Bir yüksek-den geçerek Cre-Lox Viral membran Fusion tahlil inhibitörleri HIV-1 Viral membran füzyon tanımlamak için aktive

Özet

HIV-1 füzyon yoluyla üzerinde akış sitometresi veya floresan mikroskopi tarafından algılanabilir yeşil flüoresan proteinin ifade bildirmek için bir hücre tabanlı tahlil açıklar. İnhibitörleri (füzyon aşamada özellikle) viral girdisinin boş hücre ve hücre-hücre enfeksiyonu sistemlerinde test etmek için kullanılabilir.

Özet

Bu tahlil akış sitometresi veya floresan mikroskopi tarafından özellikle HIV-1 füzyon yoluyla üzerinde yeşil flüoresan protein (GFP) tespit ifade bildirmek için tasarlanmıştır. HIV-1 muhabir virüsü (HIV-1 Gag-iCre) matrix ve Gag polyprotein kapsid protein arasındaki HIV-1 genom içine Cre recombinase ekleyerek oluşturulur. O zaman bir hedef hücreye piyasaya Cre recombinase virüs parçacıkları, içine bir ambalaj içinde bu sonuçlar stabil bir Cre recombinase aktif kırmızı floresan protein (RFP) GFP anahtarı kaset ifade satır. Bazal durumda, sadece RFP bu kaset ifade eder. Hedef hücre içine Cre recombinase teslimini loxP siteleri tarafından çevrili RFP, excises, GFP ifadede kaynaklanan. Bu tahlil herhangi bir inhibitörleri (füzyon aşamada özellikle) viral girdisinin boş hücre ve hücre-hücre enfeksiyonu sistemlerinde test etmek için kullanılan ve bir sınıf purinergic reseptör antagonistleri, HIV-1 viral membran füzyon roman inhibitörleri tanımlamak için kullanılan.

Giriş

Roman antiretroviral tedavi ihtiyacını yüksek üretilen iş ekranları inhibitörleri HIV-1 giriş için geliştirilmesi açtı. Gag-iCre muhabir tahlil inhibitörleri viral girişinin füzyon adımda bir hücre hücre enfeksiyon sisteminde özellikle viral membran füzyon konak hücre zarının¹ile ölçerek tanımlamak için geliştirilmiştir. Bir tahlil geliştirilmiştir için özellikle HIV-1 enfeksiyonu viral membran erime noktasına kadar erken aşamalarında hareket roman inhibitörleri ekran. Yeni enfeksiyon ölçme giriş hücrelerden ayırt etmek zor bu yüzden ilk inoculum enfekte donör hücreleri ve ininfected hedef hücreleri, içerir hücre-hücre enfeksiyon ölçüm için bir meydan okuma olduğunu. İdeal sistem bir hedef hücre enfeksiyonu başlatma tarafından indüklenen Contegra gen işaret yer alacağı ve donör hücrede mevcut değil. Popüler bir viral içeriği bir viral protein-enzim fusion, bam-Vpr, dayalı tahlil karıştırma etkili, olabilir ama yüksek işlem hacmi, hücre-hücre tarama²için sınırlamalar vardır. Bu tahlil için HIV-1 Vpr erimiş, virions paketlenmiş ve hedef hücrelere viral membran fusion üzerine teslim bir beta-lactamase (BAM) muhabir gen içerir. CCF2-AM substrat hedef hücre sitoplazma yüklenir ve bir floresan değişimi bölünme üzerine geçer. CCF2-AM substrat pahalı ve yüksek üretilen iş ekranlar için engelleyici olabilir. Boya-etiket için gerekli donör ve hedef hücreleri ayırmak için hedef nüfus. Son olarak, protokol bileşikler çok sayıda test ederken ağır ve pahalı olabilir birkaç yıkama ve kuluçka adımları gerektirir.

Gag-iCre tahlil yüksek-den geçerek inhibitörleri füzyon hücre hücre iletim için eleme geliştirmek için bu sorunlara bir çözüm olarak geliştirilmiştir. Bu sistem substrat hücrelere yüklenecek gerektirmez. Tahlil boş hücre çalışmaları için de kullanılabilir ve sözde yazılı HIV-1 Gag-iCre virüs partikülleri kullanarak diğer viral füzyon çalışmalar için uyarlanabilir. HIV-1 Gag-iCre tahlil^3,4,5gibi bunlar gerçek virüs parçacıkları kullanmayın ancak HIV Env aracılı hücre-hücre füzyon deneyleri virüs Env protein aracılı hücre füzyon, ölçebilirsiniz. Bu tahlil akış sitometresi veya floresan mikroskobu ile okunabilir. FDA kütüphane yanı sıra küçük bir kütüphane purinergic inhibitörleri^1,6ekran için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Diğer Müfettişler ayrıca virüs kapsüllenmiş beta-lactamase transfer sitoplazma^7,8 içine raporlar bir adapte ve optimize edilmiş yüksek üretilen iş füzyon tahlil kullanarak HIV-1 Fusion purinergic inhibitörleri belirledik .

Gag-iCre virüs Cre recombinase matris ve kapsid, HIV-1 proteaz siteleri⁹tarafından çevrili arasında ekleme Gag-iGFP virüse benzer bir yaklaşım ile tasarlanmıştır. Cre enzim HIV-1 proteaz doğmakta olan virüs parçacık içinde aktif hale getirildiğinde olgunlaşır Gag polyprotein içinde eklenen bir habercisi olarak yapılır. Cre teslim, böylece, bir proteaz aktif HIV-1 parçacık içeriğini teslim bir hedef hücre ile bir viral membran füzyon süreci içine üzerine bağlıdır. Protokol iki sürümleri burada verilmektedir. İlk hedef hücreleri doğrudan hücre hücre iletim HIV çalışmaya, enfekte HIV-1 enfekte nüfus kullanır. Boş hücre viral bir enfeksiyon çalışma için bir boş hücre virüs ikinci sürümü kullanır. Hücreleri zaten çözdürülen pasajlı ve hücre-hücre iletim tahlil hücreleri çözdürülen günden tamamlamak için 7 gün veya 5 gün alır. Hücreleri çözdürülen pasajlı varsa ve boş hücre enfeksiyon tahlil 5 hücreleri çözdürülen gerekiyorsa, gün ve 3 gün içinde gerçekleştirilir. Ayrıca hücreye Clevers laboratuvar¹⁰tarafından oluşturulan bir plazmid kullanarak (önceden varolan RG hedef hücre kültürünü değil kullanılıyorsa) istenen bir RG (kırmızı-yeşil) hedef hücre satırı oluşturmak için verilen talimatları. Bu virüs ve virüs ifade hücreleri bu tahlil ile uygun Biyogüvenlik önlemleri alınır tavsiye edilir. Biz bu tahlil BSL2 + doku kültürü tesiste bulaşıcı bölümü kuralları. Hücreleri sabit sonra onlar standart akış sitometresi ve mikroskopi tesislerinde analiz edilebilir.

Roman, maddeler ve birleşimler için bu testin uygulama ekrana burada tarif biz HIV-1 viral membran füzyon (Şekil 1) inhibe. Pro-inflamatuar aracılar Purinergic reseptörleri vardır. Bizim Laboratuvar purinergic reseptörlerinin non-selektif inhibitörü HIV-1 viral membran füzyon⁶inhibitörleri hareket göstermiştir. Biz yüksek üretilen iş bu tahlil kullanımı yeni HIV-1 viral membran füzyon inhibitörleri tanımlayabilirsiniz raporu. Biz bir inhibitörü reseptörlerinin purinergic sınıfının HIV-1 viral membran füzyon inhibitörleri roman bir sınıfın temsil ettiğini göstermek.

Protokol

1. nesil hedef hücre hatları

Not: Bu isteğe bağlı bir adımdır; Varolan bir RG hedef hücre satırı kullanıyorsanız, vasıl adım 2 başlatın.

1. 293T hücreleri¹¹ ['Dulbecco ' nın değiştirilmiş kartal Orta (DMEM) ile % 10 fetal Sığır serum (FBS) 10 mL] pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-WPRE¹⁰ ve pCL-10A1¹² (ambalaj plazmid) ile bir % 70 konfluent 10 cm tabak içinde cotransfect bir 1:1 oran (20 µg toplam) kalsiyum tabanlı transfection¹³kullanarak.
2. Plaka medyadan 15 mL konik tüp içine pipetting ve Tüp 3000 x g 23 ° C'de herhangi bir hücre artıkları cips için 5 min için de centrifuging tarafından viral süpernatant 48 saat sonrası transfection 10 mL hasat.
3. 0,45 µm filtre için bir 10 mL şırınga iliştirin. Santrifüjü sonra tüm süpernatant al ve şırınga yük. Örnek bir temiz 15 mL tüp içine çalıştırın.
4. Aliquot filtre uygulanmış viral süpernatant uygun ölçüde içine (genellikle, 0.5-1 mL aliquots). Bu hemen sonraki adımda kullanılan veya-80 ° C'de donmuş ve depolanan.
5. 50-100 µL viral süpernatant ile bir hücre kültürünü seçtiği bir 96-şey plaka bulaştırmak için kullanın. %5 CO₂37 ° C'de hücreler kültür. RFP sinyal sürede (40 X büyütme, 532 nm uyarma, 588 nm Emisyon) Floresan mikroskop altında 24 h olarak görünür ancak en fazla 72 saat sürebilir.
   Not: Jurkat hücreleri bu deneylerde kullanılan ancak diğer türleri de kullanılabilir.
6. Select transduced hücreleri puromisindir 10 wells bir dizi kurarak ve en az 1 de bırakarak ekleyerek puromisindir her, kontrol (kullanım aralığı 0,5 µg/mL den konsantrasyonları 5 µg/ml a; hücre tipi değişir bu Mayıs) olarak tedavi edilmezse. Monitör hücre canlılığı (hücre lizis puromisindir direnç geçmeden hücrelerde ortaya çıkar) birkaç gün boyunca tedavi edilmezse denetim ve kullanım nerede yalnızca RFP ifade hücreleri hayatta puromisindir bir konsantrasyon ile karşılaştırıldığında.
   Not: transfected hücreleri hayatta iken nerede untransfected hücresi öldürdün konsantrasyon seçin.
7. Tek hücreli akış sitometresi sıralama veya sınırlayıcı bir seyreltme kullanarak (bkz: adımlar 1.8-1,10), Kültür (bu büyümeye birkaç hafta sürebilir) bir klonal hücre kültürünü geliştirmek için tek hücreler¹ den türetilmiş büyümek.
8. Seyreltme yöntemiyle, bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ve örnek yaklaşık 500 hücre/ml seyreltik.
9. 96-şey plaka medya [% 10 FBS ve %2 penisilin-Jurkat hücreleri kullanıyorsanız streptomisin, Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) Orta] hücre seyreltme 50 µL içine 50 µL pipet ve 1:1 seri dilutions 50 µL medya içeren 11 kuyu içine gerçekleştirin. En iyi sonuçlar için en az 10 çoğaltır gerçekleştirin.
10. Doku kültürü kuluçka (37 ° C % 5 CO₂ile) veya yaklaşık 4 hafta plaka mikroskobu (40 X) ile hücre büyümesini izlemek. En düşük puromisindir konsantrasyon klonal kültürler için (olarak görülen yolu ile mikroskop, 40 X) büyüme ile kültürler arasından seçim yapın.
11. Vasıl 800 x g 23 ° C'de 5 min için 20 mL (500.000 hücreler/bir hemasitometre ile sayılır mL,) kültürünün centrifuging ve % 10 DMSO ile FBS 500 µL içinde resuspending tarafından aliquots dondur. -80 ° C hücre-donma kapsayıcı'ı kullanarak yerleştirin ve sonra sıvı azot içinde saklayın.

2. hücre-için-hücre virüs iletim

1. Hedef hücrelerin hazırlanması
   1. Tezcan bir 500 µL flakon Jurkat RG muhabiri hücre 37 ° C su banyosu yerleştirerek. RPMI tam orta 10 mL flakon hücrelerden pipette ve 800 x g 23 ° C'de 5 min için karisimin santrifüj kapasitesi Pelet RPMI tam orta T-75 şişesi 20 ml resuspend. Şişeye gecede (37 ° C ve % 5 CO₂) kuluçkaya.
      Not: RPMI tam orta RPMI 1640, %10 FBS, 2 mM L-glutamin, 100 adet/mL penisilin ve 100 mg/mL streptomisin içerir.
   2. Ertesi gün, 0,5 µg/mL puromisindir (2 mg/mL stok medya 8 mL başına 1 µL) ekleyin. 200,000 – 800.000 hücre/mL ( via hemasitometre sayılır) yoğunluğu korumak hücreleri, kültür.
   3. Transfer tahlil ayarlamadan önce gün 200.000-400.000 hücre/mL aşağı hücreleri içeren 0,5 µg/mL puromisindir taze RPMI ortamda bölün.
2. Donör hücreleri hazırlanması
   1. Untransduced Jurkat hücreleri ve onları bir T-75 şişesi ile 20 mL RPMI (2.1 adımda anlatıldığı gibi) orta, 200.000 – 800.000 hücre/mL yoğunluğu tutmak tamamlamak kültür çözülme.
   2. 7,500,000 hücreleri (800 x g 5 min için) santrifüj kapasitesi ve onları 120 µL V nucleofection çözümün ek olarak resuspend (bkz. Tablo malzeme). Hücreleri bir Elektroporasyon küvet aktarmak ve Gag-iCre¹ DNA 4,5 µg ekleyin. Hücreleri transfect (Elektroporasyon tabanlı bir yaklaşım Malzemeler tablogörmek) uygun bir programı (Örneğin, S-18) kullanarak ve sonra hemen RPMI orta 3 mL aktarmak (% 10 ile FBS).
   3. Hücreleri onları gecede kuluçka tarafından 37 ° c % 5 CO₂kurtarmak izin verir.
   4. Ertesi sabah, hücreleri vasıl 800 x g 23 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi ve onları onları tahlil kurulum işlemine devam etmeden önce 37 ° C'de (%5 CO₂) kurtarmak 2 h izin RPMI tam orta 3 ml resuspend.
3. Ortak kültür
   1. Bir hemasitometre sonra spin aşağı 50.000 hücreleri (800 x g 23 ° C'de 5 min için) kullanarak hücreleri (donör ve hedef hücreleri) denetlesinler iyi saymak. 1 x 10⁶ hücre/mL RPMI puromisindir tam olarak resuspending.
   2. Bir tabak içinde 25 µL donör hücre süspansiyon, her şey için ekleyin; başka bir tabak içinde hedef hücre 25 µL ekleyin.
   3. Her şey için uygun toplama, RPMI tam ortamda bileşik testinin 25 µL seyreltilmiş ekleyin. Bileşik 30 dk için donör ve hedef hücrelerle kuluçkaya.
      Not: İlaç konsantrasyonu değişir. Bilinen bir IC₅₀varsa, bu yukarıda ve aşağıda titrating bir başlangıç noktası olarak kullanın. IC₅₀ bilinmiyorsa, bir 200 µM hisse senedi 10 µM son bir konsantrasyon için hazır olun.
   4. Önarıtma sonra diğer içine bir tabak içeriğini pipetting tarafından hedef hücreleri ile donör hücreleri birleştirmek ve bir doku kültürü kuluçka %5 CO₂37 ° C'de 40 h için hücreleri kuluçkaya.
4. Akış Sitometresi
   1. Her şey son konsantrasyonu % 2 paraformaldehyde (PFA) ekleyin.
      Not: % 16 hisse senedi için bir, bu 100 µL başına 14 µL iyi çözümdür.
   2. Dikkat: PFA maruz kalan deri ve göz için zararlıdır. Önlük, eldiven ve koruyucu gözlük ve bir emanet hood hisse senedi çözümde kolu.
   3. Akış sitometresi ile mCherry ve FITC kanallarını hücrelerdeyse okuyun.
      Not: Yukarıda arka planda enfekte hücreleri vsGFP ifade hücre % 5 – 20 görmek mümkündür. kandan hücreler.
   4. GFP sinyal GFP özel kanallarda floresans mikroskobu (40 X) ile görselleştirmek (bir uyarma filtresi 400 nm ve 508 bir emisyon filtre nm).

3. alternatif iletişim kuralı için bir boş hücre virüs enfeksiyonu

1. Hedef hücrelerin hazırlanması
   1. Tezcan bir 500 µL flakon Jurkat RG muhabiri hücre 37 ° C su banyosu yerleştirerek. RPMI tam orta 10 mL flakon hücrelerden pipette ve RPMI tam orta vasıl 800 x g 23 ° C'de 5 dakika santrifüj kapasitesi Pelet RPMI tam orta T-75 şişesi 20 ml resuspend. Şişeye gecede (37 ° C ve % 5 CO₂) kuluçkaya.
   2. Ertesi gün, 0,5 µg/mL puromisindir (2 mg/mL stok medya 8 mL başına 1 µL) ekleyin. 200,000 – 800.000 hücre/mL ( via hemasitometre sayılır) yoğunluğu korumak hücreleri, kültür.
   3. Transfer tahlil ayarlamadan önce gün 200.000-400.000 hücre/mL aşağı hücreleri içeren 0,5 µg/mL puromisindir taze RPMI ortamda bölün.
2. Bir boş hücre virüs imalatı
   1. 293T hücreler¹¹ bir % 70 konfluent 10 cm tabak transfect (DMEM 10 ml % 10 ile FBS) ile kalsiyum tabanlı transfection¹³kullanarak Gag-iCre¹ plazmid 5 µg.
      Not: Bu ölçek 10 mL yaklaşık 2-4 96-şey kaplamalar, transfection verimliliğini bağlı olarak yeterli virüs üretecek.
   2. Tüm viral süpernatant 48 h plaka medyadan 15 mL konik tüp içine pipetting ve Tüp 3000 x g tüm hücre artıkları cips 5 min için de centrifuging hasat.
   3. 0,45 µm filtre için bir 10 mL şırınga iliştirin. Santrifüjü sonra tüm süpernatant al ve şırınga yük. Örnek bir temiz 15 mL tüp içine çalıştırın.
   4. Virüsü hedef hücreleri hemen (adım 3.3) enfekte veya donma ve virüs-80 ° c (tezcan kullanmadan önce gerektiği gibi örnek) depolamak için kullanın.
3. Enfeksiyon
   1. RG Jurkat hedef hücreleri (Kimden adım 3.1.3) saymak 800 x g kuyuda başına 50.000 hedef hücre aşağı bir hemasitometre ve spin için 5 dk kullanarak, orta puromisindir olmadan tamamlamak 1 x 10⁶ hücre/mL RPMI, hücre resuspending.
   2. Bir tabak içinde her şey için 25 µL RG Jurkat hedef hücre ekle; ayrı bir tabak içinde 25 µL ekleyin (2 ng) virüs her şey için.
   3. Her şey için uygun toplama, medyada seyreltilmiş bileşik, testin 25 µL ekleyin. Hücreleri ve bileşik 30 dk için virüs kuluçkaya.
      Not: Test konsantrasyon uyuşturucu değişir. Bilinen bir IC₅₀varsa, bu yukarıda ve aşağıda titrating bir başlangıç noktası olarak kullanın. Bilinmiyorsa, 200 µM hisse senedi orta 10 µM son bir konsantrasyon için hazır olun.
   4. Önarıtma sonra virüs/bileşik mix tüm içeriği (50 µL) kuyulardan hedef hücrelere ekleme ve her şey için bir doku kültürü kuluçka %5 CO₂37 ° C'de 40 h kuluçkaya.
4. Akış Sitometresi
   1. İngiltere'de yılın son konsantrasyonu % 2 için her şey ekleyin.
      Not: % 16 hisse senedi için bir, bu 100 µL başına 14 µL iyi çözümdür.
   2. Akış sitometresi ile mCherry ve FITC kanallarını hücrelerdeyse okuyun. GFP sinyal görüntülenmeyecektir üzerinden floresans mikroskobu GFP kanallarda da olabilir.
      Not: Bir kez GFP enfekte hücreleri vsarka planda yukarıda ifade hücrelerinin % 5 – 20 görmeyi bekleyebilirsiniz. kandan hücreler.

Sonuçlar

Bulaşmamış RG Jurkat hücrelerin arka plan GFP sinyal (% 0.3) düşük düzeyde çok güçlü bir RFP sinyal ile (Şekil 2A, hastalık bulaşmamış tek sütun) sergi. Gag-iCre ile enfeksiyon HIV-1 füzyon inhibitörü AMD3100 varlığı GFP sinyal (%24,9,) bir artış nedenleri (20 µM) bulaşmamış arka plan seviyelerine (%0.34) getiren bu sinyal gelişimini engeller. Ne zaman bir inhibitörü gibi ters transkripsiyon inhibitörü AZT sonrası füzyon b...

Tartışmalar

Gag-iCre tahlil viral çoğaltma füzyon adımında inhibe ilaç adaylarının eleme için çok yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu tahlil yaparken en viral enfeksiyon deneyleri için iyi sinyal almak için en önemli adımları benzerdir. İlk kritik adım iyi kalite virüs yüksek titreleri üretiyor. Bu adımı 293T hücreleri olmasını gerektirir onlar overconfluent olmak ve birlikte yığın bu yüzden sık sık (en az 1 x her 48 h) pasajlı. Ayrıca, bazı araştırmacılar diğer lipid tabanlı reaktifler leh...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Sigma Aldrich	D5546	Media for 293 Cells
RPMI-1640	Sigma Aldrich	R0883	Media for Jurkats
Fetal Bovine Serum Albumin	Gibco	16140-071	Serum for 293 Cells
Cosmic Calf Serum	Hyclone	SH30087.03	Serum for Jurkat Cells
Hyclone Pennecillin Streptomycin solution	GE Healthcare Life sciences	SV30010	Penn/Strep used in both media
T75 Flasks	Corning	3073	Used for Culture of Jurkat Cells
10 cm Tissue Culture Plates	Corning	430167	Used for Culture of 293 Cells
96 Well Plates (tissue culture Treated)	Corning	3595	Used for fusion assay
Polyjet Transfection Reagent	Signagen	SL100688	Used to transfect 293 Cells
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma Aldrich	D8537-100ML	Used in wash steps
Hyclone Trypsin Protease	GE Healthcare Life sciences	SH30042.01	For Trypsinization of 293 cells
Amaxa Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VACA-1003	For Nucleofection of Jurkats
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare Life sciences	17144002	For Nucleofection of Jurkats
Serological Pipettes	Fisher Brand	13-678-11E	For all tissue culture
Pipettor Tips	Denville Scientific	P3020-CPS	For all tissue culture and liquid handling steps
Millex Syringe Filter (0.45 μm)	Millipore	SLHA033	For filtration of virus
BD Slip Tip Sterile syringes	BD Diagnostics	309656	For filtration of virus
Amaxa Nucleofector	Lonza	2b	for Nucleofection of Jurkats (various models available)
BD Fortessa Flow Cytometer	BD Biosciences		for flow cytometry analyss of samples
Tissue Culture Hood	Various models	Fortessa 2
pMSCV-loxp-dsRed-loxp-eGFP-Puro-W PRE	Addgene	32702	Koo BK et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods 9:81-83 (2011).
pCL10a1	Novus Bio	NBP2-29542	Naviaux, RK, Costanzi, E, Haas, M and Verma, I. The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high titer, recombinant retroviruses. Journal of Virology 70: 5701-5705 (1996)
Gag-iCre	Benjamin Chen Lab		Esposito AM et al. A high throughput Cre-lox activated viral membrane fusion assay identifies pharmacological inhibitors of HIV entry. Virology 490:6-16 (2016).