Bioassay-güdümlü ayırma kullanarak deniz taşemen Feromonlar tanımlaması

Özet

Burada, ayırmak ve yapısını, koku kudret ve deniz lampreys, sözde feromon bileşiklerin davranışsal yanıt karakterize bir iletişim kuralı mevcut.

Özet

Bioassay-güdümlü ayırma Kılavuzu yalıtım ve bir etkin feromon bileşik tanımlaması için fizyolojik ve davranışsal biyoanalizler sonuçlarını kullanır yinelemeli bir yaklaşımdır. Bu yöntem başarılı alan nitelik özellikleri kimyasal sinyallerin Feromonlar hayvan türlerinin geniş bir alanda olarak bu işlev sonuçlandı. Deniz lampreys davranış ya da fizyolojik yanıt aracılık Feromonlar tespit etmek için koku alma üzerinde güveniyor. Biz bu bilgi balık biyoloji sözde Feromonlar işlevlerini yerine koymak ve Kılavuzu yalıtım ve etkin feromon bileşenleri tanımlaması için kullanın. Kromatografi ayıklamak, konsantre ve bileşikleri şartına sudan ayırmak için kullanılır. Elektro-olfactogram (EOG) kayıtları hangi kesirler koku yanıt-e doğru çıkarmak belirlemek için yapılmaktadır. İki seçenekli labirent davranış deneyleri daha sonra herhangi bir kokulu kesirler de davranışsal etkindir ve neden bir tercih belirlemek için kullanılır. Spektrometrik ve spektroskopik Yöntemler moleküler ağırlık ve yapısı aydınlatma ile yardımcı olacak yapısal bilgiler sağlar. Bioactivity saf bileşiklerin EOG ve davranışsal deneyleri ile doğrulanır. Labirent içinde gözlenen davranış yanıt sonuçta kendi işlevleriyle bir doğal akışı ayarı onaylamak için bir alan ortamda doğrulanması. Bu biyoanalizler 1) ayırma işlemi yol ve 2) onaylamak için ikili bir rol oynar ve daha fazla ayrılmış bileşenleri bioactivity tanımlamak. Burada, bioassay güdümlü ayırma yaklaşım yarar reaksiyonların bir deniz taşemen feromon kimlik temsilcisi sonuçları raporu. Deniz taşemen Feromonlar tanımlaması invaziv deniz taşemen Laurentian göller denetlemek için kabul seçenekler arasında bir modülasyon feromon iletişim sistemi olduğu için özellikle önemlidir. Bu yöntemi özellikleri geniş bir dizi iletişim kimyasal karakterize ve su bazlı kimyasal ekoloji ışık için kolayca adapte edilebilir.

Giriş

Feromonlar gıda kaynakları bulma, yırtıcı algılama ve conspecifics¹sosyal etkileşimlerin arabuluculuk yardım bireyler tarafından yayımlanan belirli kimyasal sinyaller. Feromon iletişim böceklerde de okudu²olmuştur; Ancak, kimyasal kimlik ve suda yaşayan omurgalı Feromonlar biyolojik fonksiyonu olarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir değil. Kimlik bilgisine ve serbest Feromonlar fonksiyonu tehdit türlerin^3,4 veya kontrol haşere türü^5,6kurtarma kolaylaştırmak için uygulanır. Bu tekniklerin uygulama yalıtım ve karakterizasyonu biyoaktif feromon bileşenleri gerektirir.

Feromon kimlik doğal ürün Kimya bir dalıdır. Feromon araştırma sürüyor kısmen feromon moleküller kendilerini yapısı nedeniyle sınırlı olmuştur. Feromonlar çoğu kez kararsız ve küçük miktarlarda yılında yayımlanan ve uçucu^7,8 , suda çözünen bileşikler⁹dakika miktarda algılamak için sadece birkaç örnekleme teknikleri adlı biri yok. Feromonlar tanımlamak için bir yaklaşım bilinen bileşikler, 2) metabolomics ve 3) bioassay-güdümlü ayırma hedeflenen 1) bir tarama içerir. A hedeflenen perde bilinen bileşikler ticari olarak mevcut metabolik yan ürünleri Feromonlar çalışması için olan fizyolojik süreçlerin sınar. Araştırmacılar sadece bilinir ve kullanılabilir bileşenler test edebilirsiniz çünkü bu yaklaşım sınırlayıcı olduğunu. Ancak, Japon balığı cinsiyet hormonları başarılı tanımlaması bu işlevi Feromonlar^10,11,12olarak sonuçlandı. Metabolomics biyolojik sistem¹³içinde potansiyel küçük molekül metabolik ürünler ayıran ikinci bir feromon kimlik bir yaklaşımdır. İki grubun (yani, bir etkin ve etkin olmayan bir özü) metabolik profilleri karşılaştırılması potansiyel bir metabolik profili kimliği sağlar hangi metaboliti saf üzerinden, yapısı aydınlatılmamıştır ve bioactivity teyit edilen¹⁴yaşında. Özel karışımlar karmaşık formülasyonları katkı maddesi ya da sinerjik etkileri metabolitleri birlikte yerine kesirler¹³bir dizi olarak kabul edilir çünkü metabolomics ile tespit edilebilir olasılığı daha yüksektir. Ancak, elde edilen verileri yeni yapıların aydınlatma kolaylaştırmak değil çünkü metabolomics uygulanması sentetik başvurular kullanılabilirliğine dayanır.

Bioassay-güdümlü ayırma yaklaşımdır iki alanı kapsayan bir entegre, yinelemeli: kimya ve biyoloji. Bu yaklaşım kılavuzu yalıtım ve bir etkin feromon bileşik tanımlaması için fizyolojik ve davranışsal biyoanalizler sonuçlarını kullanır. Ham bir özü bir kimyasal özelliği (yani, moleküler boyutu, polarite, vb) tarafından şeker ve elektro-olfactogram (EOG) kayýtlarý içeren ve/veya bir bioassay test edilmiştir. Biyoaktif bileşenler ayırma ve EOGs ve/veya biyoanalizler aşağıdaki adımları tekrar ederek dışarı ekranlı. Saf aktif bileşikler yapılarının moleküler ağırlık ve bahçedeki sentezlenmiş için bir şablon oluşturmak için yapısal bilgi sağlayan spektrometrik ve spektroskopik yöntemler tarafından aydınlatılmamıştır. Bioassay-güdümlü ayırma farklı metabolitleri ve potansiyel olarak Roman Feromonlar biyosentetik yolları öngörülen vermemektedirler benzersiz kimyasal iskeletler ile yol açabilir.

Burada, biz yalıtmak ve erkek deniz taşemen seks feromon bileşiklerin bioactivity karakterize için kullanılan bioassay güdümlü ayırma iletişim kuralı tanımlamak. Deniz taşemen (Petromyzon marinus) Bu balıklar ağır üç ayrı aşamadan oluşan anadromous onların yaşam öyküsü arabuluculuk kimyasal cues koku algılamayı dayandığından feromon iletişim eğitim için ideal bir omurgalı modelidir: Larvalar, çocuk ve yetişkin. Deniz taşemen larvaları tatlı su akışları tortu yuva, köklü bir metamorfoz geçmesi ve bir göl veya nerede büyük konak balık parasitize okyanus geçirmek gençlere dönüştürün. Ana bilgisayar balıktan ayırma sonra yetişkin yumurtlama akarsu geri akışı yerleşik larva^15,16,17,18tarafından^{,19 serbest göçmen Feromonlar rehberliğinde göç} . Olgun erkek yumurtlamabölgelerine dönmek çıkmak, arkadaşları çekmek, yaklaşık bir hafta için zaman zaman spawn ve sonra^15,20ölmek çok bileşenli seks feromon serbest. Deniz taşemen Feromonlar tanımlaması önemli çünkü bir modülasyon feromon iletişim sisteminin Laurentian büyük göller²¹invaziv deniz lampreys kontrol etmek için kabul seçenekler arasında yer alıyor.

Protokol

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi, Michigan State University (AUF # 03/14-054-00 ve 02/17-031-00) tarafından onaylanmış olması.

1. toplama ve çıkarma deniz taşemen su şartına

1. Yer cinsel olgun erkek deniz lampreys (15-30 hayvanlar) 250 L 16-18 ° C'de tutulan gazlı göl Huron su ile birlikte bir su tankında
2. Her gece boyunca erkek şartına su Haziran ile Temmuz için toplamak.
   Not: deniz lampreys doğal yumurtlama sonra ölür. Bir balık onun hayatında bu noktaya yaklaşıyor olan taze ve olgun bir erkek yerine.
3. Katı faz çıkarma tarafından şartına su ayıklayın.
   1. Reçine metanol 4 h için bir sütuna yüklemeden önce ıslatın. Reçine sütuna yük, o zaman 10 L su sütunu boyunca organik çözücü ortadan kaldırmak için pompa.
   2. Klimalı su tankı balık üzerinden pompalama sistemi için sütunun üstünde tutan geçmek. Bir yatak dört bir dizide bulunan Orta kutup polimerik iyon değiştirme reçine (e.g., Amberlite XAD-7 HP reçine), 2 kg su geçer 2.5 L kapasiteli cam sütunlar. Yükleme hızı 400 ve 600 mL/6 dk. metabolitleri 10 litre metanol ile hemen aseton 5 L tarafından takip Elute arasında korumak.
      Dikkat: Bu adımı metanol ve aseton kullanır. İkisi de yanıcı ve zehirli.
      Not: Havuza alınan kalan-80 ° daha fazla işlenen kadar C saklanır.
4. Sütun (yaklaşık 10 L) su ile yıkayarak zenginleştirme 1 hafta sonra yeniden etkinleştirin.
5. Organik çözücü (metanol ve su karışımı) kaldırmak ve düşük basınç (altında 300 mbar) 40 ° C'de altında 5 h için çevirme buharlaşma tarafından özü hasat Su kalıntı dondurma kuru kadar 48 h-20 ° C'de lyophilization kurutma makinesi tarafından konsantre ol.

2. izolasyon-in kesir havuzları kromatografi ile

1. Silika jel (230-400 mesh) ilk mobil faz 30 dk. Transfer için jel bir cam sütun için çözücü (süspansiyon) ile ıslatın. Mobil faz üzerinden gitmek izin vermek için sütun vanayı aç. Silika jel çökelti ve silika jel yatak oluşturmak olanak sağlar.
2. Özler silika jel (70-230 mesh) ile iyice karıştırın ve silika jel yatağa sıvı kromatografi sütuna yükleyin. Onları bir gradyan % 95 CHCl₃ (kloroform) ile elute / MeOH (metanol) % 100 MeOH, toplam hacim içinde 2.5 L. Bireysel şişeleri (her 10 ml) eluent toplamak.
   Dikkat: Bu adımda kullanılan kloroform zehirli bir reaktif olduğunu.
3. Eluents 20 kesirler göre ince tabaka Kromatografi (TLC) analiz havuzu kılavuz.
   1. TLC deney öncesi kaplı silika jel tabaklarda örnek başlangıç çizgisine uygulanması ve gelişmekte olan çözücüler (polarizasyonu CHCl₃ oranında metanol için % 100-0 Seç) kapalı bir cam plaka başlangıç çizgisine çeker yerine getirilir Tank.
   2. Çözücü 0,3 arasında değişen her TLC noktalar saklama faktörü (R_f) yapmak için geliştirme oranı seçin - 0.8.
   3. Satır sonu gelişmekte olan çözücü ulaştıktan sonra plaka havuzdan al ve solvent buharlaşır için 10 dk bekle.
   4. Belgili tanımlık yer ilk UV 254 nm ve sonra leke ışığı altında görselleştirmek onları % 5 anisaldehyde (20 μL) bir kromatografi püskürtme tarafından bir asidik metanol çözümü ile püskürtme ve onları 3 dk 85 ° C'de Isıtma onları.
      Not: TLC plaka üzerinde renkli noktalar kesir ana bileşeni belirtir.
   5. Eluent 20 kesirler spot renk ve ana bileşeni R_f benzerlik göre için birleştirin.
4. Yaklaşık 30 dakika için 40 ° C'de düşük basınç (çözücüler mülkiyeti göre 300 mbar) altında çevirme buharlaşma tarafından kesir bir kalıntı için konsantre.

3. Elektro-olfactogram (EOG) kayıtları kokulu kesirler/bileşenleri tanımlamak için

1. Borosilikat cam kılcal çekin (dış çap: 1.5 mm; iç çap: 0,86 mm; uzunluğu: 100 mm) bir micropipette ile çektirme ısıtıcı düzeyi ayarlamak için 65.
2. Puan edinildi ve cut bir cam elmas uçlu kesici ile kılcal ucundaki açma ve erimiş %0,4 agar % 0,9 serum fizyolojik ile doldurun. Kılcal ucu açılışında çapı yaklaşık 10 µm olmalıdır.
3. Adımları 3.1-3.2 ve katı hal elektrotlar sahipleri çekti kapiller elektrotlar ön fabrikasyon 3 M KCl bir micropipette kullanarak ile Ag/AgCl granül (bkz: Malzemeler tablo) ile dolgu.
   Not: herhangi bir hava kabarcıkları kılcal veya Elektrot tutucu çıkarmak.
4. Çekti elektrot elektrot sahipleri yerleştirin.
5. 10^-5 M 100 mL hazırlamak L-arginin kömür filtre su 10^-2 M L-arginin hisse senedi çözeltilerine volumetric flask deiyonize su (4 ° C'de depolanan) üzerinden. 10^-5 M 20 mL transfer L-arginin bir cam şişe için.
6. Konsantrasyon-yanıt eğrisi için kesir havuzlarının adım 2.3 cam şişe içinde 10 kat dilutions 10 mL hazırlayın. Her gün önce deneyler taze dilutions hazırlamak ve onları bir gün içinde kullanın. Sıcaklığı 8 ° C'ye equilibrate izin vermek için dolaşım bir su banyosu çalışma çözümleri, L-arginin ve kesir havuzu dilutions cam şişe koymak
7. 3-aminobenzoic asit etil ester (MS222; 100 mg/L) ile taşemen anestezi ve gallamine triethiodide (3 mg/kg vücut ağırlığı, % 0,9 serum) bir kas içi enjeksiyon ile steril bir şırınga hareketsiz.
   Not: Anestezi yeterli derinliğe no gill hareket, dik bir duruş korumak için bir yetersizlik ve hiçbir emme sözlü onun yuvarlak yüzey istimal belgili tanımlık tank kenarlarına gözlemci tarafından belirlenir. Herhangi bir mikrobiyal kirlenme öncesi ve ameliyat sırasında en aza indirmek için steril eldiven giymek ve % 70 etanol (v: v) diseksiyon araçlarında en az 10 dk kullanmadan önce deiyonize su ıslatın.
8. V şeklindeki standı imzalat taşemen yönlendirmek ve kurutulma önlemek için ıslak kağıt havluyla sarın.
   Not: solungaç açıklıklar engel değil.
9. Gazlı su 50 mg/L MS222 bukkal kavite içine içeren recirculating bir tüp takın, akış hızı ayarlamak ve gill açıklıklar sürekli solungaçları sulamak için su yolu ile çıkarken sağlamak.
10. Steril neşter ve forseps kullanın [1,25 X büyütme, stereoskopik mikroskop altında ( Tablo malzemelerigörmek)] koku epitel ortaya çıkarmak için koku kapsül yüzeyi cilt 5 mm² bölümünü kaldırmak için.
11. Propil teslim boru filtrelenmiş su ile yıkayın ve bir micromanipulator üzerinde sıva üstü Vana bağlayın. Propil teslim kılcal tüp filtrelenmiş su kuruma odorants yönetirken değil önlemek için koku epitel sunmak için micromanipulator kullanarak koku epitel kavite içine koyun.
12. Kayıt ve başvuru elektrotlar micromanipulators üzerinde bağlayın. Referans elektrot naris yakınındaki dış deri üzerine indir. Stereoskopik mikroskop (1,25 X), daha düşük koku epitel yüzeyi çok az dokunmak kayıt elektrot kullanarak.
13. Propil teslim tüp alımını filtre arka plan su 10^-5 M L-arginin çözüm için transfer.
14. Bilgisayar, amplifikatör (DC modunda), filtre ve çizim tablası açınız. Vana sürücü yazılımını kullanarak program propil 4 bir s tek darbe T 4 olarak ayarlamak T1, kutusunu işaretleyerek yönetmek için bu yordamı s ve T2 kutunun işaretlenmesi.
15. Veri toplama yazılımı (bakınız Tablo malzemeler), ayarla toplama modu için yüksek hızlı bir osiloskop, oyun simgesini tıklatın ve propil darbe tetiklemek için Vana sürücü Başlat ' ı tıklatın.
    Not: Veri toplama yazılımı otomatik olarak fark EOG yanıt genlik 20 kaydeder s (3 önce 4 s s propil darbe ve 13 sırasında daha sonra s). Kayıt elektrot, referans elektrot veya L-arginin standart en fazla yanıt ve bir çok az yanıt-e doğru boş denetim (sinyal-gürültü oranı artırmak için propil teslim tüp konumlarını manevra için micromanipulator kullanın filtrelenmiş su). Zemin elektrotlar hareket ederken AC-DC amplifikatör anahtar GND için değiştirme'yi amplifikatör.
16. Boş kontrolü, L-arginin ve sonra adım 3.6'düşük 2 dk floş süzülmüş su ile yüksek konsantrasyonları uygulamalar arasında hazırlanan odorants kaydetmeye başlamak.
17. Yanıt test edilecek tüm odorants için kayıt sonra amplifikatör zemin ve dikkatle elektrotlar ve propil teslim kılcal tüp geri çek. Onaylanmış kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) yöntemleri, EOG deney sona ermesi, takip ötenazi ile MS222 aşırı dozda imzalat taşemen (1 g/L).
    Not: başarılı ötenazi gill hareketi ve kalp atışı en az 5 min beyin pithing tarafından takip için eksikliği işaret ederek doğrulayın.
18. Analiz ve analiz yazılımı kullanarak verileri çizmek. Yanıt-e doğru boş su kontrolü büyük temin kokulu kesirler tanımlamak için odorants²² algılama eşiği belirlemek. Boş su kontrolü farklı konsantrasyon bağımlı koku yanıt temin kesir havuzları sonra bir davranış tahlil (adım 4) test edilir.

4. iki seçim labirent davranışsal aktif kesirler/bileşikler tanımlamak için davranış Bioassay

1. Cinsel Olgun kadın deniz taşemen labirent yayın kafeste alışmana ( ek Şekil 1bakınız) için 5 dk. labirent içinde nehir su akış hızı korumak
   Not: Labirent vernikli deniz sınıf ahşap ve önlemler 6.5 m uzunluğunda ve 1, 2 m genişliğinde bir bölücü 2.7 m uzunluğunda ters yönde sonunda iki kanal içine labirent ayırmak için ölçme ile inşa edilmiştir. Su içine labirent geçici olarak yönlendirilir. Su derinliği 0,19 m., saklanması gereken ve hız 0,07 m/s ± 0,01 muhafaza edilmelidir.
2. Deniz taşemen yayın ve taşemen deneysel geçirdiği zaman ve denetim kanalı içeren her nehir su 10 dakikadır kümülatif miktarı kaydetmek.
   Not: deniz taşemen deneysel girin ve en az 10 için kanal denetlemek başarısız olursa bu 10 dk dönemde s son deneme bu hareketsizlik ya da güçlü yan önyargı bir göstergesi olarak.
3. Test uyarıcı uygulamak (yani, 10^-12 M, sözde bir feromon % 50 metanol/deiyonize su içinde çözünmüş) rasgele atanan deneysel kanal ve kanal denetimi kullanarak araç (% 50 metanol/deiyonize su) peristaltik 5 min için pompalar 200 mL/dk sabit bir fiyatla.
   Not: Electro-olfactogram kayıtları ile belirlenen test uyaran algılama eşik konsantrasyonu davranış testi için başlangıç konsantrasyonu kullanılmalıdır.
4. Test uyarıcı ve aracın ek bir 10 min için geçerlidir ve taşemen geçirdiği zaman toplam miktarını Deneysel kayıt ve denetim kanalı.
5. Labirent sonraki duruşma başlamadan önce 10 min için su ile yıkayın. Yeterli test uyarıcı kullanılabilir 4.1-4.4 en az 7 lampreys ile yineleyin.
6. Bir dizin tercih²² her deneme için hesaplamak ve Wilcoxon imzaladı-rank testi kullanma önemini değerlendirmek.
   Not: Dizin sonuçlarda olumlu veya olumsuz olabilir tek bir numara. Oysa cazibe, değeri tercih Dizin gösterir tercih göstergeler itme dizinin negatif bir değer. Tercih dizin sıfırdan önemli ölçüde farklıysa, kesir etkin olarak kabul edilir.
   
   Burada,
   B_c = propil uygulamadan denetim kanalı test taşemen tarafından harcanan zaman
   B_e = propil uygulamadan deneysel kanaldaki harcanan zaman
   _C = propil uygulamadan sonra denetim kanalı harcanan zaman ve
   _E = propil uygulamadan sonra deneysel kanalda harcanan zaman.

5. kromatografik yalıtım etkin kesirler gelen saf bileşiklerin

1. Tekrarlamak merdiven 2.1-2.4 koku yanıt (adım 3) neden kesir havuzlu ve davranışsal yanıt (adım 4) temin.
2. Daha fazla etkin kesirler Sephadex LH-20 sütun kullanarak boyut-dışlama kromatografi ile bileşikler arındırmak.
   1. 0.5 mL örnek ilk mobil aşamasında hazırlamak [CHCl₃- MeOH (1:1) veya MeOH % 100], bir CHCl₃- MeOH (1:1) sütun ve sonra bir MeOH (% 100) sütun karşılık gelen sütuna yüklemek ve onları bileşikleri vermeye elute.

6. yapı aydınlatma kütle spektrometresi (MS) ve nükleer manyetik rezonans (NMR) ile saf bir bileşik

1. Dağıtılması ve saf bileşik ilk mobil aşamasında yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) yaklaşık 1 μg/ml 10 μL çözüm oluşturmak için (genellikle, metanol su, 1:1, v: v) oranında seyreltin.
   1. Örnek çözüm HPLC şişeleri için aktarmak ve HPLC Otomatik Örnekleyici koymak onları. Örnek (10 μL) electrospray iyonlaşma kütle spektrometresi (ESIMS) enjekte ve yüksek çözünürlüklü electrospray iyonlaşma kütle spektrometresi (HRESIMS) spectra kromatografi kütle spektrometre²³kullanarak kaydedin.
2. Moleküler formülü kütle spektrometre yazılım veritabanında göre tahmin (bakınız Tablo reçetesi)²⁴.
   1. Eklenen örnek kromatografik açın ve kromatografik tepe seçerek onun kitle spektrum elde etme.
   2. Aracı modülü Elemental bileşiminde iyon (m/z) değeri (4 ondalık) ölçülen ayine girdi. PPM tolerance parametre ayarla < 5.
   3. Öğe oluşumu ölçülen molekülünün sığdırmak için sembol parametrelerini ayarlamak. Yazılım moleküler formülü tek kitle analizi dayalı bir tahmin oluşturur.
3. Deuterated çözücüler (600 μL, CH₃OH -d₄ veya DMSO -d₆) örnekleri çözülmeye Protokolü²⁵ göre seçin.
   1. Yaklaşık 0,1 10 mg/mL aralığında değişen bir konsantrasyon ile bir çözüm oluşturmak için seçili deuterated çözücüler örnek tamamen erimesi. Örnek çözüm 1 D (¹H, ¹³C) kaydetmek için bir NMR tüp içine aktarmak ve 2D NMR [¹H -¹H korelasyon spektroskopisi (rahat), heteronuclear tek kuantum tutarlılık (HSQC), heteronuclear çoklu bağ korelasyon (HMBC)] Spectra 900 MHz NMR spektrometresi²⁶.
4. NMR tüp spinner türbin içinde örnek ile yerleştirin. Derinlik mastarı örnek yükseklik ölçme penceresinin ortasında olduğundan emin olmak için kullanın. NMR yazılımını açın (bkz. Tablo reçetesi) ve mıknatıs örnek değiştirmek için Kaldır düğmesini tıklatın.
   Not: magnet mıknatıs tepesinden gelen gaz hissetmek tepesinden bir elini tut. Aynı zamanda, bir ıslık sesi duyulabilir olmalıdır.
5. Yavaşça örnek hava yastığı mıknatıs üstüne yerleştirin ve NMR mıknatısına örnek tekrar inmeye Kaldır düğmesine basın.
   Not: örnek doğru pozisyonda olduğunu belirtmek bir "tıklama" gürültü dinler.
6. Yeni bir veri kümesi oluşturun ve NMR enstrüman tarafından önerilen varsayılan parametreler yük ( Tablo malzemelerigörmek).
   1. Otomatik kilitleme yordamı çağırmak ve solvent istemi sayfasindan seçmek için "kilit" yazın.
   2. İnce ayar için Unlock modelindeki düğmesini Değiştir masası' nda, ayarlamak, imleci işlemek panelindeki ayarlama ve mıknatıs kilit daha.
   3. İstemi Atma sayfa üzerinde bir kaç dakika sürebilir ayarlama yordamı işlemek paneline parametresinde ayarlayın. Devam etmek için ayarlama tamamlanana kadar bekleyin.
   4. Otomatik shimming rutin-e sevketmek içinde "topshim" yazarak başlatın. Titremeden devam tamamlanana kadar bekleyin.
   5. Türü "rga otomatik ayarlamak için" kazanç ayarlar, daha sonra "türü d1 Bakliyat, sonra"türü zg satın başlatmak ve satın alma bitene kadar bekleyin"arasındaki gecikme ayarlamak için" alınıyor.
   6. "Ef" veya "verileri işlemek ve sonra yazın"apk otomatik phasing için"e.f.P'yi" yazın. NMR işleme yazılımı verilerin işlenmesi.
7. Kimyasal yapısı NMR veri analizi bir yorumu tarafından aydınlatmak.
8. ¹³C NMR spektrumu karbon sinyalleri saymak. Yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi (HR-MS) öngörülen sonucu eşleşen moleküler formülü seçin.
9. ¹H NMR spektrumu proton sinyalleri entegre ve belgili tanımlık connectivity, karbon ve proton-tabanlı HSQC spektrumda sinyalleri üzerinde atayın.
10. Korelasyon ¹H -¹H rahat ve HMBC spektrum dayalı karbon iskeleti bağlantı atayın.
11. Kesin olmayan biçimde kimyasal yapısı yapısı mantığı²⁷tarihinde temel atayın. Geçici yapısı kimyasal yapısı veritabanlarında arama. Geçici yapısı başvurular analogları ile karşılaştırın.
12. Nükleer Overhauser etkisi spektroskopisi (NOESY) spektrum göreli yapılandırmayla atayın.
    Not: spektrometresi ve spektroskopik yöntemler üzerinde görüntülenen enantiomers kimlik özelliklerini aynı olduğundan, bazı bileşiklerin, özellikle de 2'-alkol ve 2'-NH₂, mutlak yapılandırma ile belirlenecek sahip bir derivatization reaksiyon. Derivatization reaksiyon sonra spectra üzerinde belirtilen farklılıklar çoğu bileşikler²⁸mutlak konfigürasyonlar kesin atama kolaylaştırmak.

7. EOG ve Bioassay saf bileşikler onaylamak için kokulu ve davranışsal aktif

1. 3.1-3.5 adımları yineleyin.
2. 10^-6 M - 10^-13 M 10^-3 M feromon hisse senedi çözüm % 50 metanol/su içinde belirlenen moleküler ağırlık temel-20 ° C'de depolanan gelen saf bileşiklerin 10 kat dilutions 10 mL konsantrasyonu-yanıt eğrisi için hazırlamak Adım 6.2. Sıcaklığı 8 ° C'ye equilibrate izin vermek için dolaşım bir su banyosu çalışma çözümleri, L-arginin ve saf bileşikler ile cam şişe koymak
3. 3.7-3.18 adımları yineleyin.
4. 4.1-4.2 adımları yineleyin.
5. EOG algılama eşik konsantrasyon saf kampta rasgele atanan deneysel kanal ve 5 min için 200 mL/dk Sabit fiyatla peristaltik pompa kullanarak Denetim kanalında ve aracın (% 50 metanol/deiyonize su) uygulanır.
6. 4.4-4,6 adımları yineleyin.

Sonuçlar

Bioassay-güdümlü Ayırma Protokolü içinde açıklanan adımları özetleyen bir diyagram Şekil 1' de gösterilen. Protokol yalıtmak ve yapısı, koku kudret ve davranış etkinliği 5 sözde deniz taşemen Feromonlar (Şekil 2) ile karakterize için adımları içerir. Kütle spektrometrik ve NMR veri (Şekil 3 ve Şekil 4) kullanarak, petromyzene A-B ve petromyzo...

Tartışmalar

Balık bileşiklerin henüz tespit için tam bir kimyasal dünyada yaşıyoruz. Bioassay-güdümlü ayırma belirlemek ve bu masu somon³¹, Asya filler³²ve deniz lampreys^{33gözlenen gibi birçok kimyasal etkileşimlerin arabuluculuk biyoaktif molekülleri karakterize temel kanıtlamıştır, 34,35}. Bioassay-güdümlü ayırma doğru bir şekilde izleme ve belirlemekte başlangıç ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Premium standard wall borosilicate capillaries with filament	Warner Instruments	G150F-4	recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm)
Pipette puller instrument	Narishige	PC-10	pulls electrodes for EOGs
Diamond-tipped glass cutter	Generic		cut tip of electrodes for EOG
Borosilicate glass capillaries	World Precision Instruments	1B150-4	odorant delivery tube for EOG
Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm	Warner Instruments	ESP-M15N	recording electrode holder
Reference electrode holder E Series with handle with  Ag/AgCl pellet  for glass capillary OD 1.5 mm	Warner Instruments	E45P-F15NH	reference electrode holder
1 mm pin	Warner Instruments	WC1-10	to bridge reference and recording electrode holders
2 mm pin	Warner Instruments	WC2-5	to bridge reference and recording electrode holders
Agar	Sigma	A1296	molten agar to fill electrodes
Potassium chloride (KCl)	Sigma	P9333	3M KCl to fill electrodes and electrode holders
Micropipette microfil	World Precision Instruments	MF28G-5	to fill electrodes and electrode holders
L-Arginine	Sigma	A5006	positive control odorant for EOG
Methanol	Sigma	34860
Water bath	Custom made	N/A	holds odorants for EOG
3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222)	Syndel USA	Tricaine1G	EOG anesthetic
Gallamine triethiodide	Sigma	G8134-5G	EOG paralytic
1 mL syringe	BD Biosciences	301025	to administer paralytic
Subcutaneous needle 26G 5/8	BD Biosciences	305115	to administer paralytic
Roller clamp	World Precision Instruments	14043-20	adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth
Sodium chloride (NaCl)	J.T. Baker	3624-05	for preparation of 0.9% saline
V-shaped plastic stand as specimen stage	Custom made	N/A	holds lamprey during EOG
Plastic trough	Custom made	N/A	holds V-shaped plastic stand during EOG
Scalpel Blades - #11	Fine Science Tools	10011-00	for EOG dissection
Scalpel Handle - #3	Fine Science Tools	10003-12	for EOG dissection
Straight ultra fine forceps	Fine Science Tools	11252-00	for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps
Curved ultra fine forceps	Fine Science Tools	11370-42	for EOG dissection, Moria MC40B
Straight pring Scissors	Fine Science Tools	15003-08	for EOG dissection
Stereomicroscope	Zeiss	Discovery V8	for EOG dissection
Illuminator light	Zeiss	CL 1500 ECO	for EOG dissection
Plastic tubing	Generic		to connect re-circulating EOG setup and water baths
Odorant delivery tubing	Custom made	N/A
In line filter and gasket set	Lee Company	TCFA1201035A
Micromanipulators	Narishige	MM-3	to position electrodes and odorant delivery capillary tube
Magnetic holding devices	Kanetec	MB-K
Valve driver	Arduino	custom made	to control the opening of the valve for odor stimulation
Electromagnetic valve	Lee Company	LFAA1201618H	valve for odor stimulation
NeuroLog AC/DC amplifier	Digitimer Ltd.	NL106	to increase the amplitude of the elictrical signal
NeuroLog DC pre-amplifier with headstage	Digitimer Ltd.	NL102G	to increase the amplitude of the elictrical signal
Low-pass 60 Hz filter	Digitimer Ltd.	NL125
Digitizer	Molecular Devices LLC	Axon Digidata 1440A
Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software	Molecular Devices LLC	AxoScope version 10.4
Faraday cage	Custom made	N/A	Electromagnetic noise shielding
Two-choice maze	Custom made	N/A	waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner
Trash pump	Honda	WT30XK4A	fills maze with water from nearby river
Peristaltic pump with tubing	Cole Parmer	Masterflex 07557-00	to adminster odorants in maze
Inverter Generator	Honda	EU1000i	powers perstaltic pump
Release cage	Custom made	N/A	used to acclimate lamprey in the maze
Mesh	Generic		used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers
Buckets (5 gallon)	Generic		to mix odorants
Flow meter	Marsh-McBirney	Flo-Mate 2000	to measure discharge
XAD 7 HP resin	Dow chemical	37380-43-1	for extraction of conditioned water
Methanol	Sigma	34860	for extraction of conditioned water
Water bath	Yamato	BM 200	for extraction of conditioned water
Freeze dryer	Labconco	CentriVap Concentrator	for extraction of conditioned water
chloroform	Sigma	CX1050	for isolation of fraction pools
Silica gel 70-230 mesh	Sigma	112926-00-8	for isolation of fraction pools
Silica gel 230-400 mesh	Sigma	112926-00-8	for isolation of fraction pools
Pre-coated silica gel TLC plates	Sigma	99571	for isolation of fraction pools
anisaldehyde	Sigma	A88107	for isolation of fraction pools
Sephadex LH-20	GE Healthcare	17-0090-01	for isolation of fraction pools
Amberlite XAD 7 HP resin	Sigma	XAD7HP	for extraction of conditioned water
4, 2.5L capacity glass columns	Ace Glass Inc.	5820	for extraction of conditioned water
Acetone	Sigma	650501	for extraction of conditioned water
TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent)	Waters Co.	N/A	for structure elucidation
Binary HPLC pump	Waters Co.	1525	for isolation of fraction pools/compounds
Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent)	Agilent	N/A	for structure elucidation
Rotovap drying system	Buchi	RII	for extraction of conditioned water
UV lamp (254 nm)	Spectronics Co.	ENF-240C	for thin layer chromatography