Drosophila melanogaster Larval ve yetişkin beyin metabolik Analizi

Özet

Biz oksijen tüketimi ve Drosophila melanogaster larva ve yetişkin Beynindeki hücre dışı asitleştirme ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bir metabolik analyzer adapte ve en iyi duruma getirilmiş bir iletişim kuralı ile kullanılmaktadır. Mikro-doku bağlar bu protokolü kritik bileşenidir ve tasarlanmış ve bunların kullanımı bu analizi için özel olarak yaratılmıştır.

Özet

Bu iletişim kuralı Drosophila melanogaster larva ve yetişkin beyin metabolizmasında ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bütün organları metabolizmasında miktarının primer hücre ve hücre hatları analiz ederken yakalanamayan enerji kullanımı bir doku düzeyinde anlayış sağlar. Bu analiz ex vivoolmakla birlikte, ölçüm bir dokuda bir fonksiyonu gerçekleştirmek için birlikte çalışan özel hücreler bir dizi için izin verir ve daha yakından vivo içinde organ modelleri. Metabolik yeniden programlama neoplazi ve nörodejeneratif hastalıklar da dahil olmak üzere birçok nörolojik hastalıklarda gözlenmiştir. Bu iletişim kuralı bir ticari olarak mevcut metabolik Çözümleyicisi'ni kullanarak nörolojik hastalık modelleri metabolizmasında D. melanogaster toplumun Soruşturmama yardım etmek için geliştirilmiştir. Metabolik Çözümleyicisi'ndeki tüm beyin metabolizma ölçme beyin geometri nedeniyle zordur. Bu analiz örnekleri bir 96-şey tabak dibinde kalmasını gerektirir. Hücre örnekleri ve doku yumruklar hücre plaka yüzeyine bağlı veya küresel kaplamalar, sırasıyla kullanmak. Ancak, küresel, üç boyutlu şekle D. melanogaster beyin doku plakasına kalarak engeller. Bu iletişim kuralı Çözümleyicisi'nin iki katı hal sensör sonda gelen metabolik ölçümleri hala izin verirken beynin herhangi bir hareket engelleyerek bu sorunu kaçınmanızı sağlar özel olarak tasarlanmış ve imal edilmiş bir mikro-doku kısıtlama gerektirir. Oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme oranları tekrarlanabilir ve metabolik inhibitörleri ile tedavi için hassas. Örnek boyutu kısıtlama tarafından oluşturulan odası aşmaması koşuluyla küçük bir optimizasyon ile bu iletişim kuralı tüm doku ve/veya modeli sistem, ile kullanmak için adapte edilebilir. Bazal metabolik ölçüm ve analiz mitokondrial inhibitörleri ile tedavi sonrası bu protokolde açıklanan iken, enerji kaynağı tercih ve yetiştirme ortamı gibi sayısız deneysel koşullar sorguya.

Giriş

Metabolik yeniden programlama Glioblastoma Multiforme (GBM), Huntington hastalığı ve büyük depresif bozukluğu (MDD)^1,2,3de dahil olmak üzere birçok nörolojik hastalıklarda tespit edilmiştir. Metabolizma tedavi stratejileri odak olduğunda, temel metabolik araştırma araçları Gelişmiş. Ancak, bu yöntemlerin çoğu hücre satırları ve primer hücre çalışmaya veya daha büyük doku sonrası fiksasyon veya - dondurucu analiz etmek için tasarlanmıştır. Bazı yaklaşımlar diğerleri kromatografi kütle spektrometresi⁴ aynı amaç için birlikte kullanan daha maliyetli ve karmaşık analiz kullanılan iken belirli metabolitleri, basitçe ölçmek için kiti yararlanmıştır. Büyük metabolik manzara anlamak için metabolik^5,6 ve metabolik akı analiz profil oluşturma (MFA)⁷ büyük ölçekli proteomik ve genomik çalışmalar tamamlayacak şekilde ortaya çıktı. MFA bunun üzerine etiketli metabolitleri izleme zaman içinde izin vererek genişletir profil oluşturma metabolitleri bir hücre veya doku bir noktada bir nicel temsil zaman içinde sağlar. İkincisi nasıl enerji kaynakları farklı bir hücre veya bir hastalık durumu⁸ne zaman dokusunda kullanıldığında ortaya yararlı olmuştur. Ancak, bu yöntemleri genel olarak metabolizma hızı ölçümü dahil etmeyin.

Küçük model sistemleri genel olarak metabolik durumunu sorgulamak için Clark elektrot⁹ ve dolaylı Kalorimetre¹⁰, gibi geleneksel yöntemleri edilebilir oksijen tüketimi ölçmek için kullanılan veya stop akışı basınçlırespirometri için yapılandırılmış oksijen ve karbondioksit konsantrasyonu, sırasıyla ölçmek. Bu teknikler, doğru bir şekilde metabolik organizma düzeyinde yeniden programlama okuma içgörü sağlarken bazı kısıtlamalara sahiptir. Clark elektrot kullanımı teknik olarak zor olabilir ve yüksek üretilen iş çalışmaları için tasarlanmamıştır. Dur akışı respirometer hücre ve dokulara tahlil için gerekli hassasiyeti ile çalışamaz. Birkaç yıl önce özellikle bu küçük uygulamalar¹¹için yeni bir teknoloji geliştirildi. Bu aletleri başlangıçta oksijen tüketimi ve hücre satırları ve primer hücre bir 24 - veya 96-iyi biçimde ekstraselüler asitleştirme ölçmek için tasarlanmıştır. Kurulum ve veri çıkış kolaylığı bu yöntemi alternatif geleneksel yaklaşımlar olarak kurulmuş. Bu metodoloji hücreler için güçlü bir araçtır ve son gelişmeler doku yumruklar^12,13,14ölçüm için izin vermiş. Ancak, bu deneyleri içinde kullanılan yöntemleri tüm organ sistemleri küçük modellemek ölçümü için izin vermez.

Metabolik hastalık modelleri analizini sık sık özel işlev aynı doku içinde ikamet eden hücreler arasındaki etkileşimi içerir. Örneğin, Gliyal hücreler nöronlar tarafından kullanılan metabolitleri üretmek. Bu metabolik etkileşimler için nöronal hayatta kalma¹⁵gereklidir. Bu gibi sorular soruşturma için avantajlı küçük model sistemlerdir. Hücre tipleri, çeşitli içeren bütün bir organ metabolizma ölçmek için çalışmalar enerji kullanımı içinde vivoanlamak için ekleyecektir. Son zamanlarda, Becker ve ark. oksijen tüketimi bütün sinek kafa¹⁶ölçme yöntemi bildirdi. Kafasına bir şey 24-şey hücre plaka birlikte bir dizi havuzu tarafından oksijen tüketimi okuma metabolik bir Çözümleyicisi'ni kullanarak elde edilmiştir. Bu kolayca bedenden ayrılmış, iyi başlar için çalışırken büyük bir miktar için bu yöntemi disseke gerektiğinden, larva beyin gibi organlarda için kullanmak çok daha zor. Bu nedenle, oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme okuma hassasiyeti artar, bir 96-şey hücre plaka kullanan bir yöntem tek bir bütün larva beyin tahlil için geliştirilmiştir.

Bu çalışmada kullanılan metabolik analyzer bir 96-şey hücre tabak kuyu dibinde kalmasını ölçülen örnek gerektirir. Hücreleri ve görece düz dokular için bu bir sorun değildir; Ancak, D. melanogaster larva ve yetişkin beyin geleneksel levha kaplama protokolleri kullanarak mümkün değildir. Beyin küresel üç boyutlu şeklini güvenilir bir şekilde plaka yüzeyine uygun olmaz ve yapmak bu kez onları düzgün kuyuda yere çalışılırken bozulmuş. Bir kritik protokolünün bir parçası olarak bu yeni tasarım ve geliştirme beyin metabolizma ölçümleri ile engel olmadan bulunması için küçük bir oda sağlayan mikro-doku bağlar¹⁷ var. Oluşturulan odası yaklaşık de içinde 0.016 yüksekliği ve kolayca birçok D. melanogaster beyin tutmak için yeterli alan sağlar. Bağlar için bir inert polimer yüzüğü ekli naylon mesh oluşur ve daha fazla ele alınacak Temsilcisi sonuçları. Bu bağlar kullanarak disseke beyin metabolik ölçüm için hazırlamak için gereken süreyi en aza indirir. Ölçüm işlemi en iyi duruma getirme sabit, tekrarlanabilir oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme oranları altı ölçüm döngüleri (25 dk) sonra oluşturur. Beyni 2 h, metabolik analyzer kartuş ilaç teslim bağlantı noktaları enjeksiyonları therapeutics, inhibitörleri veya diğer tedaviler ile sağlayan en az bu koşullar altında metabolik olarak aktif kalır. Bu iletişim kuralı da diğer doku ve küçük model sistemleri¹⁸için kolayca adapte edilebilir.

Aşağıda ayrıntılı protokolü ile mitokondrial stres istediğinde bir bütün Drosophila larva beyin oksijen tüketiminde tahlil açıklar. Beyin stres, oligomycin ATP sentaz¹⁹etkisizleştirmek için eklenir. Bazal okuma dan oksijen tüketiminde azalma, beyinde ATP bağlı olarak solunum miktarı ölçümü gösterir. Daha fazla oksijen tüketimi tedaviler Rotenon²⁰ ve antimycin bir²¹sonra düşüşler, elektron taşıma zinciri kompleksleri inhibitörleri ı ve III, sırasıyla, belirtmek mitokondrial Sigara oksijen tüketim miktarı beyin. Bu tahlil bir örnek bir sinek beyinde nasıl mitokondrial solunum karşılaştırıldığında ve nasıl bu protokolü değişen genotip metabolizmasında karşılaştırmak için kullanılabilir olduğunu. Ancak, bu iletişim kuralı sadece bazal oksijen tüketimi ve daha ayrıntılı çalışmalar belirli enerji kullanımı veya substrat kullanımı hipotezler soruşturma tasarım olarak ekstrasellüler asitleştirme fiyatlar, de ölçmek için adapte edilebilir.

Protokol

1. assay hazırlık (1 gün)

1. Bir kuluçka veya 11 ° C'ye ayarla bir ısı kontrollü Oda metabolik analyzer (Tablo reçetesi) yerleştirin
   Not: tahlil çalıştırırken oluşur ~ 14 ° C sıcaklık dalgalanması için izin verdiği bu sıcaklık 25 ° C'de alınan ölçümler için idealdir. Bu çalışma sırasında aracı tarafından üretilen ısı kaynaklanır.
2. Metabolik Çözümleyicisi'bağlı olan bilgisayarda uygun yazılımını açın. Sayısal Sıcaklık ekranın alt sol tarafında tıklayın. Açılan yeni pencerede "Isıtıcı" komutu yanındaki kutuyu tıklatın ve onay işaretinin olun. 25 ° C sıcaklığa ayarlamak ve tolerans aralığı 0.2 ° c ok tuşlarını kullanarak ayarlayın.
   Not: Birkaç saat kararlı sıcaklıklar elde etmek için gerekir.
3. Kartuş konteyner (Tablo reçetesi) açın ve sondalar dokunmadan yeni plaka kartuşunu çıkarın.
   Not: Yeni plaka kartuş kalibrasyon sırasında kullanılır ve metabolik tahlil çalıştırırken kullanılmaz.
4. Bir calibrant çözüm (Tablo reçetesi) 200 μL yardımcı programı plaka ve sensör suyla temasa geri yardımcı programı plaka üstüne kartuşu çıkarma, probları yer ekleyin. Sondalar dokunmaya değil ve onları ışıktan korumak.
5. Parafin film kartuşla kapatın.
6. Gecede 25 ° C'de kartuş kuluçkaya

2. tahlil medyası hazırlama (2 gün)

1. 10 mM glikoz ve 10 mM sodyum pyruvate tahlil orta olarak ekleyin.
2. Sıvı bu sıcaklığa equilibrated kadar 25 ° c orta kuluçkaya.
3. PH 7.4 pH metre kullanarak için ayarlayın.

3. Drosophila melanogaster beyin (gün 2) metabolik analizi için yazılımın kurulması

1. 1.2. adımda kullanılan metabolik analyzer metabolik yazılım ayarlayın.
2. "Şablon" yazılım ana ekranında seçin.
3. Yeni bir tahlil tasarım başlatmak için "boş" çift tıklatın.
4. Hücre tahlil plaka tasarımını görüntülemek için en iyi araç çubuğundaki "Plaka göster" butonuna tıklayın.
   Not: Hücre tahlil plaka beyin örnekleri içerir ve çalıştırmak metabolik tahlil başlamadan önce Kartuşu ile eşleştirilmiş olacaktır.
5. Ekle'yi tıklatın grupları 3 x düğme.
   1. "Grup 1" etiketini çift tıklatın ve "Deneysel" olarak yeniden adlandırın.
      Not: Bu grup sinek bir beyin ve ilaçlar ile tedavi bir mikro-doku kısıtlama içerir.
   2. "Grup 2" etiketini çift tıklatın ve "Kontrol" olarak yeniden adlandırın.
      Not: Bu grup sinek bir beyin ve hiçbir ilaç tedavisi ile bir mikro-doku kısıtlama içerir.
   3. Çift-tıkırtı üstünde "Grup 3" etiket ve rename o için "kısıtlama yalnızca".
      Not: Bu grubun bir mikro-doku kısıtlama olmaksızın herhangi bir beyin ya da ilaç tedavisi içerir.
6. Kuyuları hücre plaka örnekleri nerede yerleştirilmesi içindir üzerinde dayalı olan her gruba atayın.
   1. "Deneysel" etiketini tıklatın ve sonra kuyu B2 - B8 plaka haritada vurgulayın.
   2. "Kontrol" etiketinde'ı tıklatın ve sonra kuyu C2-C8 plaka haritada vurgulayın.
   3. Tıkırtı üstünde "kısıtlama tek" etiket ve o zaman vurgulamak wells D2-D8 plaka harita üzerinde.
   4. Tüm dört köşe (A1, A12, H1 ve H12) arka plan olarak atanan kontrol edin.
      Not: Wells plaka çevre boyunca herhangi bir kenar etkileri azaltmak için kullanılır. Bu bir yazılım varsayılan ayardır.
7. Protokol hazırlamam için en iyi araç çubuğundaki "Protokol" düğmesini tıklayın.
   1. "Ölçüm Ayrıntıları Düzenle" temel ölçüm kutusunda tıklatın.
   2. "3:00" döngü süresi bazal ölçü değiştirerek metabolik analyzer beyin ölçecektir zamanını tıklatarak yukarı ve aşağı oklarını ayarlayın.
   3. Metabolik analyzer bazal bekleme döngü süresi için değiştirerek beyin ölçümleri arasında bekleyeceği süreyi ayarlamak "0:00" tıklatarak yukarı ve aşağı okları.
   4. Metabolik analyzer medya mix süreyi ayarlamak bazal değiştirerek beyin ölçme önce "1:00" döngü süresi tıklatarak yukarı ve aşağı oklarını karıştırın.
   5. Bazal döngüleri, ölçü birimi, bekle ve mix döngüleri, ye içerir toplam sayısını ayarlamak "7" tıklatarak yukarı ve aşağı okları.
      Not: İstikrarlı oksijen tüketim oranı ölçümleri başlar, tahlil ~ 25 min sonra elde edilir.
   6. Üst sol araç çubuğunda bulunan "enjeksiyon Ekle" düğmesini tıklayın.
   7. "Enjeksiyon etiketinde" tıklatın ve "Oligomycin" değiştirin.
   8. Enjeksiyon ölçü, bekle ve mix kez bazal için uyum için ayarlayın.
   9. Tıklatarak yukarı ve aşağı oklarını enjeksiyon döngüleri "6" için toplam sayısını ayarlayın.
   10. Aygıtlarından 3.7.6 - 3.7.8 ama "İçin Rot/AA" etiketini değiştirmek ve tıklatarak yukarı ve aşağı oklarını enjeksiyon döngüleri 7 toplam sayısını ayarlayın.
   11. En iyi araç çubuğunda "Tahlil çalıştırmak" düğmesini tıklayın.
   12. "Tahlil kaydetmek" ve tahlil kartuş (Tablo reçetesi) kurma başlamak.

4. Kalibrasyon (2 gün) için kartuşun hazırlanması

1. 25 ° C kuluçka Kartuşu ve kapaðý çýkarýn.
   1. Küçük üst sol dairesel enjeksiyon bağlantı noktasını, bağlantı noktası A, hücre plaka üzerinde tüm ilgili deneysel kuyuları için kartuş 100 mikron oligomycin 20 μL ekleyin ve 20 μL tahlil medya kontrol ve arka plan wells de dahil olmak üzere diğer Wells, A bağlantı noktası ekleyin.
      Not: Kartuş 4 Port (A-D) her hücre plakasına ne örnekler içerir karşılık gelen 96 wells için içerir. Bu adım örnekleri eklemeden önce yapılır. Bir kez de metabolik Çözümleyicisi tarafından uyuşturucu enjekte edilir 100 mikron oligomycin sonuçlarının 20 μL hücre plaka 10 mikron son oligomycin konsantrasyon ekleyerek. Oligomycin bir ATP sentaz inhibitörü olduğunu. Elde edilen oksijen tüketimi değeri ATP bağlı solunum beyinde miktarını yansıtır. Düzgün belirtilen kuyu uyuşturucu enjekte için aynı mektup tüm bağlantı noktaları ile aynı güç sıvı, hatta değilse kullanımda doldurulması zorunludur.
   2. 50 mikron Rotenon/antimycin A 22 μL küçük üst şu dairesel bağlantı noktasına ekleyin, hücre plaka üzerinde tüm ilgili deneysel kuyuları için kartuş B, liman ve tahlil medya 22 μL kontrol ve arka plan wells de dahil olmak üzere diğer wells, B noktasına ekleyin.
      Not: bir kez de metabolik Çözümleyicisi tarafından uyuşturucu enjekte edilir bir son Rotenon/Antimycin hücre plaka 5 mikron bir konsantrasyon sonuçlanır. Rotenon ve antimycin A inhibitörleri, elektron taşıma zinciri kompleksleri ı ve III, sırasıyla vardır. Elde edilen oksijen tüketimi değeri beyinde sigara mitokondrial solunum yansıtır.
   3. "Çalışma" Başlat dolu kartuş yardımcı programı plakalı araç, makine sağ taraftan uzanan plaka loader ile karşı karşıya zaman sol üst köşede konumlandırılmış iyi A1 ile metabolik çözümleyicisine yerleştirmek için.
2. "Ben denge ve metabolik tahlil örnekleri içeren hücre plaka ile başlayan önce kartuşu kalibrasyonu başlamak için yazılım hazır yaşıyorum" seçin.
   Not: Program dosyayı kaydedin ve sonra başlamak sorar sıcaklığına ve ayarlama. Bu adımlar 1 h. adımları 5-8 denge ve kalibrasyon saatinde yapılmaktadır.

5. mikro-doku bağlar (2 gün) hazırlanması

1. 1 mikro-doku kısıtlama ölçülür beyin başına artı kullanmak için en az 3 (% 70 etanol içerir) saklama kabı üzerinden yalnızca sınırlama denetimleri seçin.
2. Bağlar taze % 70 etanol ile durulayın ve onları yıkamak deiyonize suyla 3 x 2 dakika her biri, bir hasır sepet ve 6-şey plaka (Tablo reçetesi) kullanarak. Bağlar hala bir alkol kokusu verirsen ek su yıkar ekleyin.
3. Mikro-doku bağlar tahlil medyada yıkayın ve kullanıma hazır olana bu çözümde bırakın.

6. diseksiyon Drosophila melanogaster larva beyin (2 gün)

1. Geç (göçebe) üçüncü INSTAR larva yüksek hassasiyetli kullanarak kültürlü Oregon-R sinekler bir şişe seçin, 5 (0,10 x 0,06 mm²) cımbız stil.
2. Larva 1 x PBS 500 μL içeren bir temiz diseksiyon spot plaka (Tablo reçetesi) kuyuya yerleştirin.
   Not: Bir cam levha ile çöküntü, küçük doku ve organizmaların incelemek için kullanılan spot bir plakadır.
3. Larva yavaşça su kuyusunda sallayarak Cımbız kullanarak yıkayın.
4. Larva 1 x PBS 500 μL içeren bir spot plaka temiz kuyuya taşımak.
5. Diseksiyon mikroskop altında spot tabak koyun.
6. Larva kendi midsection, cımbız, bir çift ile göz kanca cımbız ikinci bir çifti ile açgözlü iken kavramak.
7. Yavaşça ve sorunsuz larva cımbız iki kümesi kullanarak ters yönde çek.
8. Genellikle konaklamalar için göz kanca bağlı beyin görselleştirmek ve sık göz antennal diskler için eklenmiş.
9. Dikkatle ek doku beyin, beyin tutmak için göz kancalar kullanarak kaldırın. Son olarak, beyin üzerinden göz kanca ayırın.
10. Cımbız disseke beyin için yeni bir kuyu 1 x PBS içeren spot bir plaka üzerinde taşımak için kullanın.
11. 14 beyin disseke 6.1-6.10 tamamlayana dek.
    Not: Diseksiyon başlar, toplam süre olarak tahlil çalıştırılmasını 30 dk aşmaması gerekir.

7. ek disseke beyin 96-iyi metabolik tahlil hücre plaka (2 gün)

1. Deney, deneysel dahil olmak üzere, denetim, salt kısıtlama ve arka plan wells kullanılan 50 μL 96-iyi metabolik tahlil plaka (Tablo reçetesi) kuyu için tahlil medya ekleyin.
2. Dikkatli bir beyin A2-A8 ve B2-B8 hücresi plaka, cımbız, bir spatula veya bir pipet kullanarak her kuyudan yerleştirin.
   Not: Bu diseksiyon mikroskop uzak yapılabilir.
3. Diseksiyon mikroskop altında bir bükülmüş iğne mikro-sonda beyin kuyunun için lavabo için kullanın.
4. Yavaşça beyin üç yükseltilmiş küre sonda kullanarak ortasında konumlandırın.

8. mikro-doku bağlar 96-iyi metabolik tahlil hücre plaka (2 gün) eklenmesi

1. Cımbız kullanarak, mikro-doku kısıtlama iyi tahlil plaka kenarına yerleştirin ve mikroskop aşağı bakacak şekilde plastik halka ve üstüne mesh ile odaklı olduğunu incelemek için kullanın.
2. Mikroskop altında plaka kaldırmak ve her iki tarafında ve hafifçe kısıtlama kavramak için kullanım cımbız kuyunun içine bırakın.
3. Bir bükülmüş iğne mikro-sonda ilk sayısı aşağı kuyunun içine itmek için kullanın.
4. Mikroskop altında beyin doku kısıtlama görülebilir ve kuyuda merkezli olduğunu doğrulayın.
5. 8.1 – 8,4 tahlil olacak bütün kuyuları için adımları yineleyin — A2-A8, B2-B8 ve C2-C8.
6. Dikkatli bir şekilde tahlil medya her birine deneysel 130 μL, kontrol ve salt kısıtlama wells ekleyin.
7. Beyin ve mikro-doku bağlar onları mikroskop altında görselleştirme tarafından medya eklenirken kımıldamadım olduğunu doğrulayın.
8. Arka plan denetim olarak kullanmak için dört köşe wells için 180 μL tahlil medya ekleyin.

9. metabolik Analyzer ve tahlil (2 gün) başlangıcı hücre plakasına eklenmesi

1. Denge ve kalibrasyon örnek içeren hücre plaka-e sevketmek belgili tanımlık bilgisayar yazılımı için bekleyerek tam olduğundan emin olun.
2. "Açık" i seçin ve araç yardımcı programı plaka çıkarmak bekleyin.
3. Yardımcı program plaka kaldırın ve hücre plaka olmadan kapağı, aynı yönde ekleyin.
4. "Yük hücre hücre plaka almak ve kapatmak belgili tanımlık tepsi kalıbı" araç için seçin ve daha sonra tahlil başlar.
5. Ölçümlerde görüntülemek gerçek-zaman ile belgili tanımlık bilgisayar yazılımı çalıştıran bilgisayar ekranında hata çubukları.
6. Tahlil tamamlandıktan sonra çkarlyor hücre plaka ve kartuş kaldırın.
   Not: Yeniden kullanılan 5 eþleþtirilmiþ kartuşların ve hücre tabak olabilir x.

10. sonrası ölçüm analiz (2 gün)

1. Diseksiyon mikroskop tahlil tamamlandıktan sonra beyin ve mikro-doku bağlar hala düzgün kuyuda yer doğrulamak için kullanın. Herhangi bir wells anormallikler ile çözümleme dışı bırakmak.
2. Oksijen tüketim hızı (OCR) ve ekstraselüler asitleştirme oranı (D.H.T.) verileri daha ayrıntılı bir çözümleme için verme.

Sonuçlar

Burada sunulan Protokolü aşağıda açıklanan özellikleri karşılamak mikro-doku bağlar kullanımını gerektirir. 96-şey hücre kalenin dibinde yer beyinlerinde başarısız tutmak için diğer yöntemleri kullanarak (Şekil 2A ve 2B). İlk olarak, plaka doku uyumu artırmak için çeşitli ajanlar test edildi. Piyasada bulunan doku yapıştırıcı (Tablo reçetesi) hücreleri ve hücre plakaları ve küresel kaplamalar, organoids kullanımı için sırasıyla önerilir. Başlangıçta, beyin iyi yüzeye bağlı kalmak için ortaya çıktı; Ancak, oksijen tüketimi (OCR) okuma düşüktü ve sonra tahlil kuyuları gözlemleyerek beyin artık iyi yüzey (Şekil 2A) bağlı olduğunu ortaya koydu. Ayni-den sonuçlanmak süper yapıştırıcı (Şekil 2A) ile oluştu. İleri, kuyunun dibinde küçük bir oda içinde beyin çalıştı tutmak için küçük ekranlar imalat (Şekil 2B).

Metal ekranlar yüksek OCR okuma ekranları ekran (2B rakam) yerinde tutan bir polimer halka ile metal gibi tek başına üretilen. Plastik hasır örgü aynı polimer yüzükle kullanıldı. Bu cihaz elde edilecek negatif bir OCR okuma neden oldu. Son olarak, mikro-doku bağlar 0.146 içinde 0.1335 içinde 0.0125 içinde kalınlığında bir iç çapı ve 0,016 inç (Tablo reçetesi) yüksekliği bir dış çap ölçüm ring için etkisiz bir polimer kullanarak tasarlanmıştır. Süper yapıştırıcı (Tablo reçetesi) içinde 0.0039 çapı (Tablo reçetesi) belirli gözenek büyüklüğü ile naylon mesh yüzüğü takmak için kullanıldı. Hava kabarcıklarının oluşumunu olmadan medya ve metaboliti geçişine izin verir, ama hala beyin için bir engel olarak davranır gibi gözenek boyutu önemlidir. Bu kısıtlama yok tek başına hiçbir OCR için biraz okuma neden ve beyin ile kullanıldığında (Şekil 2A ve 2B) reproducible okumaları için izin. Doğrulama tahlil beyin hala doğru wells konumlandırılmış olduğunu gösterdikten sonra. Bu doku bağlar Şu anda ticari olarak mevcut değildir ama yukarıdaki belirtimi takip ederek üretilebilmektedir. Bu hassas üretim gerekirken, çoğu makine dükkan yukarıda başvurulan malzemeler kullanılarak bu kısıtlama çoğaltmak mümkün olacaktır.

Protokol daha fazla için tahlil medya, tahlil çalıştırmadan önce geçmesi gereken süreyi ve sıcaklık (Şekil 3) için optimize edildi. Başlangıçta, deneyleri Schneider ortamda larva in vivo ortamda modellemek için kurulmuştur. Ancak, pH D.H.T. ölçmek için kullanılan bu yana kullanılan ortamı arabelleğe alma aracıları içeremez. Bu medya, böylece, özel yapılmış, hangi maliyetlidir olmalı. Bu en iyi duruma getirmek için metabolik analiz (Tablo reçetesi) için tasarlanmış bir piyasada bulunan tahlil medya Schneider medya yerine kullanılmıştır. OCR düzeyleri bile modeli tahlil ortam koşulları (Şekil 3A) için biraz glikoz düzeyleri artan değişmeden, idi. Şu andan itibaren bütün deneyleri tahlil ortamda yapılmıştır. Olup olmadığını oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme oranları bilinen mitokondrial inhibitörleri ile tedavi ederken bir tepki gösterdi medyaya takviyeleri gözlemleyerek optimize. Daha sonra gruptakiler ve tahlil ishal arasında bekleme süresi analiz edildi. 3 h bir kuluçka OCR seviyeleri (Şekil 3B) önemli ölçüde düştü. Şekil 3D fark, ne zaman OCR ve D.H.T. düzeyleri için her iki yetişkin ve larva beyin stabilize olan altıncı saat noktasına gösterir. Böylece, protokol deneme durumda bir kuluçka az 30 dk için önerilen bir sıcaklık denge gerektiren sürece hemen ardından gruptakiler, tahlil başlamak için gösterir. Metabolik analyzer 11 ° C ile 25 ° C sıcaklık boyunca tahlil için izin verecek biçimde ayarlayabilirsiniz bir kuluçka depolanır. Sıcaklıklar yüksek ortam sıcaklığı ve enstrüman işlemi nedeniyle, azaltılmış OCR düzeyleri (Şekil 3 c) gözlenir. Bu doku ölümü nedeniyle olacak olan.

En iyi duruma getirilmiş koşulları izlendiğinde, larva ve yetişkin deneyleri beyin okuma biraz 150 pmol/dak, stabilize aşan OCR sonucu altıncı kez bağlantısı, ~ 25 dk tahlil (Şekil 4B) içine. Bu oran en az 30 dk (Şekil 4A) için ve en çok 2 s (veri gösterilmez) korunur. D.H.T. (Şekil 4 d) altıncı zamanda noktada larva beynindeki yetişkin beynindeki biraz aşağıda olan ve en az 30 dk (Şekil 4 c) korunur. Bu bulgu glikoliz bir artış büyümeyi desteklemek üzere larva aşamalarında karşılık gelir. İğne oligomycin gibi bir mitokondri inhibitörü ile ATP bağlı solunum açığa vurmak ve mitokondrial Sigara oksijen tüketimi (Şekil 5A ortaya çıkarmak için OCR Rotenon ve antimycin A düşürür tedaviyle daha için OCR okuma düşürür ). Bu veri bu inhibitörleri ve beyin dokusuna nüfuz edebiliyoruz değişik genotip mitokondrial solunum beynindeki karşılaştırmak için kullanılan gösterir. Bu tahlil, mix, bekleyin ve ölçü kez oksijen düzeyleri, tüketim oranını değil, gözlem ve karıştırma sonra sağlamak tarafından optimize için oksijen seviyesi ölçüm öncesi seviyesine döndü.

Şekil 1: metabolik Çözümleyicisindeki larva beyin OCR ve D.H.T. ölçümlerin bir şematik. Kartuş tahlil çalıştırmadan önce bir gün hazırlanır. Ertesi gün, uyuşturucu kartuş enjeksiyon bağlantı noktalarına eklenir. D. melanogaster larva beyin disseke ve mikro-doku bağlı beyin kuyunun dibine güvenliğini sağlamak için eklenir. Beyin hücre plakalı metabolik Çözümleyicisinde denetlesinler ve veri analiz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 2: mikro-doku kısıtlama yok metabolik olarak aktif değildir ve beyin de bir tabak dibinde bir odasında tutun. (A)OCR Oregon-R ö melanogaster larva beyin doku yapıştırıcı (Malzemeler tablo) ile veya beyin kuyunun için süper yapıştırıldığında kaplı Wells ölçülür. Sonuçları mikro-doku bağlar kullanarak kuyu alt kısmında konumlandırılmış beyin ile karşılaştırıldığında. (B) OCR tahlil medya ve metal, polimer yüzük, plastik kafes kafes bezi ve polimer yüzük veya mikro-doku bağlar ile metal içeren Wells ölçülür. p-değeri < 0,05, ** p-değeri < 0,01, *** p-değeri < 0,001, *** p-değeri < 0,0001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 3: medya, kuluçka zaman ve sıcaklık duruma getirilmesi. (A) Oregon-R ö melanogaster içinde ölçülen larva beyin Schneider medya (S2) sodyum pyruvate ile kullanarak eklenir, S2 ile glikoz ve sodyum pyruvate eklendi ve medya glikoz ve sodyum pyruvate ekledi tahlil OCR. (B) OCR larva beyinlerinde, kuluçka tahlil önce 3 saat sonra veya, kuluçka tahlil önce 30 dk sonra ölçülür. (C) OCR 33 ° C ve 25 ° c sıcaklığa çalıştırmak tahlil, larva beynindeki ölçülür Altıncı süresi noktası Grafiği çizilecek. (D) OCR larva beyinlerinde, kuluçka tahlil önce 3 saat sonra veya, kuluçka tahlil önce 30 dk sonra ölçülür. Verileri için altıncı zaman noktası bildirilmektedir. p-değeri < 0,05, ** p-değeri < 0,01, *** p-değeri < 0,001, *** p-değeri < 0,0001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 4: OCR ve D.H.T. tekrarlanarak yetişkin ölçülür ve larva D. melanogaster beyin. (A)OCR 30 dk. (B) OCR veri paneli A altıncı zaman noktasından Grafiği çizilecek için Oregon-R ö melanogaster yetişkin ve larva beyinlerinde ölçülür. Bu hangi OCR okuma stabilize zaman noktadır. 30 dk. (D) D.H.T. Veri paneli bir altıncı zaman noktasından Grafiği çizilecek için (C) D.H.T. D. melanogaster yetişkin ve larva beyinlerinde ölçülür. Bu hangi D.H.T. okumalar stabilize zaman noktadır. p-değeri < 0,05, ** p-değeri < 0,01, *** p-değeri < 0,001, *** p-değeri < 0,0001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Şekil 5: Oligomycin ATP bağlı solunum ortaya çıkarmak için D. melanogaster larva beyin OCR düzeyleri düşürür ve Rotenon/antimycin bir daha da düşürür mitokondrial Sigara oksijen tüketimi ortaya çıkarmak için OCR. (A)OCR Oregon-RD. melanogaster larva beyinlerinde bir 20 µM oligomycin ve 5 mikron Rotenon/antimycin A karışımı bir tedaviden sonra ölçülür. Denetim ve salt kısıtlama wells tahlil medya ile enjekte edildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Burada, D. melanogaster larva ve yetişkin beyin ex vivo metabolik analizi için yeni bir yöntem açıklanmıştır. Bazal koşullar altında nasıl metabolik olarak aktif beyin olduğunu ve bir doku mitokondrial karşı glycolytic solunum daha bağımlı hale gelmiştir olup olmadığını belirlemek için oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme oranları gösterir, sırasıyla¹¹.

Beyin inhibitörleri veya tedavi edici ilaçlar ile tedavi daha fazla dokunun metabolik durumu hakkında bilgi sağlar. Metabolik yüzeylerde Warburg etkisi²² veya glutaminolysis²³araştırmak için glutamin için test etmek için glikoz gibi belirli metabolitleri bağımlılıkları belirlemek için de eklenebilir — metabolik yeniden programlama içinde her iki ortak. Uzun vadeli çalışmalar, larva veya sinekler enjeksiyon bağlantı noktalarını kullanmak yerine uyuşturucu da beslenen ve beyin aralıklarla veya bağlı olarak deneysel tasarım son noktada denetlesinler. Bu yöntem için çeşitli uygulamalar getirilebilir.

Bu yöntem beyin yerine getirilmiş ancak diğer larva¹⁸ ve yetişkin dokuları analiz etmek için kullanılabilir. Ayrıca, diğer küçük model sistemleri tüm organizmalar¹⁸ veya doku ölçmek için bu yöntemi kullanabilir. Bu yöntem diğer sistemler için en iyi duruma getirme için tek organ, doku veya organizma boyutunu kısıtlamadır. Mikro-doku kısıtlama tarafından oluşturulan odası için tahlil çalışan boyut engeldir. Metabolik çıktı beyin veya test edilen doku için çok düşüktür ve örnek boyutu bir kısıtlaması değil, örnekleri havuzu tahlil ölçümleri ve duyarlılığı artırmak için kullanılabilir. Diğer uygulamalar için bu iletişim kuralını değiştirme yalnızca küçük en iyi duruma getirmeleri 1) uygun ölçü birimi seçimi de dahil olmak üzere, gerektiren ve döngüsü numaraları ve zamanlama ve 2) belirlemede etkili tedavi konsantrasyonlarda doku için karıştırın. Ölçü ve karıştırma kez metabolik Çözümleyicisi tarafından her döngüsü sırasında ölçülen izleme oksijen konsantrasyonu tarafından belirlendi. Bu çalışma tamamlandıktan sonra O₂ genel bakış penceresinde Y2 eksen düğmesini seçerek görüntülenebilir. Her döngüsü sırasında karıştırma sırasında ilk oksijen konsantrasyonu dönüş ardından doku'nın oksijen tüketimi sırasında ölçülen süreyi yansıtan bir açılan oksijen konsantrasyonu olmalıdır. Bu desen görülmektedir kadar ölçü ve mix kez test edilmelidir. Bu yöntemi kullanarak, diğer böcek beyinler incelenmiştir. Bu beyin burada kullanılan ancak hala doku kısıtlama tarafından oluşturulan odası sığması sinek akıldan çok daha büyük. OCR okuma bu beyin üzerinden 400 pmol / dk (veri gösterilmez) yüksek. Bu çalışmalar yanı sıra bütün-fly oksijen tüketimi^18,24, ölçme diğer çalışmalar ile hizalamak OCR oranları sonuçlarından D. melanogaster beyin oksijen sınırlı değildi öneririz. D. melanogaster beyin ve diğer organizmalar dokulardan için bu yöntemi uygulayarak dört kritik adımlar için özel dikkat gerektirir.

Başarılı bir şekilde biyolojik olarak uygun ve tekrarlanabilir ölçümler elde etmek için takip edilmesi gereken Protokolü'nün kritik adımlar vardır. İlk olarak, bir mikro-doku kısıtlama kullanımı bu yöntem için gereklidir. Bu bağlar özellikleri ve listelenen malzemeleri kullanarak üretim esastır. Malzemeler nedeniyle etkisiz kimyasal bileşimi ve yeteneklerini karıştırma adımları olmadan hava kabarcıkları oluşturulması sırasında uygun ortam değişimi izin için seçildi. İkinci olarak, zamanında bir diseksiyon ve plaka hazırlık doku metabolik çıkışını en üst düzeye çıkarmak için gereklidir. Kısa diseksiyon kez değil önemli ölçüde zarar beyin. Diğer çalışmalar düzgün bir perfüzyon depolanmış olsa diseksiyon odası sonra²⁵sinek beyin gün saat süre hayatta tutulabilir olduğunu göstermiştir. Ancak, uzun bir süre önce tahlil için tahlil medyada oturan beyin bırakılırsa Şekil 3B ve 3D, görüldüğü gibi oksijen Tüketim oranları azalmıştır. Tahlil sırasında örnekleri her döngüsü sırasında karıştırma bir adım tabi. Bu karıştırma sadece kimyasal bileşikler enjeksiyonları ile yardımcı olur ancak aynı zamanda medya recirculate ve oksijen sağlamak için görür. Onlar medya tezgah üstüne kuluçka daha metabolik olarak aktif bu ölçü-mix döngüleri sırasında daha uzun süre kalmak mümkün beyinlerdir. Bu nedenle, larva beyin diseksiyon bu tahlil ayarlamak başlamadan önce hakim. Bu tahlil kurma çözümlediğinizde genotip az sayıda bir zamanda beyin sayısını en aza indirmek için gerekli ve kuyu faydalanır. Bu gecikmeler anatomi ve tahlil ölçümler arasındaki engeller. Üçüncü olarak, istikrarlı bir sıcaklık sürdürmek fizyolojik ilgili koşullarda metabolik oranları analiz etmek için gereklidir. Yüksek tahlil sıcaklıklar düşük oksijen Tüketim oranları (Şekil 3 c) tarafından gözlenen doku ölüme neden olabilir. Sinekler farklı bir sıcaklıkta deneysel amaçlı yetiştirilen Eğer ölçümler bu sıcaklıkta da yapılmalıdır. Tahlil farklı bir sıcaklıkta yapılacaktır diseksiyonlarının büyük olasılıkla oda sıcaklığında gerçekleştirilir iken, kaplama ve ölçülü beyin tahlil çalıştırmadan önce 15dk için gerekli sıcaklığında inkübe. Son olarak, kuyu sonrası tahlil doku konumlandırma ölçümleri etkilenen belirlemek için kritik olduğunu gözlemleyerek. Bazen, bu plaka diseksiyon mikroskop altında gözlemleyerek sonra her iki doku kaybı veya mispositioning, nedeniyle veri analizi nerede beyin iyi Merkez dışında kaydı ve sıkışmış çıkarılabilir bir aykırı iyi olacak altında polimer yüzük gözü kör. Kısıtlama kuyuya düzgün sağlanmadığını ve karıştırma döngüsü sırasında rahatsız oldu Eğer doku kaybolabilir. Eğer onlar analizinden dışlanan değil de bu olayların sık sık, olur iken, onlar oranı değerleri önemli ölçüde düşürür.

Bütün doku metabolik akı izleme oksijen tüketimi ve ekstraselüler asitleştirme tarafından ölçümü nasıl metabolizma genetik manzara veya diğer deneysel koşullar tarafından değiştirilmez anlamak için biyolojik olarak uygun bir yöntem sağlar. Bu yöntem tek bir metabolik değişiklikleri algılamak için hassas dur akış basınçlırespirometri veya dolaylı Kalorimetre kullanarak mümkün değildir D. melanogaster beyin. Bu da oksijen tüketimi ölçmek için Clark elektrot kullanarak daha az teknik olarak davet ediyor. Bu iletişim kuralı bir avantajı iyi başına bir bütün beyin analiz etmek için yeteneğidir. 96-şey biçimi daha duyarlı okumaları için izin verir ve böylece, birden fazla genotip tahlil gerekli örnekleri daha az sayıda nedeniyle bir anda denetlesinler. Doku metabolizmasında ölçme hala zorlu ve dikkatle gerektirir iken yetiştirilen ve senkronize hayvanlar, bu iletişim kuralı hızlı, nispeten basit bir yöntem açıklanır ve d içinde çok sayıda metabolik hassasiyetleri analiz potansiyeline sahiptir melanogaster larva ve yetişkin beyin.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Assay medium	Agilent	102365-100
Calibrant solution	Agilent	100840-000
Corning Cell-Tak Cell Tissue Adhesive	Sigma Aldrich	DLW354240
delrin	Grainger	2XMK6
Drosophila Schneider Media	Thermo Fisher	21720-024
Dumont High Precision Tweezers (style 5)	Ted Pella	5622
Loctite 409	Amazon
Mitostress kit	Agilent	103015-100	oligomycin, rotenone, and antimycin A included
Netwell inserts (6-well)	VWR	29442-136
nylon mesh	Component Supply	U-CMN-64
Parafilm M wrapping film	Fisher Scientific	S37440
PYREX spot plate	Fisher Scientific	13-748B
Seahorse XFe96 Analyzer	Agilent
Wave v2.4 XFe96 analyzer software	Agilent	https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop	free download to mac or windows
XFe96 catridge and cell plates	Agilent	102416-100