzenleyici bölgeler aynı anda tek bir havuzda (Şekil 3 c) hedefleyebilir.
3. Gibson derleme önce oligos Homoloji bölgeleri eklemek için kısa bir PCR U6 astar ile gerçekleştirin. Yaklaşık 40 üsleri U6 vektör her iki ucundaki için yeterli Homoloji içerir ~ 100 bp ürün verimli her oligo eklenir.
   1. Her kılavuz RNA havuzu için aşağıdaki bileşenleri ve bir yüksek-sadakat polimeraz ana karışım ile 20 μL PCR ayarlayın: 1 μL seyreltilmiş oligo havuzunun adım 3.2, 1 μL U6 ileri astar (10 mikron), 1 μL U6 ters astar (10 mikron) ve ilâ 20 μL su.
   2. Aşağıdaki koşullar ile termal cycler kuluçkaya: 98 ° C 30 10 s, devir (98 ° C 10 s, 30 55 ° C s, 2 dk 72 ° C), 5 min ve tutun 4 ° C'de 72 ° C
   3. Reaksiyon 5 μL % 1-2 özel jel düşük moleküler ağırlıklı merdiven ile çalıştırın. Nihai ürün ~ 100 basepairs (Şekil 2C) olmalıdır.
   4. Uzantısı tepki sütunlara göre DNA arıtma kiti ile temizleme ve 20 μL kit ile sağlanan elüsyon arabelleği elute.
      Not: ürün kısa olduğu için boncuk tabanlı temiz-100'den küçük küçük parçaları dışlamak için tasarlanmış olan ups, kullanmaktan kaçının bp.
   5. Bir yer veya spektrofotometre kullanarak saf DNA ölçmek (10-20 ng/μL verimidir beklenen). Kılavuzu RNA ekler-20 ° C'de depolanan veya hemen Gibson derleme Doğrusallaştırılmış U6 vektör ile kullanılabilir.
4. U6 klonlama vektör Gibson derleme için alıcı hazırlamak için Restriksiyon enzimi Özet kadar ayarla. Gibson derleme tepki yapılması için birden çok digests kadar kesme vektör yeterli verim sağlamak için küme.
   1. AflII enzim 20 birim ve plazmid 1 μg 20 μL tepki uygun Restriksiyon enzimi arabelleği ile kullanın. 1-2 h 37 ° C'de kuluçkaya.
   2. "Denemeler" den boncuk veya sütunlara göre kit DNA arıtma ile temizleme ve elüsyon arabellek 20 μL içinde elute. Bir yer veya spektrofotometre kullanarak saf DNA ölçmek. Örnekleri daha sonra kullanmak için-20 ° C'de donmuş olabilir.
5. Gibson derleme üzerinde hazırlanan vektör gerçekleştirmek ve takın.
   1. Gibson derleme reaksiyonlar kadar buz üzerinde ayarlayın. Vektör ve 7'in kullanım 50 ng ng 20 μL tepki ekleme. Ekler 1:10 pipetting kolaylaştırmak için Ultrasaf Su oranında seyreltin. 50 kullanarak bir vektör tek Gibson derleme reaksiyonu, ayarla ng vektör ve su ile takılması.
   2. Gibson derleme reaksiyonlar 4 ° C'de beklemeye ardından 50 ° C'de 15 dakika kuluçkaya
   3. Buz için birleştirilmiş ürünler aktarın. Birleştirilmiş ürünleri 1:4 buzda Ultrasaf Su oranında seyreltin. Örneğin, Gibson derleme ürünün 5 μL Ultrasaf Su 15 μL için ekleyin.
6. Seyreltilmiş Gibson montaj ürünleri dönüşümü.
   1. Yüksek verim yetkili hücreler buz çözme ve 25 μL aliquots her dönüşüm yapmak. Birden çok site hedefleme karmaşık bir havuzu isterseniz, yeterince hücre aynı karmaşık gRNA havuzu birden çok bağımsız dönüşümleri gerçekleştirmek için farklı tüpler içine çözülme.
   2. Seyreltilmiş her ürün için bir 1.7 mL Eppendorf tüp 25 μL yetkili hücre içeren bu seyreltme 1 μL ekleyin. Kısaca tüp flicking tarafından karıştırın. Tüpler 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya.
   3. Isı şok 30 için hücreleri 42 ° c, s sonra transfer hemen 2 min için buz.
   4. 300 μL SOC kitle (%2 tryptone, % 0.5 maya ekstresi, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, MgSO₄10 mM ve 20 mM glikoz) eklemek ve yeniden elde etmek için 1 h 37 ° C'de (300 rpm) sallayarak ile hücreleri. Bu süre boyunca, ampisilin/carbenicillin için bir kuluçka 37 ° C ile ağar kaplamalar sıcak. Bir tabak her dönüştürme için kullanın.
   5. Hücre 50 μL plaka ve Plaka 37 ° C kuluçka makinesine gecede yerleştirin. Tek tek siteleri hedefleme havuzlar için doğrudan 3-5 ampisilin/carbenicillin (1 mg/mL) içeren mL LB suyu (Malzemeler tablo) yerleştirin ve bir gecede minipreps için 37 ° C'de 250 rpm'de sallayarak ile kuluçkaya.
7. Hücreleri hasat ve DNA izole.
   1. Birden çok site hedefleme büyük kılavuzu RNA kitaplıkları için bir plaka kazıyıcı tüm kolonileri bireysel her tabaktan bir maxiprep (150 mL sıvı kültür) toplamak için kullanın. Bu uygun antibiyotik ile dökme ~ 5 mL lb tarafından 50 mL şahin tüp ve koloniler tüpün içine kazıma kolaylaştırılabilir. Tek tek siteleri hedefleme kitaplıkları için tabakları miniprep (3-5 mL sıvı kültür) kazı.
   2. Bu kültürler 250 devir / dakikada sallayarak ile 3-5 h 37 ° C'de için uygun antibiyotik ile kuluçkaya.
   3. DNA ekstraksiyon endotoksin-Alerjik preps sonuçları bir seti kullanarak gerçekleştirin.
   4. Bir yer veya spektrofotometre kullanarak DNA ölçmek. Plazmid hemen transfection içinde kullanılan ya da ileride kullanmak için-20 ° C'de depolanan.
8. Küçük havuzlar tek siteleri, hedefleme kullanmak için Sanger Kılavuzu RNA dizisinin U6 vektör içinde varlığını doğrulamak için "U6_PCR_R" astar ile hazırlanan miniprep üzerinde sıralama Tablo 1' de listelenen. Kılavuzu RNA'ların havuzu, nedeniyle 19 basepair gRNA hedef sırası karışık üsleri verecektir ama U6 organizatörü ve bu dizi çevreleyen Kılavuzu RNA iskele sağlam olmalıdır.

4. Enhancer-i transfection

Not: Ishikawa hücrelerde Enhancer-i kullanarak bir östrojen yanıt başarılı abluka için 5-7 gün önce onları fenol kırmızıyla korumak tarafından transfection % 10 ile ücretsiz RPMI kömür-FBS ve % 1 soymak için östrojen hücrelerinin mahrum için gerekli olan penisilin/streptomisin. Hücreler bu ortam sırasında ve transfection sonra östrojen yanıt engellemek çalışıyorsanız kültürlü. İçin RPMI tam fenol red hücrelerde geçirilmesi özgür fenol red ücretsiz tripsin kullanmanızı tavsiye ederiz.

1. Transfection, önceki gün hücreleri (vahşi-türü veya stabil SID4X-dCas9-KRAB ifade) % 30-50 confluency (Evet Ishikawa hücreler için başına ~ 60.000 hücreleri) adlı bir 24-şey plaka plaka. Öyle ki transfections içinde yinelenen gerçekleştirilebilir ve kuyu denetim Kılavuzu RNA'lar ile transfected dahil yeterince hücre plaka.  Hücre kaplama olduğu gibi adım 1.1.7 sonra yavaşça plaka sallayarak hücreleri iyi arasında eşit şekilde dağıtılır emin olun.
   Not: Bu protokol katyonik Lipozom tabanlı transfection reaktifler kullanımı varsayılmaktadır. Elektroporasyon bu reaktifler duyarlıdır hücre türleri için alternatif bir yöntem sağlar. Transfection koşulları faiz artırıcı-i deneyler çalışmadan önce hücre satırı için optimize edilmiş olması gerekir.
2. Ertesi gün, seçim transfection reaktif talimatlara göre transfections hazırlayın. Ishikawa hücreler, her şey bir 24-şey plaka için toplam plazmid kullanım 550 ng için. Plazmid 0,020 μg/μL serum-ücretsiz medya (52 μL transfecting 2 kuyuları için toplam hacminin içinde DNA'ın 1.1 μg) son bir konsantrasyon için sulandırmak. DNA, her 1 μg için transfection reaktif 3 μL kullanın girdap ve 1.2 adımda anlatıldığı gibi kuluçkaya. Her şey için 25 μL son karışımı ekleyin.
   Not: siteleri hedef kombinasyonları için plazmid aynı ağırlık bireysel her site için kullanmak ve sonra bir denetim plazmid (vektör veya kılavuz IL1RN gibi bir negatif kontrol bölge hedefleme RNA'ların klonlama boş Kılavuzu RNA ile artık kilo doldurun faktörü). Geçici transfections için 3:2 Cas9 füzyon: Kılavuzu RNA plazmid oranında kullanın. Plazmid floresan gazetecilere içeren transfection etkinliğini izlemek için eklenebilir.
3. 36 h sonrası transfection değiştirmek fenol red kullanarak medya ile % 10 kömür elimden FBS ve % 1 penisilin/streptomisin (Ishikawa hücreler için) RPMI ücretsiz ve tedarik puromisindir (son konsantrasyonu: 1 μg/mL) ve paromisin (son konsantrasyonu: 300 ng/mL). Hücreleri transfection reaktif için duyarlı iseniz, medya daha önce değiştirilebilir ancak antibiyotik öncesi 24 saat mesaj transfection eklenmelidir.
   Not: hücre hasat önce antibiyotik ekledikten sonra en az 24 saat bekleyin. İfade değişiklikleri Enhancer-i nedeniyle erken 48 h transfection sonrası ve yukarı transfection 5 gün sonrası gibi algılanabilir. Eğer östrojen yoksun Ishikawa hücrelerle çalışma, bir 8-h 10 nM 17β-estradiol (E2) indüksiyon antibiyotik tedavisi ertesi gün gerçekleştirmek ve hücreleri hemen hasat.

5. hücre hasat ve RNA çıkarma

1. % 1 β-mercaptoethanol (BME) ile lizis tampon hazırlayın. Yeterli lizis BME karışımı (her şey hasat için 300 μL) olduğundan emin olun.
2. Bir vakum aspiratör kullanarak ortamın Aspire edin.
3. 1 x PBS eşit bir hacmi bir kez hücrelerle yıkayın (500 μL) ve mümkün olduğu kadar PBS kaldırmak için Aspire edin.
4. 300 μL lizis BME çözüm bir çok kanallı pipet kullanarak her şey ekleyin. Pipette lizis çözüm yukarı ve 8 - 10 kez ve bir derin-şey plaka veya 1.7 mL Eppendorf tüpleri buzda. RNA hemen elde edilebilir veya lysates gelecek işlenmek-80 ° C'de donmuş olabilir.
5. RNA lysates ayıklamak için DNaz tedavi içerir bir ticari olarak mevcut kit kullanın. En küçük önerilen birim Ultrasaf Su içinde elute (RNase free, DNaz-free) veya tampon ve RNA ölçmek elüsyon. Örnekleri küçük sayılar için bir yer veya spektrofotometre kullanın. Örnekler çok sayıda için RNA ve plaka okuyucu ölçü algılar bir floresan sonda kullanın. Önce veya sonra miktar örnekleri-80 ° C'de donmuş olabilir.

6. gen ifade tek adımlı qPCR ve RNA-seq kullanarak değişiklik miktarının

1. QPCR astar faiz genler ve hedeflenen genler düzeyi ifade edilir ve deneysel koşullar arasında değişmez en az bir temizlik gen elde edilir. İdeal olarak, bu astar genomik DNA amplifikasyon önlemek için bir exon exon junction span.
   1. Bu astar faiz hücre satırından alınan RNA üzerinde sınayın. Kullanım eğrisi Analizi tek bir ürün üretim doğrulamak için eritebilir. Tek bir ürün üretilen değil, ek astar çiftlerini test.
2. Her Enhancer-i ve denetim Kılavuzu RNA tedavi örnek için kaç genler Bu örnekte denetlesinler tanımlayın. Bu set genlerin temizlik genler, CTCF veya GAPDHgibi içermelidir.
3. QPCR reaksiyonlar kadar ayarla.
   1. Su, aynı konsantrasyonu tüm örneklerini seyreltik öyle ki 50 ng toplam RNA'ın kolayca pipetted ve orada yeterli her reaksiyon için RNA seyreltilmiş. Örneğin, RNA ~16.6 ng/μL için sulandırmak ve RNA 3 μL her tepki olarak kullanabilirsiniz. RNA buzda ana karışımları ayarlanırken tutun.
   2. Piyasada bulunan tek adımlı qPCR kitleri kullanarak ölçülecek her gen için ayrı ana karışımları hazırlayın. 20 μL tepki birim her astar (10 μm kalınlığında stok çözelti) 1 μL ile kullanın. Bu tepkiler kadar buz üzerinde ayarlayın.
   3. Termal cycler için uygun bir tepki tabak içinde ana karışımları tarafından takip RNA örnekleri ekleyin. Bir plaka mühürleyen ile mühür ve karışımı yavaşça vortexing veya pipetting tarafından. Kısaca plaka santrifüj kapasitesi (140 x g 60 s) o sıvı sağlamaktır kuyu dibinde.
   4. Aşağıdaki gibi bir termal cycler plaka kuluçkaya (veya kit bildirir): 40 30 dk, 95 ° C 10 dk için için 48 ° C döngüleri (95 ° C 15 s, 1 dk. için 60 ° C).
4. Her örnek içinde ölçülen her gen için CT değerler edinin. Gen ifadesinin değişiklikleri tanımlamak için karşılaştırmalı Ct yöntemini kullanın.
   1. Oda temizliği gene normalleştirilmiş Ct değerleri oluşturmak için CT her genin her örnek için ilgi Ct çıkarma.
   2. Tedavi kontrol örnekleri için Ortalama her gen için normalleştirilmiş Ct değerlerden al. Günlük temel 2 ölçek kat baskı sonra her gen tedavi denetimi örneğini ilgili gen için aynı değeri için normalleştirilmiş Enhancer-i tedavi örnek Ct çıkararak hesaplanır.
5. Gen ifadesinin Enhancer-i tedavi aşağıdaki küresel değişiklikleri belirlemek için RNA sıralama Kullanıcı sıralama teknolojisi ile uyumlu bir ticari olarak mevcut kit kullanarak örnekleri hazırlanın. Malzeme başlatmak için kullan ~ 500 ng RNA'ın hazırlayıp kitaplıkları için en az 2 biyolojik çoğaltır.

7. SID4X-dCas9-KRAB kullanarak ChIP-seq tarafından belirli genomik hedefleme doğrulama

Not: SID4X-dCas9-KRAB füzyon proteini bir bayrak epitope etiketi ve bir HA epitope etiketi içerir, ancak en iyi sonuçlar için ChIP-seq Anti-bayrak antikorlar ile elde edilmiştir. İstenirse, Kullanıcı potansiyel Enhancer-i tarafından etkilenen transkripsiyon faktörleri ya da H3K27ac, bir işareti Enhancer-i tarafından azalır arttırıcı faaliyet ek ChIP-seq deneyler gerçekleştirebilirsiniz. Ancak, her küçük parça-seq deney 10 x 10⁶ hücreler, bu planı buna göre gerektirir.

1. Hücreleri Enhancer-i havuzları ile transfect.
   1. 15 cm doku kültürü tabak tabak 10 x 10⁶ hücreler. Her yemeğin 1 ChIP-seq deneme için 1 faktör faiz temsil eder.
   2. Ertesi gün, toplam DNA'ın 20 μg çanak kullanarak hücreleri transfect. Stabil SID4X-dCas9-KRAB ifade hücre hatlarında transfections için DNA plazmid havuz Rehberi ilgi tüm siteleri hedefleme RNA'ların ve isteğe bağlı bir plazmid floresan protein ifade etmek gerekir. Geçici transfections için 3:2 dCas9 füzyon protein: Kılavuzu RNA havuzu oranında kullanın. ChIP-seq için diğer TFs veya histon değişiklikler, en az bir ek denetim Kılavuzu RNA transfection başka bir tabak üzerinde gerçekleştirin.
   3. Yemekleri puromisindir (1 μg/mL) ve 24-48 h mesaj transfection de paromisin (300 ng/mL) ile tedavi. Kromatin hasat daha önce en az 24 saat bekleyin.
2. Kromatin yemeklerin hasat.
   Not: Ishikawa hücrelerdeki ER genomik bağlama Enhancer-i etkilerini incelemek, yemeklerden 1 saat 10 nM E2 tedavi gerçekleştirmek için denetim Kılavuzu RNA'ların ve Enhancer-i rahip ile hasat için transfected. H3K27ac Enhancer-i etkilerini incelemek, yemeklerden bir 8 h 10 nM E2 indüksiyon gerçekleştirmek için denetim Kılavuzu RNA'ların ve Enhancer-i rahip ile hasat için transfected.
   1. % 37 formaldehit 500 μL her yemeğin (son konsantrasyonu % 1'lik) Uygula. Tabakları kısaca girdap. Oda sıcaklığında 10 dakika için oturup plakaları ver.
   2. 1 mL 2.5 M glisin (125 mM son konsantrasyonu) ekleyin. Tabakları kısaca girdap.
   3. Medya formaldehit ve glisin ile kapalı dökün. Soğuk 1 x PBS eşit bir hacmi (~ 20 mL) ekleyin.
   4. PBS dökün. Mümkün olduğu kadar PBS kaldırmak için bir vakum aspiratör ile Aspire edin. Bulaşıkları buza koyun.
   5. 3-5 mL soğuk 1 x PBS veya Farnham lizis tampon ekleyin (5mM borular pH 8.0, 85 mM KCl, % 0,5 NP-40) 1 x her plaka proteaz inhibitörü (sadece kullanmadan önce eklendi). Çanak tabak sıyırıcı scrape ve çözüm 15 mL konik tüp buz üzerinde transfer.
   6. Kromatin iplik tüpler santrifüj 1000 x g. atma, 4 ° C'de 5 dakika içinde aşağı tarafından süpernatant cips ve granül-80 ° c ileride kullanmak üzere saklamak ya da bir anti-bayrak antikor veya diğer hedefleme antikorları kullanarak seçim ChIP-seq protokolü ile devam transkripsiyon faktörleri veya histon değişiklikler ilgi (H3K27ac, H3K9me3).

Sonuçlar

Şekil 1 bir şematik iletişim kuralında tanımlanan iş akışı gösterir. ER-bağlı arttırıcılar östrojen düzenlenir gen ChIP-seq (Şekil 2A) ile tanımlanan 3 bağlayıcı siteleri yakın olan MMP17, yakınındaki katkılarıyla RNA'ların yol belirlemek için her bölge için dizayn edilmiştir. Kılavuzu RNA'lar, sıra her ER çevreleyen bir 600-900 bp pencere tasarlamak için ilgi bağlama sitesi seçilen ve Kılavuzu RNA tasarım programına. Kılavuzu kaynaklanan RNA 0-2 hedeften siteleri BLAT kullanarak insan genomu uyumlu tahmin diziler. Dört üst üste rehberlik ChIP-seq tarafından tanımlanmış bölgesine yayılmış RNA'ların ve DNaseI aşırı duyarlılık (Şekil 2B) hedefleme için seçildi. (Tablo 1) ek sırası aşağı akım klonlama ve sonucu olan 59 nükleotit parçaları sipariş edilen kolaylaştırmak için her iki ucu için eklendi. Elimize RNA'ların seyreltilmiş ve site ve kısa bir PCR tarafından havuza alınmış Kılavuzu Homoloji bölgeler önce Gibson derleme eklemek için gerçekleştirildi. Beklenen Kılavuzu RNA ürün dizisinin 20 basepairs 59 basepair her sonuna kadar ekleyecek olan "U6_internal" primerler (Tablo 1), kullanılarak kısa bir PCR sonra Kılavuzu RNA parça, bir ~ 100 basepair sırada ortaya çıkan Şekil 2C gösterir. Gibson derleme, bu kılavuzu RNA havuzları bakteri dönüştürülmüş ve plazmid minipreps ertesi gün hazırlanmıştır. Şekil 2B sonuçları nerede MMP17 yakın birden çok arttırıcılar yalnız hedeflenir artırıcı diseksiyon deney ve birlikte Geliștirici-i kullanarak gösterir. Enhancer-i tarafından hedef siteleri ile siyah bir altıgen gösterilir. Belirtilen Site Hedefleme Rehberi RNA plazmid stabil SID4X-dCas9-KRAB ifade bir östrojen yoksun Ishikawa hücre kültürünü transfected. İki gün sonra medya değiştirildi ve puromisindir transfected hücreler için zenginleştirmek için eklendi. Ertesi gün, 8 saat 10 nM estradiol tedavi aşağıdaki hücre hasat edildi. RNA izole edildi ve bir tek adımlı qPCR gerçekleştirildi. Site 3 Bu koşullarda (Şekil 2B, şerit II-IV) katkı sağlamamaktadır Örneğin, siteleri 1 ve 2 MMP17, bir tam östrojenik yanıt için gerekli iken. Ne zaman sadece 2 veya 3 sitelerdir etkin (VI ve VII), östrojen yanıttır ne zaman yok sitelerdir için benzer aktif (VIII), bu sitelerde bağımsız olarak katkıda bulunamaz düşündüren. 1 sitesi bazı ifade katkıda bulunabilir tek başına (v), ama en büyük etkinlik siteleri 1 ve 2 etkin olduğunda görülür (IV).

(Şekil 3A), aynı anda 4 farklı genler yakınındaki 10 arttırıcılar işlemek için RNA'ların karmaşık takımlık rehberlik 42 artırıcı kılavuzları ve 16 organizatörü kılavuzları içeren oluşturulan. Kılavuzu RNA oligos Başlangıç Kılavuzu RNA uzantısı PCR (adım 3.3) önce havuza alınmış ve elde edilen PCR ürünleri Saflaştırılmış ve Gibson derleme kullanarak boş puromisindir U6 klonlama vektör ile kombine. Gibson derleme birden çok bağımsız dönüşümleri gerçekleştirilen ve kaplama. Tabakları LB kazınmış ve 2-4 h önce maxiprep için dışarı büyümeye izin. Bu kılavuzu RNA havuzları stabil SID4X-dCas9-KRAB ifade bir östrojen yoksun Ishikawa hücre kültürünü transfected ve (Şekil 2B) açıklandığı gibi tedavi Şekil 3B temsilcisi indirimleri gen ifadesinde qPCR tarafından gösterir. İndirimleri Enhancer-i gelen sözde hedef gen organizatörü hedefleyerek elde edilen benzer. Şekil 3 c seyreltme kılavuzun etkileri RNA'ların Enhancer-i kullanarak östrojen yanıt azalma gösterir. 1:50 G0S2 hala yakınındaki artırıcı Hedefleme Rehberi RNA havuzu seyreltme Enhancer-i ilâ 50 hedeflemek için kullanılabilir düşündüren gen ekspresyonu önemli azalma verimleri hemen siteler. Ancak, devre dışı bırakma, daha duyarlı algılama yöntemleri istihdam edilmektedir sürece sitelerin yüzlerce aynı anda hedeflenemediği gösteren seyreltilmiş.

Şekil 1. Protokolü Enhancer-ı. kullanarak çok katmanlı artırıcı diseksiyon için şematik Kılavuzu RNA'ların (kırmızı ve mavi) kullanarak e-net ve seçili UCSC genom tarayıcı kullanarak tasarlanmıştır. Dört kılavuzu RNA'ların bu faiz (ChIP-seq tarafından tanımlanan transkripsiyon faktörü bağlayıcı siteleri) bölgelerinde yayılan seçilir. Faiz (kırmızı ve mavi) bölgeye göre havuza Kılavuzu RNA oligonucleotides Gibson derleme ve dönüşüm önce Homoloji bölgeleri (turuncu) eklemek için bir PCR tabi. Elde edilen plazmid havuzları stabil SID4X-dCas9-KRAB ifade hücre hatları veya vahşi-türü hücre SID4X-dCas9-KRAB plazmid ile birlikte lipofection yolu ile transfected. Kılavuzu RNA plazmid havuzları ayrı ayrı bir zamanda veya aynı anda birden çok site hedeflemek için birlikte tek bir site hedeflemek için transfected. Transfected hücre kılavuzu RNA'ları içeren hücreler için zenginleştirmek için antibiyotik ile tedavi edilir. ~ 72 h sonrası transfection hücre hasat. Nükleik asitler qPCR, RNA-seq veya çip seq. için çıkarılan Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2. Kılavuzu MMP17için RNA tasarım ve artırıcı diseksiyon. (A) genom tarayıcı ekran görüntüsü yakınındaki hedef için ER Alfa bağlı arttırıcılar (gri) MMP17. Bu rakam Carleton, et al. değiştirildi ¹⁸. (B) Kılavuzu RNA siteleri¹⁸bağlama 3 için tasarımlar. Bağlama için ChIP-seq tarafından tanımlandığı şekilde ER hedef ve 4 Kılavuzu RNA'ların kiremit bu bölgede sitedir. Bağlama Makinası açıklıklı, DNaseI hassasiyet sinyali Kılavuzu RNA tasarım için hedef sırasını tanımlamak için de kullanılabilir. ChIP-seq ve DNaseI HS veri ile 10 nM estradiol Homoloji bölgeleri eklemek için kısa bir PCR geçirmiş Gibson montaj için hazır 1 h. (C) temsilcisi Kılavuzu RNA serileri için tedavi Ishikawa hücrelerden elde edilmiştir. (D) MMP17 göreli ifade, özel bölgelerin Enhancer-i ve bir 8-h10 nM estradiol tedavi ile hedefleme takip qPCR ile ölçülür. MMP17 estradiol ile tedavi değil hücrelerdeki CTCF ve ifade düzeyini ifade görelidir. RNA'lar hedef organizatörü denetim Rehberi IL1RN. Tüm hata çubukları SEM temsil eden, çift yıldız belirtmek p < 0,01 ve tek yıldız belirtmek p < 0,05 eşleştirilmiş bir t-test. Bu rakam Carleton, değiştirilmiş ve ark. ¹⁸. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3. Birden çok arttırıcılar ile aynı anda farklı genler yakınındaki hedefleme havuzlu Enhancer-ı. (A) şeması bağlayıcı siteleri ve havuza alınan Enhancer-i içinde var olmak hedef için organizatör. (B) ifade E2 tedavi Ishikawa hücrelerde Enhancer-i plazmid Havuzu (yeşil), organizatörü-i plazmid Havuzu (mavi) veya kontrol gRNAs (beyaz)¹⁸transfected sonra qPCR tarafından ölçülen üzerinde etkileri. Tüm genler önemli bir azalma Enhancer-i ile görülmektedir. Bu rakam Carleton, güncellenmiştir ve ark. ¹⁸. E2 tedaviden sonra G0S2 ifade düzeyleri üzerine etkisi Ishikawa hücrelerde transfected Kılavuzu G0S2hedefleme RNA'ların farklı miktarda (C) . Hatta küçük miktarlarda Kılavuzu RNA ile önemli bir azalma görülebilir (1:50 seyreltme), ilâ düşündüren 50 siteler hedef aynı anda. Tüm hata çubukları SEM temsil eden, çift yıldız belirtmek p < 0,01 ve tek yıldız belirtmek p < 0,05 eşleştirilmiş bir t-test. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Adı	Sıra
U6_internal_F	TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG
U6_internal_R	GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC
U6_PCR_F	CCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTA
U6_PCR_R	AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCA
gRNA_qPCR_F	GCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG
gRNA_qPCR_R	AAAAAGCACCGACTCGGTGCC
dCas9_qPCR_F	GTGACCGAGGGAATGAGAAA
dCas9_qPCR_R	AGCTGCTTCACGGTCACTTT
pAC95_PCR_F	AGAAGAGAAAGGTGGAGGCC
pAC95_PCR_R	CGTCACCGCATGTTAGAAGG
SID4X_PCR_F	CAATAGAAACTGGGCTTGTCG
SID4X_PCR_R	TCGTGCTTCTTATCCTCTTCC

Tablo 1. Kılavuz RNA uzantısı ve sıralama, qPCR ve füzyon protein tespiti için kullanılan astar.

Tartışmalar

Bu iletişim kuralı fiziksel olarak DNA dizisi değiştirmeden artırıcı fonksiyon için endojen genomik locus dissekan için basit ve esnek bir yöntem açıklanır. Benzer olsa da kavram dCas9 KRAB²⁷kullanarak daha önce yayımlanmış CRISPR girişim iletişim kuralları, Enhancer-i 3 ana şekilde bu iletişim kurallarından farklıdır. İlk olarak, Enhancer-i artırıcı devre dışı bırakma ulaşmak için MAD1²⁰ SIN3A etkileşen etki alanı kullanır. Artırıcı devre dışı bırakma HDAC inhibitörleri, devre dışı bırakma birincil mekanizma HDAC bağımlı olduğunu düşündüren kullanarak kurtarıldı. CRISPR dCas9-KRAB müdahale, Enhancer-i H3K9me3 birikimi yol açmaz. Gerçeğini Enhancer-i RNA'ların, transfection 3 gün hasat hücreleri ile göndermek Kılavuzu geçici giriş üzerinde dayanır nedeniyle muhtemeldir. CRISPR müdahale, 7 gün mesaj iletim¹², H3K9me3 bir artış görülmektedir. Son olarak, birden çok siteyi aynı anda hedef ve hedefleme etkinliğini izlemek için bir strateji Enhancer-i Protokolü sağlar. Mozaik-seq¹⁷, dCas9-KRAB aynı anda birden fazla arttırıcılar hedeflemek için kullanılır ama bu tekniği ifade değişiklikleri tanımlamak için tek hücreli RNA sıralama dayanıyor ve (gibi östrojen duyarlı genler) birçok genler nedeniyle düşük undetected gitmek tek hücreli RNA-seq. Enhancer-i duyarlılığını ayrı ayrı ve birlikte herhangi bir gen arttırıcılar çalışmak için güvenilir bir yöntem sağlar.

En kritik artırıcı-i transfection, faiz hücre satırı için optimize edilmelidir adımdır. Puromisindir tedavi transfected hücreler için zenginleştirmek için bu protokolü kullanır ama bu ortak transfecting RNA'ların floresan bir protein ve Kılavuzu akış sitometresi kullanarak floresan hücreleri için sıralama bazı hücre için daha iyi bir zenginleştirme yöntemi olarak kanıtlamak Mayıs mümkündür türleri. İfade düzey kılavuzun RNA'ların ve SID4x-dCas9-KRAB gidermek ve transfection onaylamak için qPCR tarafından izlenmesi tavsiye ediyoruz. Kılavuzu RNA düzeyleri düşüktür (döngüsü eşik > 30), kullanıcılar ayrıca RNA üretim stratejileri vitro transkripsiyon²⁸gibi alternatif Kılavuzu düşünün. Yüksek gRNA düzeyleri rağmen Kılavuzu RNA SID4x-dCas9-KRAB protein verimsiz hedefliyor, bu durumda farklı Seçme Kılavuzu RNA dizilerinin gerekli olabilir olanağı da sağlar. Füzyon proteini ile kromatin Enhancer-i tedavi hücrelerden üzerinde ChIP-seq gerçekleştirerek, hedefleme verimliliğini takip edilebilir. SID4x-dCas9-KRAB adlı bölge ilgi yüksek sinyal ve onun sözde hedef gen ifade değişiklik tespit edilir ise, o zaman büyük olasılıkla bölge okudu koşullar altında bu gen ifadesi için katkı sağlamamaktadır.

Bir potansiyel Enhancer-i çok fazla siteleri aynı anda hedeflenir Eğer hedef kapalı etkileri birikebilir kısıtlamasıdır. Yine de, özellikle dCas9 KRAB ifade poliklonal hücre satırı kullanıldığında CRISPR müdahale stratejileri nakavt için az daha RNAi²⁹, hedef etkileri off olmasını. SID4X-dCas9-KRAB hedef kapalı genomik bağlama 10 site aynı anda hedeflerken gördün mü iken, biz gen ifade değişikliklerin sonucu olarak bağlama olayları belirlenememiştir. Bazı arttırıcılar birden çok organizatör ve/veya diğer arttırıcılar ile temasa geçebilirsiniz, gen düzenlemesi bu tür ortak ise belirsiz olmasına rağmen birçok gen ifade tek bir artırıcı hedefleme üzerine değişebilir mümkündür. İfade değişiklikleri belirli bir artırıcı hedefleme nedeniyle çoğu gözlenen onaylamak ve off-efektler hedef değil için Kullanıcı Kılavuzu aynı bölge hedefleme RNA'ların üst üste iki farklı kümesi ile Enhancer-i gerçekleştirebilirsiniz. Buna ek olarak, nükleaz yetkili Cas9 kullanarak bölge genetik silinmesi daha fazla gen ekspresyonu üzerindeki etkileri onaylayabilirsiniz.

Histon deasetilasyonu, aracılığıyla Enhancer-i işlevleri olarak devre dışı bırakma yetenekleri histon asetilasyon kayda değer düzeyine sahip arttırıcılar sınırlıdır mümkündür. Belirli arttırıcılar hedefleme daha etkili olabilir alternatif baskıcı füzyon çeşitli vardır. DNA metiltransferaz füzyon dCas9 için distal arttırıcılar³⁰' a hedef zaman gen ekspresyonu azaltmak için kullanılabilir, ancak bu baskı genellikle geçici değildir. Başka bir baskıcı füzyon histon H3 lizin 27 trimethylation yol açar..... .şarap gen ekspresyonu dCas9-KRAB için benzer düzeyde hücre satırları ve rehberleri³¹çeşitli, GATA1 arkadaş (FOG1) etki alanı kullanır. İlginçtir, dCas9 için FOG1 daha fazla kopya ekleme rehberleri, SID'si etki alanı tek bir kopyasını şu anda Enhancer-i içinde kullanılan 4 kopya daha daha fazla artırıcı deaktivasyon sağlayabilir düşündüren, baskıcı potansiyel azalır. Bazı loci yukarıdaki dCas9 füzyon farklı kombinasyonları ikili hedefleme üzerinden yararlanabilir mümkündür. Örneğin, istikrarlı uzun vadeli baskı dCas9-DNMT3a ve dCas9-KRAB³²eşzamanlı iletim tarafından elde edilebilir. Bu baskıcı füzyon çoğu sadece tek bir odağı bir anda hedef ve aynı anda birden fazla arttırıcılar manipüle en etkili olduğu belirsizdir.

Kullanıcı genler yüzlerce sözde arttırıcılar çalışma isterse enhancer-i, genler, bir avuç arttırıcılar kombinasyonları çalışmak için uygun bir yöntem ise biraz hala'nın üretimi sınırlı. Bu tekniğin gelecekteki uygulamalar aynı anda birden fazla örnekleri içinde birden çok gen ölçmek için görüntüleme tabanlı teknolojiler dahil edecektir. Önemlisi, bu teknolojilerin zaman alan RNA izolasyon ihtiyacını ortadan kaldırarak RNA molekülleri lysate, üzerinden doğrudan tespiti ile uyumlu. Bu uyarlamalar arttırıcılar büyük kümeleri sorgulama kolaylaştıracaktır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
ZR 96-well Quick-RNA Kit	Zymo Research	R1053
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step	Applied Biosystems	4389986
AflII restriction enzyme	NEB	R0520S
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer	NEB	M0531L
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621L
FuGENE HD	Promega	E2312
DNA Clean & Concentrator Kit	Zymo Research	D4013
Buffer RLT Plus	Qiagen	1053393
b-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758
Human: Ishikawa cells	ECACC	99040201
H3K27ac rabbit polyclonal	Active Motif	39133
H3K9me3 rabbit polyclonal	Abcam	ab8898
FLAG mouse monoclonal	Sigma-Aldrich	F1804
ER alpha rabbit polyclonal	Santa Cruz	sc-544
pGL3-U6-PGK-Puro plasmid	Addgene	51133	Shen et al., 2014
gRNA_cloningVector plasmid	Addgene	41824	Mali et al., 2013
AflII U6 puromycin plasmid	Addgene	106404	Carleton et al., 2017
SID4X-dCas9-KRAB plasmid	Addgene	106399	Carleton et al., 2017
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250-10ML
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	ThermoFisher Scientific	10977-023
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco	31985070
KAPA Stranded mRNA-Seq Kit, with KAPA mRNA Capture Beads	Kapa Biosytems	KK8420
Pierce Protease and Phosphatase Inhibitor Mini Tablets	ThermoFisher Scientific	A32959
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	252549-25ML
Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	10131035
LB Broth	ThermoFisher Scientific	10855001
Quick-DNA Miniprep Kit	Zymo Research	D3020
Quick-Load Purple 2-Log DNA Ladder	NEB	N0050S