Large-scale tarımı plaka tabanlı Caenorhabditis elegans: diyabet metabolik değişiklikler çalışma için numune hazırlama

Özet

Bu iletişim kuralı bir yöntem Caenorhabditis elegans büyük ölçekli ekimi için katı medyada açıklar. Sıvı kültür alternatif, bu protokol parametreleri farklı ölçeklerde plaka tabanlı ekilen almak sağlanır. Bu sonuçlar karşılaştırılabilir sıvı ve katı Medya kültürü arasındaki morfolojik ve metabolik farklar ihmal olarak artırır.

Özet

Ağar kaplamalar üzerinde büyük ölçekli bir şekilde Caenorhabditis elegans (C. elegans) kültür zaman alıcı ve zor olabilir. Bu iletişim kuralı çok sayıda hayvan proteinleri bir western blot, kütle spektrometresi veya daha fazla proteomik analizleri ile devam etmek için yalıtım için elde etmek için basit ve ucuz bir yöntem açıklanır. Ayrıca, immunostainings nematodunun numaralarındaki artış ve aynı kodlamayla koşullar altında birden fazla analizleri entegrasyonu kolayca elde edilebilir. Ayrıca, farklı deneysel koşullar ile plakalar arasında bir transferi kolaylaştırdı. Plaka kültürde yaygın teknikleri bir platin tel kullanarak tek bir C. elegans transferini içerir ve bir neşter kullanarak nüfuslu agar transferini parçalar. Ancak, yuvarlak sayıları artan, bu tekniklerin aşırı zaman alıcı olur. Bu iletişim kuralı solucan numune hazırlama fizyolojisi üzerinde etkisini en aza indirmek için çeşitli adımlar da dahil olmak üzere C. elegans büyük ölçekli kültür açıklar. Sıvı ve yamultma stres ömrü ve böylece güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar almak için kritik adımları ayrıntılı bir açıklama gerektiren C. elegans, metabolik süreçleri değiştirebilir. C. elegans bir model organizma ilâ 1 / 3 için nöronal hücre oluşan, ama kan damarları eksik, böylece yalnızca nöronal değişiklikler vasküler kontrolünü bağımsız araştırmaya imkanı sunmaktadır. Son zamanlarda, diabetik retinopati erken ateş vasküler değişiklikler önce bulundu. Böylece, C. elegans diyabetik komplikasyonların genel mekanizmaları eğitim için özel ilgi olmasıdır. Örneğin, artan bir oluşumu glikasyondan son ürünleri (Yaş) gelişmiş ve reaktif oksijen türlerine (ROS) tekrarlanarak C. elegansiçinde bulunan görülmektedir. Örnekleri soruşturmaların daha geniş bir spektrum için yeterli büyüklükte işlemek için iletişim kuralları burada, biyokimyasal değişiklikler diyabet kaynaklı çalışmayla örneği sunulmuştur. Genel olarak, bu protokolü büyük C. elegans gerektiren çalışmalar için yararlı olabilir numaraları ve hangi sıvı kültürü uygun değildir.

Giriş

Protein analizleri, Batı leke veya kütle spektrometresi, gibi protein miligram gerektirir. Bu verim hangi sıvı kültür veya katı medya nematodlar aktarma yıkama tarafından gerçekleştirilebilir C. elegans, yüzlerce bir büyük ölçekli kültür gerektirir. Sıvı ve yamultma stres indükler ozmotik stres ile artan bir potansiyel C. elegans ömrünü değiştirme ve metabolik analizleri^{1 etkileyen sodyum alımını artırmak olabilir epitel sodyum kanalları (ENaC), ifade} . Bu nedenle, bu iletişim kuralı için plaka dayalı yaklaşım bazı kritik adımları dikkate deneysel değişkenlik etkileyen stres azaltma almak. Sıvı kültür, öte yandan, nematodlar fenotip etkiler ve kültür ve Nematodlar²tam bir sayısını topluluğu olmak zordur. Ayrıca, reaktif maddeler ortam bileşenleri tarafından değiştirilebilir ve düzensiz nematodlar ulaşmadan önce dağıtabilirsiniz. Sıvı kültür sınırlamaları ile ilgili, bu iletişim kuralı C. elegansbüyük ölçekli örnekler kültür için alternatif bir yaklaşım sağlar.

C. elegans 302 nöronal hücre, ayrı bir ağ ile bir model organizma üçte biri kadar tüm onun hücreleri³yapıyor. Bilim, birçok homolog içine yana ve orthologous genler tıbbi araştırma için bir model olarak değerini yükseltecek tarif edilmiştir. Son zamanlarda, diyabetik retinopati, vasküler hasar, önceki nörolojik bozukluğu için kanıt⁴sundu. C. elegans kan damarları eksik, ama farklı nöronal ağ, nöronal değişiklikler vasküler olanlar dışında araştırmak için uygun bir model yapım içerir. Böylece, C. elegans diyabetik komplikasyonların genel mekanizmaları eğitim için özel ilgi olmasıdır. Diyabetik komplikasyonlar içinde biyokimyasal değişiklikler daha fazla hiperglisemi⁵yanıt ROS oluşumuna etkisi yaş oluşumu dahil. Yaş C. elegans içinde bulunur ve nöronal hasar⁶için katkıda bulunmak. Kronik hastalıklar genellikle altta yatan mekanizmaları değerlendirmesi için multiparametric bir yaklaşım gerektiren karmaşık, polygenic işlemler tarafından burada diyabetik komplikasyonların değerlendirilmesi ile olarak meydana gelir. Bu iletişim kuralı birden çok parametre aynı anda, hem de daha sonra elde etmek için kullanım olabilir. Artan karşılaştırılabilir ve multiparametric bir yaklaşım tekrarlanabilirlik sıvı ve katı Medya kültürü arasındaki morfolojik ve metabolik farklar ihmal olarak elde edilebilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Not: Bu protokol beş bölüme ayrılır. Bölüm 1-3, C. elegans büyük ölçekli kültür için ana protokol sunulmuştur. Bölüm 4 ve 5 örneği metabolitleri diyabetik metabolitleri meydana gelen değerlendirilmesi için ek iletişim kuralları sağlar. Ayrıntılı olarak, Bölüm 1 tabaklarda genel bir büyük ölçekli kültür açıklar. Bölüm 3 büyük ölçekli örneği hasat açıklar, ancak bölüm 2 C. elegans, büyük miktarlarda aktarımı üzerinde duruluyor. Bölüm 4 örnek protein izolasyonu açıklar ve Bölüm 5 sonraki sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) analizleri için numune hazırlama açıklar.

1. büyük ölçekli kültür plakaları

1. Genel olarak, steril bir başlık altında veya contaminations önlemek için açık alev yanında çalışır.
2. Kültür için Genç Yetişkin sahne ulaşana kadar solucanlar bu daha önce yayımlanan Protokolü⁷ aşağıdaki uyarlamalar ile izleyin.
   1. Yaşam Escherichia coli OP50 bakteri nematodlar besleme ve deneyler için 400 µM fluorodeoxyuridine agar (değil ampisilin/FUdR) hazırlamak için kullanın.
   2. Zaman uyumlu bir nüfus hazırlanması, unconcentrated OP50 kullanın ve yetişkinler ile deneyler başarı için konsantre OP50 x %3.3 70'i süpernatant kaldırarak kullanın.
   3. Günlük beslenme aralıkları tavsiye edilir. Oksidatif stres değerlendirirken, farklı aralıkları ve beslenme için birimler sonuçları ile etkileşebilir.
   4. Aşı için bir tabak birkaç nematodlar ile alın ve bir neşter ile yaklaşık² 0.5 x 1 cm parçalara kesti. 60 mm çapında, unconcentrated OP50 içeren iki ya da üç adet nematodunun büyüme medya (NGM) plakalar üzerine aktarın.
   5. Tabak (vahşi tipi N2 kültürlü 20 ° C'de) zorlanma için uygun sıcaklıkta kuluçkaya yumurta plaka üzerinde görünür hale gelene kadar.
   6. M9 arabelleğinin 2 mL ile yumurta ve yetişkin hayvanların en kapalı yıkama ve onları bir 15 mL tüp içinde toplamak. Süspansiyon vasıl 800 x g 2 dk santrifüj kapasitesi. Bu arada, beyazlatma çözüm hazırlanmaya başlayın.
   7. Centrifuged tüpü çıkarmak ve bir 10 mL damlalıklı M9 önbellekle sökün. Yetişkin nematodlar lysed kadar beyazlatma çözüm ve mix 10 mL vortex tarih ekleyin. Bu genellikle yaklaşık 5-7 dakika sürer ama 15dk uzun almamalıdır veya yumurta tam olarak daha sonra üzerinde denemeye geliştirmek değil.
   8. Vasıl 800 x g 2 dk. yıkama çözüm beyazlatma gelen yumurta temizlemek için 3 kez 10 mL M9 arabelleği ile süspansiyon santrifüj kapasitesi.
   9. Şimdi yumurta süspansiyon 150 µL OP50 tabaklarda ekleyin. 200 – 300 yumurta yoğunluğu her tabağa erişilmesi gereken. Nematodlar yetişkin aşamaya kadar bekleyin.
      Not: görülen denemeleri için M9 (pH 7,0) arabelleği aşağıdaki maddelerden oluşur: 22 mM KH₂PO₄, 42 mM Na₂HPO₄ve 86 mM NaCl. Isıyla sonra karışımı, 1 mM MgSO4 ekleyin. Beyazlatma çözüm 0.5 M NaOH, 2.3 mM NaOCl distile suda çözülmüş içerir.
   10. Steril M9 arabellek, bir kesim ile steril pipet ipuçları ipucu solucanlar ve onları toplamak için 15 mL tüpler kapalı yıkamak için hazır olun.
   11. Yavaşça arabellek sallanan ve damlalıklı tarafından hafifçe plaka kapalı nematodlar dağıtmak, yaklaşık 1 mL M9 arabelleği tabaklarda uygulanır.
   12. Şimdi, nematodlar tüp içinde toplamak. Süspansiyon doğrudan (OP50 ile seribaşı) plakalar üzerinde 150 µL kesme pipet ipuçları ile geçerlidir ve mikroskobik nematod yoğunluğu değerlendirmek (önerilen: 60 mm plaka başına 50-100 nematodlar).
   13. Çok yoğun bir durumda, M9 arabellek ile süspansiyon sulandırmak ve istenen yoğunluğu ulaşılana kadar mikroskop altında değerlendirmek. Verim çok az ise, sakin veya süspansiyon 10 s sıvı kaldırmak için 800 x g , santrifüj kapasitesi solucan ver.
       Not: Bir örnek yeterli yoğunluğu (makroskopik) Şekil 1A ve 1B (mikroskobik) 20 X büyütme, verilir. Ampirik olarak anlatıldığı gibi devam edin.
   14. Solucanlar hızlı bir şekilde sakin unutmayın. Tabakalar arasında eşit bir dağıtım sağlamak için tabaklar (4 – 5 tabaklar) her yığın sonra tüp tersine çevirin.
       Not: Kesme hafif sallanan yanı sıra, ipucu pipet ve plakaları, yıkama kesme stresi azaltır.

2. aktarım, büyük miktarda Caenorhabditis elegans

1. Kapalı nematodlar M9 arabelleği, yaş ve kuruluk plakaların bağlı olarak yaklaşık 500 µL ile yıkayın. Aynı tampon kullanarak, çoğu hayvan süspansiyon toplanan kadar nematodlar ayırma işlemi yineleyin.
2. Yavaş yavaş nematodlar kesme pipet ucu ile kaplar ve OP50 ile hazır bir plaka üzerinde aktarmak. Kuru plaka izin.
   Not: daha fazla önerilen birim geçerli değildir dikkatli olun. Özellikle de uzun süreli deneyler, tabakları tolerans değil ve agar nematodlar çatlaklar taramaya izin zarar verebilir.

3. bir büyük hasat Caenorhabditis elegans örnek

1. Seçilen yönteme bağlı olarak, deneyler C. elegansyeterli miktarda ile başlayın. LC-MS/MS analizleri için en az 200 µg protein örnek başına verim sağlamak için Grup plaka başına yaklaşık 100 nematodlar ile başına 20 tabaklar (60 mm x 15 mm) hazırlamak.
   Not: Bu protokolün bir parçası olarak nematodlar toplanan ve dondurulmuş artık, steril koşullarda çalışma gerektirmez.
2. Örnek toplama günü, ek-toplanan örnekleri dondurma için sıvı azot hazırlayın. Non-Steril M9 arabellek Yuvarlak solucanlar'ın metabolizma yavaş buzda tut.
3. C. elegans plakalar üzerinden kapalı 1 mL M9 arabelleği uygulamak ve yavaşça dönen tabakları yıka. Bu varsa herhangi bir mevcut, bakteri ve agar sopa çünkü ölen nematodlar ve çoğu yumurta toplama önler.
4. Sesini almak ve bir 15 mL tüp transferi.
5. Tam örnek koleksiyon sonra nematodlar yerleşmek veya kısaca vasıl 800 x g tüp santrifüj kapasitesi ve M9 arabellek çoğunu kaldırmak bekleyin. Örnek 3 yıkama M9 yaklaşık 10 mL ile x (10 x numune hacmi) bakterileri kaldırmak için.
   Not: Tüm ölen nematodlar kaldırılır emin olmak için sukroz flotasyon başka bir seçenektir. Ancak, bu görüntülenen deneyler¹⁵için uygun değildi. Sükroz glikoz ve fruktoz hidrolize. Görülen denemelerinde glikoz rolü kronik diyabet bulundu biyokimyasal değişiklikler tanıtmak için değerlendirildi. Böylece, sukroz flotasyon potansiyel sonuçları yıkmak.
6. M9 arabelleği 1 mL ile bir 1,5 mL tüp ve bir boş 1,5 mL tüp her örnek için hazır olun. Pelet cam damlalıklı ile 15 mL tüp sizden boş 1,5 mL tüp aktarın. Kantitatif tayin emin olmak çok önemli bir adımdır.
   Not: Aksine önceki adımları sırasında burada nematodlar daha yoğun. Bir olası bağlılığı nedeniyle plastik damlalıklı ipuçları, örnek büyük bir kısmı kaybı bekleniyor. Bu nedenle, Cam pipetler kullanın.
7. Aktarımdan sonra Cam Pipet pipet duvarından nematodlar durulama için 1 mL M9 arabelleği ikinci 1,5 mL tüp almak için kullanın. Ayrıca, 15 mL tüp kalan nematodlar yıkayın ve örnek tüp aktarabilirsiniz.
8. 19.000 x g 1 dk. için de örnek tüp santrifüj kapasitesi ve mümkün olduğu kadar süpernatant kaldır.
9. Mühür tüp Parafilm ve hemen ek-bu sıvı azot kıpırdama. Tüp-80 ° C'de lysate hazırlık kadar saklayın.

4. protein yalıtım için kütle spektrometresi

Not: burada açıklanan protein yalıtım diğer deneyleri (Örneğin, Batı leke) için kullanılabilir.

1. Donmuş örnek için 0,5 mm Zirkonyum oksit boncuk ve en az 2 lysate arabellek İndinavir inhibitörü kokteyl içeren hacmi x aynı miktarda ekleyin.
   Not: 100 µL arabelleği kullanarak görülen nematodlar protein korelasyon analizleri yapıldı. LC-MS/MS örnekleri arabellek 200 µL ile lysed.
2. 1 dk. için homogenizer hız 9 başlatın. Örnekleri tamamen lysed emin olun. Değil tamamen lysed Eğer bu adımı yineleyin.
3. Örnekleri için 19.000 x gde 4 ° C'de 30 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant için yeni bir tüp buza aktarın ve daha fazla ölçümleri alınması olacak kadar-80 ° C'de depolayın.
   Not: sigara denaturing arabellek görülen denemeleri için kullanılan aşağıdaki maddelerden oluşur: 20 mM Tris HCl (pH 8), 137 mM NaCl, %1 Triton-X ve 2 mM EDTA.
   Not: Bu protokol ve önerilen ölçeği uygulanmış adımları takip sonra yaklaşık 1.000 nematodlar üzerinden bir protein Pelet verimi yaklaşık 500 µg olmalıdır. Daha fazla karşılaştırmalar için Temsilcisi sonuçlarıve Şekil 2 bakın.

5. numune hazırlama sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi ölçümler için

Not: numune hazırlama faiz parametre bağlı olarak farklı olacaktır. Bu iletişim kuralı methylglyoxal ve yaş belirlenmesi üzerinde duruluyor.

1. Hücre içi methylglyoxal derivatization 1,2-diaminobenzene (DB) ile tarafından yukarıda açıklanan⁹olarak ölçmek.
   1. 20 µL buz gibi %20 (wt/vol) trichloroacetic asit (wt/vol) % 0,9 sodyum klorür ve su 1,5 mL tüp içinde 80 µL örnekleriyle lunaparkçı.
   2. Dahili standart ile 5 µL örnekleri spike (¹³C₃-MG; 400 nM), vortexing tarafından mix onları ve sonra onları 21.000 x g 4 ° C'de 5 min için de santrifüj kapasitesi
   3. 35 µL süpernatant ile 200 µL cam INSERT içeren HPLC örnek şişe aktarın.
   4. 0.5 mm DB 200 mM HCl içeren 0,5 mM diethylenetriaminepentaacetic asit (DETAPAC) suda 10 µL ardından her örnek için %3 Sodyum azid (wt/vol) 5 µL ekleyin.
   5. Örnekleri ışıktan korunan oda sıcaklığında 4 h için kuluçkaya.
   6. Örnekleri tarafından LC-MS/MS, yukarıda açıklanan⁹olarak analiz.
      Not: Yaş ölçüm için Protokolü'nün 4 bölümde açıklandığı gibi proteinler izole et.
2. Bir Bradford tahlil¹⁰kullanarak (çözülmüş) lysates protein konsantrasyonu ölçmek.
   1. 30 µL aliquots Sığır serum fosfat tamponlu salin aşağıdaki konsantrasyon (PBS) çözüldü albumin (BSA) ile çivili bir standart eğri hazırlamak: 0; 0,1; 0.2; 0.3; 0,4; 0,6; 0,8; ve 1.0 mg/dL.
      Not: örnek Önerilen boyutta hazır (bkz. Adım 4.1 lysate hazırlanması ile 200 µL arabelleği için), tahmini konsantrasyonu yaklaşık 2-7 mg/mL aralığında olmalıdır. Bu durumda, örnek 1:10 PBS ile ölçüm önce oranında seyreltin.
      Not: Bu yöntemi kullanarak ilk deneyler için farklı dilutions örneklerinde ölçmek için önerilir (1, 1:10 ve 1: 100). Nematod sayısı tam yok belirlenmesi gibi verim bireysel araştırmacılar arasında farklı olabilir.
   2. Şeffaf bir 96-şey plaka (Polistiren) kullanın ve 10 µL her standart konsantrasyon ve çoğaltmaları Wells içinde seçilen dilutions örneklerinde pipet.
   3. Protein tahlil boya reaktifi konsantre 1:5 (aq. distile suyla seyreltik dest.) ve her örnek plaka üzerinde seyreltme 200 µL ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika plaka kuluçkaya.
   4. 595, 30 dk içinde absorbans ölçmek nm bir plaka okuyucu ile. Örnekler hesaplanan standart eğri değiştirilmiş. Daha tafsilât-in belgili tanımlık yöntem kapsamlı edebiyat¹⁰' anlatmıştık.
3. Yukarıda açıklanan^11,12olarak hücre içi çağlar ölçmek.
   1. Toplam proteini özleri (yaklaşık 200 µg) yıkama ultrasantrifüj 10 kDa santrifüj filtre birimleri tarafından su ile 3 x.
   2. 100 mm HCl 10 µL, pepsin (2 mg/mL 20 mM HCl) 10 µL ve thymol (2 mg/mL 20 mM HCl) 10 µL kurtarılan protein (yaklaşık 100 µL) ekleyin ve örnekleri için 24 h 37 ° C'de kuluçkaya.
   3. Etkisiz hale getirmek ve 0,5 M potasyum fosfat tampon (pH 7,4) 12.5 µL ekleyerek pH 7.4 örnekleri tampon ve 260 mm KOH 5 µL.
   4. Pronase e [10 mM potasyum fosfat tampon (pH 7,4) 2 mg/mL] 10 µL ekleyin ve bir penisilin-streptomisin çözümün 10 µL ve örnekleri için 24 h 37 ° C'de kuluçkaya.
   5. Aminopeptidaz [10 mM potasyum fosfat tampon (pH 7,4) 2 mg/mL] 10 µL ekleyin ve prolidase [10 mM potasyum fosfat tampon (pH 7,4) 2 mg/mL], 10 µL ve örnekleri için 48 h 37 ° C'de kuluçkaya.
   6. LC-MS/MS tarafından elde edilen hidrolizat yukarıda açıklanan¹²olarak analiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Diyabet araştırma uygulamalarda sunulan için burada, büyük ölçekli C. elegans oluşturma örnekleri kültür. Bu ilgi için tek bir hayvan parametreleri ilişkilendirmek yerine toplam protein konsantrasyonu normalize etmek olabilir. Nematodlar az sayıda gerektiren bir tahlil, bu kolayca nematodlar sayarak gerçekleştirilebilir. İçin büyük ölçekli C. elegans nematodlar deney grubu başına yüzlerce içeren kültür, bu yaklaşım hiç hoş değil.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu iletişim kuralı büyük ölçekli sayısal sonuçlar elde etmek için C. elegans kültür için güvenilir bir yaklaşım sunuyor. Literatür bulguları Temsilcisi sonuçlarıgösterildiği gibi çoğaltılmış. Bu iletişim kuralı C. elegans büyük ölçekli örnekler topluluğu için bir düz ileri yöntem gibi görünüyor olsa da, dikkate almak için bazı tuzaklar vardır. Nematodunun nüfus eşitleme ile ilgili, bu iletişim kuralı nematodlar yok ve sadece yumurta hasat s...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
E. coli OP50	CGC	n/a
C. elegans N2	CGC	n/a
C. elegans CL2166	CGC	n/a
Petri dish, 60 mm x 15 mm	Greiner One	628161
Volumetric pipet, glas, 10 mL	Neolab	E-0413
Proteinase inhibitor cocktail tablets	Roche	04693124001
Non-denaturing lysate buffer:
Tris-HCl, pH 8	Sigma	T3253
Sodiumchloride (NaCl)	Sigma	S7653
Triton X-100	Sigma	X-100
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E5391
96-well plates, transparent bottom	Brand	781611
Infinite M200, plate reader	Tecan	30017581
Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm	Next advance	ZROB05-RNA
Bullet Blender, homogenizer	Next advance	BBX24
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma	P6887
Thymol	Sigma	T0501
Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus	Sigma	P6911
Penicillin-Streptomycin solution	Sigma	P43339
Prolidase from Porcine Kidney	Sigma	P6675
Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica	Sigma	A8200
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Merckmillipore	UFC501096
Basic Materials for plate culture are described in Reference 6.