Caenorhabditis Elek: Bir düşük teknoloji enstrüman ve küçük çok hücreli organizmalar sıralama yöntemi

Özet

Geçerli protokol sıralama ve nüfus yaş eşlemeli temizlik için bir metodoloji içerir Caenorhabditis elegans. Nematodlar araştırma için büyük bir deneysel nüfusa elde etmek için basit, ucuz ve verimli özel yapım aracı kullanır.

Özet

Caenorhabditis elegans (C. elegans) temel ve Biyomedikal araştırma bir dizi kullanılan bir iyi kurulmuş model organizmadır. Nematot araştırma topluluğu içinde C. elegansbüyük, Yaş eşlemeli nüfusu korumak uygun fiyatlı ve etkili bir şekilde gerek yoktur. Burada, mekanik olarak sıralama ve C. eleganstemizlik için bir metodoloji mevcut. Amacımız hayvanlar Tekdüzen boyutları ve yaşam evreleri deneyler kullanımları için elde etmek için düşük maliyetli, verimli, hızlı ve basit bir süreç sağlamaktır. Bu araç, Caenorhabditis elek, ortak konik Laboratuvar tüpleri konu ve gövde boyutuna göre C. elegans sıralar bir ölçüye göre kapak sistemi kullanır. Biz de Caenorhabditis elek etkili hayvanlar bir kültür tabaktan başka bir hızlı sıralama, eşitleme, sağlık, işaretçileri etkilemeden temizlik sunan ve için aktarımlarına göstermek ve stres-indüklenebilir hareketliliği dahil olmak üzere gen gazetecilere. Bu erişilebilir ve yenilikçi araç C. elegans nüfusu korumak için hızlı, verimli ve olmayan stresli bir seçenektir.

Giriş

Yuvarlak solucan Caenorhabditis elegans, premier model organizmadır. Onların ekimi laboratuvarda basit ve kontrollü doğası, yanı sıra tüm onların genom sıralı¹ ve her hücre gelişimsel kaderi²bilinir. Bu özellikleri nedeniyle, C. elegans genetik çalışmalar için yaygın olarak kullanılan model bir organizmadır. Ancak, bu faydalı özellikleri ile birlikte bazı sorunlar için araştırmacılar geliyor. Onların hızlı oluşturma süresi nedeniyle C. elegans nüfus gıda dışında hızlı bir şekilde çalıştırabilirsiniz ve/veya nüfus birden çok nesiller ile karışık hale ve gelişim dönemleri aynı anda mevcut. Böylece, katı nematodunun büyüme ortamında (NGM) gerçekleştirilen deneyler bakteriyel gıda kaynak tüketir ve yeni larva geliştirmek önce hayvanlar taze tabakaları bana fiziksel olarak taşımak araştırmacılar gerektirir. Bir sık hayvanların aktarma çoluk çocuk nesiller ile karışık hale gelen deneysel örneğin alınma olasılığını önlemek için gerektiği şekilde bu sıkıcı olabilir. Yine de, bazı deneyler her iki çok sayıda hayvan ve genişletilmiş zaman puan (Örneğin, DNA veya RNA ayıklama erişkin dönemde) gerektirir. Bu doğru bir şekilde senkronize bir popülasyon sürdürmek ve hayvanlar çok sayıda aktarma sorunları bileşikleri.

C. elegans NGM üzerinde kültürlü aktarma geçerli yöntemleri seçmek veya hayvanlar tabak tabak yıkama; kimyasal tedavi hayvanlar (Örneğin, DNA çoğaltma inhibitörü fluorodeoxyuridine veya FUDR); ya da çok iyi plakaları hayvanlarda sıralamak için akış sitometresi kullanma. Malzeme çekme el ile tek tek veya birden çok hayvanlar^3,4aktarmak için ince platin tel veya bir kirpik ile yapılan bir el araç kullanımını gerektirir. Bu yöntem doğru ama beceri ve zaman gerektirir ve çok sayıda hayvan içeren çalışmalar için bir kısıtlamadır. Mayıs da toplama bireyler doğal olmayan ve tutarsız miktarda bozukluğu ve kuvvet için potansiyel olarak subjecting tarafından fiziksel olarak zarar ve stresli hayvanlar için. Çamaşır bir arabellek çözüm ile bir kültür yemek durulama ve hayvanlar ile çözüm için yeni bir kültür plaka cam Pasteur pipet ile aktarma içerir. Bu yöntem hızlı ve etkili ama birden fazla nesiller ve hayvanların gelişim aşamalarında toplu olarak aktarılır olarak doğru değil. Kimyasal tedaviler, FUDR gibi herhangi bir DNA ikileşmesi ve böylece, gamet üretim ve yumurta gelişim engelleme yoluyla yavru önlemek için kodlamayla medya çözülmüş. Süre etkili, bu yöntem gelişimsel olgunlaşma sonra normal gelişim süreçleri bozmak değil olarak uygulanmış olması gerekir ve bu hala onun Yönetim³önce hayvanlar aktarmak için bir gereklilik olduğu anlamına gelir. Bu yöntem de yollar sinyal, hayvanlar üzerinde göze çarpan etkileri onlar yaş olarak sonuçlanan birden çok cep (Örneğin, bir ömrü uzatma veya değiştirilmiş bir proteostasis) kullanılan C. elegans ^{5suşu bağlı olarak etkiler, 6,7,8,9,10}. Akış Sitometresi yöntemleri otomatik olarak sıralamak ve bireysel C. elegans bir çok iyi tabaktan başka bir¹¹' e aktarın. Bu yöntem çok etkili ve verimli iken, akış sitometresi prohibitively pahalı ve pek çok araştırmacı için ulaşılmaz cihazıdır. Hayvanlar aktarma alternatif sıcaklık hassas sıcaklık ayarı¹²ile steril hale fer-15 ve fem-1, gibi mutant modelleri kullanmaktır. Mutant hayvanlar kullanarak bazı durumlarda yararlı olmakla birlikte, bu belirli suşları vahşi-türü hayvanlar daha yavaş büyür ve değiştirilmiş bir soykırım, eskime veya sağlıklı solucanlar için zavallı temsilcileri olarak hizmet veren güveniyor. Buna ek olarak, kısırlık ikna etmek için bir sıcaklık üst karakter üzerine güven aynı zamanda statik ortamı yokluğunda sonuçlar ve sıcaklık değişiklikleri kolayca gösterilmiştir gen ifadeleri^13,14, etkilemek için ¹⁵. araştırma grupları daha önce teknikleri C. elegans boyutu¹⁶tarafından filtre uygulamak için bir kafes kullanımını açıklayan yayınlandı. Ancak, biz bu tür filtre kullanımı ile ilişkili olabilecek genel sağlık sonuçları herhangi bir değişiklik için test önceki iş bulmak koyamadık.

Böylece, çok sayıda hayvan kültür plakalar arasında aktarmak için ekonomik, verimli, hızlı ve doğru bir yöntem için C. elegans araştırma topluluk içinde bir ihtiyaç olduğunu. Biz ekipman ( Caenorhabditis elek olarak adlandırılır) ve onun üretim ve C. elegans araştırma topluluğu dizayn çalışması için ilişkili bir protokol bir geliştirilmiş, erişilebilir parça geliştirdik. Burada, tasarım Caenorhabditis elek ve yöntemlerin kullanımı için paylaştığımız ve biz kullanımı yaygın sağlık ya da herhangi bir stres işaretleri çift el ile malzeme çekme ve yaygın olarak kullanılan bir tedaviyle karşılaştırıldığında etki etmez göstermek, doğurganlık kısıtlama kimyasal FUDR.

Protokol

1. Caenorhabditis elek İnşaat ve kullanım

1. İnşaat iletişim kuralı
   1. 2 kapaklar 50 mL konik tüpler (Şekil 1A) dan elde etmek.
   2. Çıkarmak belgili tanımlık merkezi alan (alttan Şekil 1Bgörüntülendiğinde) kapaklarının iç dudak içinde Bunsen brülör ve bir sıcak metal sonda veya bir havya kullanarak veya drill bit bastı.
      Not: daha az yaralanma riski olduğundan ve plastik kapak kesmek için ısı kullanarak bir bıçak için tercih edilir.
   3. Temiz ve kesilmiş kenarları kum ve kavisli bir dosya veya bir rotary Aracı (Örneğin, Dremel) zımpara ile yüzey top. Şekil 1 cbakın.
   4. Monofilament ağ çemberi uygun çap (Şekil 1 d) kesti. Bunun için bir fırça kılı naylon mesh levha üzerine bir kapak izleme ve çizilen çizginin içine kesti.
   5. Oluklar/eğik çizgi (Şekil 1E) plastik tutkal uygulandığında iki kapakları yapışma geliştirmek için kapakları üst yüzeyine oyulmuş.
   6. Etanol kapaklı temiz ve kuru bırakın.
   7. Cyanoacrylate tutkal dış kenarına tutmak her iki kapaklarında, üst yüzeyine uygulamak.
      Not: biraz tutkal uzun bir yol gidiyor.
   8. Monofilament ağ, Tablo 1göre bir yapıştırılmış kapak (Şekil 1F) yattı. Yer üstünde tepe-in kafes ters ikinci kapak; Her iki kapakları üst kısımları birlikte olması gerekir. Basın sıkıca birlikte (Şekil 1G). Mesh gergin olduğundan emin olun.
      Not: kullanım cımbız mesh kapakları yerleştirmek için bir güvenlik önlemi olarak.
   9. İlk katman tutkal kuruduktan sonra bir yüzük cyanoacrylate tutkal kapakları arasındaki dış boşluğu çevresinde geçerli. Bu bütünlük ekler ve apart ya da sızıntı herhangi bir peeling engeller gibi cömert olun.
   10. Filtre monofilament kafes kafes gözenek büyüklüğü ile etiketleyin.
       Not: Burada, iki kafes gözenek boyutunu kullan — 20 µm ve 50 µm.
2. İletişim kuralı kullanın
   1. Elek önceden ıslak.
      1. M9 gibi tuzlu bir çözüm pipette [NaCl, 6 g Na₂HPO₄, KH₂PO₄, 1 ultrasaf H₂O L ve 1 mL MgSO₄ (1 M) 3 g, 5 g]¹⁷, elek bir damlacık oluşturur kadar merkezi aracılığıyla , yoğunlaşarak ve damlar filtre alt (Şekil 2A) Merkezi kapalı. İsteğe bağlı olarak, şeklin altına hav bırakmayan mendil (Örneğin, Kimwipe) uygulamak veya nem damlacık mesh üzerinde yayılmış.
      2. Elek 50 mL konik tüp yerleştirin. Tüp 'Atık tüp' olarak etiketleyin (Şekil 2B).
   2. C. elegans nüfusu bir agar plaka kapalı yıkayın.
      1. M9 arabellek Tabağını yıka ve solucan içeren orta monofilament kafes 1 mL topside vasıl a zaman (Şekil 2C) yerleştirin. Mesh Merkezi'nde çalışmaya emin olun. Tüm solucanlar plaka yıkayın.
         Not: Genellikle, M9 3 mL 60 mm plaka için yeterlidir.
      2. Pipetting içinde kayıp solucanlar sayısını en aza indirmek için bir cam Pasteur pipet solucanlar plaka kapalı ve kafes Merkezi (gerektiği gibi tekrar) üzerine taşımak için kullanın.
      3. M9 arabellek üstten filtresiyle durulayın. Yine, mesh merkezinde çalışan ve o bölgede tüm solucanlar durulama emin olun. Tüm bakteri ve daha küçük solucanlar kafes geçti emin olmak gerektiği gibi birçok kez yıkayın.
   3. Elek boyutu eşlemeli hayvanlardan hasat.
      1. Elek, Yetişkin solucanlar adım 1.2.2.3 yeni koleksiyon tüp (Şekil 2B) içine bakan ile üst yeni 50 mL konik tüp takın.
      2. İlk tüp (atık tüp) kaldırmak ve hızlı bir şekilde geçiş--dan damlacığı tutmak için yeni tüp ve elek üzerine çevirmek (Şekil 2E).
         Not: kısırlık gerekli değilse, hav bırakmayan bir silme (Örneğin, Kimwipe) fitil sıvısı için saygısız önce kafes altından kullanın.
      3. M9 ile kafes içine yeni 50 mL tüp yeni topside (Şekil 2F) sizden durulayın. Yine, kafes ortasında kullanımı ve bir damlacık mesh alt bakımı.
      4. Solucanlar yerleşmek veya yavaşça onları aşağı spin izin (Örneğin, < 16 x g) yaklaşık 1 dk (Şekil 2 g) için.
      5. Solucanlar, Pelet arabellek çözümden ideal aşağı Aspire edin > 0.5 mL, veya pelet bozmadan mümkün olduğu kadar sıvı kaldırın.
      6. Bir cam Pasteur pipet NGM plaka üzerine kullanarak solucanlar pipette ve koyup kuruyuncaya kadar bırakın. Onlar daha hızlı (Şekil 2 H) Kuru böylece birden çok damlacıkları dışarı yeni bir tabağa uzay.
   4. Elek temiz.
      1. Elek yavaşça ve iyice etanol ve ters osmoz su ile durulayın. Kurumasını bekleyin.
      2. Belirsiz gelecekte kullanmak için temiz bir kapta saklayın.
      3. Zaman mesh "sag" görünümünü geliştirir atmak.

2. sıralama yöntemi Caenorhabditis elek doğrulama

1. Genel bakım
   1. Tüm deneyler için kültür solucanlar üzerinde standart bir yuvarlak solucanlar büyüme medya¹⁷ (1 litre NGM oluşur pepton, 17 g agar, NaCl, 3 g çift distile su, 5 mg/mL kolesterol, 1 M CaCl₂ 1 mL 1 mL 975 mL 2.5 gram 1 mL 1 M MgSO₄, 25 mL 1 M KHPO₄ve 100 mg/mL streptomisin 0.5 mL) 25 ° C'de
2. Deneysel bir tedavi yönetimi
   1. Üç tedavi grupları karşılaştırın: çekme, fluorodeoxyuridine (FUDR) ve Caenorhabditis elek.
      1. FUDR tedavi grubu için herhangi bir döl önlemek için 100 mikron son bir konsantrasyon NGM medyaya 100 mg/mL FUDR eklemek ve solucanlar her geçen gün gıda tükenmesi önlemek için bir taze NGM tabağa aktarın.
      2. Seçim grubu için seçmek ve platin bir döngü kullanarak el ile solucanlar aktarmak.
      3. Caenorhabditis elek tedavi grubu için izlemek adım 1.2 ve solucanlar bir NGM plaka üzerine pipette.
3. Caenorhabditis Elek yüzde verim
   1. Ne kadar etkili elek C. eleganssıralama yönü olduğunu ölçmek için gün 1 25 ° c (yani, yumurta döşeme sonra 48 h) erişkin yaş zaman uyumlu N2 hayvanlar büyümeye ve sonra taze NGM plakaları için seçerek aktarmak (Toplam alma N = 50 veya N tre başına 100 hayvan = atment grup).
   2. Yeni NGM plakaları için nüfus kurtarma, 24 h aktardıktan sonra yukarıdaki takip Caenorhabditis elek ile (bkz. Adım 1.2) protokol ve başarıyla aktarılan hayvanları saymak.
   3. Hayvanlar ile karşılaştırıldığında 100 (%) ile çarpılmış transfer başlangıç sayısı başında transfer miktarının oranı olarak yüzde verim hesaplayın.
4. Healthspan deneyleri
   Not: healthspan parametreleri hareketliliği sınıfı, faringeal pompa hızı ve hem anterior ve posterior nazik dokunuş yanıt günlerde 2, 4, 6 ve 8 erişkin yaş senkronize N2 hayvanlar 25 ° C'de muhafaza için puan edinildi
   1. İzleme hareketliliği
      1. Sınıf tabanlı bir sistemi (sınıf A, B ve C) temelinde hareketliliği puanları atamak Herndon vd yöntemleri takip ¹⁸. bir sıralı lojistik istatistikleri modeli istatistiksel analiz yazılımı kullanarak üç deneysel grupları etkileri karşılaştırın.
         Not: Sınıf A bireyler kendiliğinden bir normal, sinüs desen taşımak. Sınıf B bireylerin belirgin sinüsoidal hareketlerinde taşımak ve hareketi teşvik etmek için dürtmeye gerektirebilir. C sınıfı bireyler dürtmeye karşılık onların baş ve/veya kuyruk hareket ama agar arasında hareket edemiyoruz.
   2. Faringeal pompa hızı
      1. Değirmeni hareketi hayvanın terminal faringeal ampul bir stereomicroscope 600 X 1 dk. için son büyütme altında görsel olarak say.
      2. α ile tek yönlü ANOVA ile istatistiksel analizi yapmak 0,05 ve Bonferroni sonrası testlerle α = 0,05 =.
   3. Dokunmatik yanıt
      1. Nazik dokunuş yanıtı kaydettikten ve üç tedavi grupları arasında karşılaştırın. Calixto vd tarafından açıklanan yöntemleri temel alan deneyleri yapmak ¹⁹.
      2. Kayıt anterior ve posterior yanıt yavaşça kirpik kıracağı dik kuyruk veya hayvanlar Başkanı (5 x, alternatif baş ve kuyruk) boyunca okşayarak tarafından dokun.
      3. Herhangi bir hareket kontur ters yönde bir ölçekte 1 puan 0-5 olarak hem anterior ve posterior yanıt için puan.
      4. α ile tek yönlü ANOVA ile istatistiksel analizi yapmak 0,05 ve Bonferroni sonrası testlerle α = 0,05 =.
5. Verimlilik tahlil
   1. Üreme Caenorhabditis elek'ın etkisi kullanımı belirlemek için yaş zaman uyumlu N2 hayvanlar yetişkinlik 25 ° C'de 2 gün büyümeye
   2. 60 yumurta sonra h hayvanlar yeni NGM tabak platin bir çekme veya Caenorhabditis elek ile transfer ve 4 h kurtarmak için onlara (20-30 dk için elenmiş tabak kuru).
   3. Kurtarma, tek tek bir kirpik ile hayvanlar NGM plakaları için almak plaka sonra onları yumurtlamak için 24 saat ver ve hayvanlar kaldırın. Döl her tabakta başka bir 24 h için 25 ° c normal şartlarda geliştirmeye olanak sağlar.
      Not: Tırnak cilası ile Pasteur pipet sonu için güvenli ve etanol ile sterilize insan bir kirpik kirpik kıracağı var.
   4. Uygun F1 üretimi bireylerin saymak. Bir istatistiksel analiz kullanarak bir T-test ile α = 0,05.
      Not: Canlı yavru başarıyla yumurtadan ve gelişimleri normal larva döngüleri ile başlayan yumurta olarak kabul edilir.
6. Floresan muhabir stres yanıt deneyleri
   1. Stres potansiyeli işaretleyicileri algılamak için üç yaygın olarak kullanılan floresan muhabir deneyleri yapmak: çekirdeklerin içine bir DAF-16::GFP translocation hücrelerinin bir zorlanma [TJ356-zIs356 (pDAF-16::DAF-16-GFP; rol-6)]²⁰; hsp-16,2 ifade [TJ375-gpIs1 (hsp-16.2p::GFP)]²¹; ve çimen-3 ifade [CF1553-muIs84([pAD76]sod-3p::GFP+rol-6[su1006])]²².
   2. Her tahlil için 20 ° C'de üç tedavi gruplarından yaşında zaman uyumlu hayvanlar kültür ve erişkin 3 gün inceleyebilirsiniz: bir negatif kontrol kullanın (günlük olarak, el ile bir platin pick ile hayvanların bir grup transferi), pozitif bir denetim (üstünde a günlük temel bir grup hayvan platin bir çekme artı kurulan bir tetikleyici ile elle aktarmak) ve Caenorhabditis Elek (hayvanlar elekten geçirmek ve onları NGM üzerinde 30 dk önce sadece görüntüleme yeniden elde etmek için izin).
   3. DAF-16::GFP assay olarak, Isı şok olumlu denetim hayvanlar için 30 dk 37 ° C'de²⁰Imaging önce. Hsp-16,2 tahlil için ısı şok olumlu denetim hayvanlar 90 dk,²¹Imaging önce 20 h için. Çimen-3 tahlil için²²Imaging önce 100 mM bozması 4 h için olumlu denetim hayvanlarla tedavi.
   4. Solucanlar hemen kirpik kıracağıyla hasat ve solucanlar hareketsiz için % 36 poloxamer 407 yüzey aktif çözüm 1 μL ile bir coverslip için mount.
   5. Başka bir coverslip takılı kurtlarla sandviç. İki coverslips bir standart cam mikroskobu slayt ve görüntü ters bir Floresan Mikroskobu (için genel bir büyütme 80 X) üzerinde bir 8 X büyütme ve sürekli maruz olan bir FITC filtre kullanarak solucanlar bağlayın.
   6. DAF-16::GFP tahlil üç grup arasındaki farklılıkları algılamak için DAF-16::GFP muhabir (muhabir sitozol ve ara Eğer bulunsa muhabiri hücre çekirdeği, sitozolik translocated Eğer nükleer konumunu temel alan hayvanlar kategorilere ayırma muhabir) çekirdeği ve sitozol bulunan.
   7. Bir sıra lojistik istatistiksel model istatistiksel analiz yazılımı kullanarak sonuçları karşılaştırın. α ile tek yönlü ANOVA hsp 16,2 ve çimen-3 ifade deneyleri kullanmak için = 0,05 ve Tukey'nın post hoc testlerle α = 0,05 baş bölgesinin toplam floresans karşılaştırmak için.

Sonuçlar

Caenorhabditis Elek 2 vidalı kapakları dokuma naylon monofilament kafes organizmaların basit yıkama tekniği kullanarak canlı nüfus ayıklamak için kullanılan istenen gelişimsel yaş, vücut çapından daha küçük bir alanı güvenliğini sağlama oluşur. Bu standart konik tüpler için ekler ve mesh ekran mekanik olarak istenen hayvanlar tüp daha fazla bakım ve deneme (Örneğin, havalesi ya da genetik hasat) hazır bırakarak gövde çapı göre hayvanlar...

Tartışmalar

Burada, tasarım ve sıralama ve C. eleganssürdürmek için bir araç olarak kullanmak erişilebilir, etkili Caenorhabditis elek, tanıttı. Bu araç, bireysel hayvanlar, nüfus, kimyasal işlemler (Örneğin, FUDR) ve daha pahalı Yöntemler yavru hayvan yıkama el ile seçmek için çeşitli yararları vardır. İlk olarak, Caenorhabditis elek verimli ve hızlı bir şekilde büyük karışık nüfus (Tablo 2) hayvanların Döl (az 20 dk) sıralar. Ayrıca, aracın ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Safety glasses	Uline	S-21076
Protective heat resistant glove	Grainger	Item # 3AT17 Mfr. Model # 3AT17 Catalog Page # 1703
50 mL conical tube	Falcon	14-432-22
Synthetic Nylon mesh	Dynamic Aqua-Supply Ltd	NTX20 and NTX50
Cyanoacrylate glue	Scotch Super Glue Liquid	SAD114
Pliers	Vampliers	VMPVT-001-8
Dremmel tool with circular file	Lowe's	Item # 525945 Model # 100-LG
FUDR	Sigma	F0503
M9 chemicals ( NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, MgSO4)	Sigma	S7653, RES20908-A7, 1551139, M7506
NGM plate chemicals (Bactopeptone, Agar, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2,Cholesterol, Streptomycin)	BD Biosciences (bactopeptone) , Lab express (agar), Sigma ( rest)	BD bioscience 211677, Lab Express 1001,  Sigma 1551139, 1551128, C1016, C8667, S6501
Pluronic F-127	Sigma	P2443
Paraquat dichloride hydrate	Sigma	36541
Inverted fluorescence microscope	Olympus	FSX100